Antineutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCA) bei steril-eitriger Meningitis-Arteriitis (SRMA) des Hundes
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Elisabeth Albers
aus Bad Laer
Hannover 2001
Wissenschaftliche Betreuung: Fr. Univ.-Prof. Dr. A. Tipold
1. Gutachter: Fr. Univ.-Prof. Dr. A. Tipold 2. Gutachter: Hr. PD Dr. A. Gruber
Tag der mündlichen Prüfung: 22.11.2001
Teile der vorliegenden Dissertation wurden bereits auf folgender Tagung vorgestellt:
Albers, E., A. Tipold (2001):
"Antineutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCA) bei steril-eitriger Meningitis-Arteriitis (SRMA) des Hundes"
Vortrag auf der 10. Jahrestagung der Fachgruppe "Innere Medizin und Klinische Laboratoriumsdiagnostik", Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft e.V. (DVG) 15. - 17. Februar in München
Meinen Eltern
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 13
2. LITERATURÜBERSICHT 15
2.1 Steril-eitrige Meningitis-Arteriitis 15
2.1.1 Klinik 15
2.1.2 Pathologie und Histologie 17
2.1.3 Pathogenese 18
2.2 Autoantikörper beim Hund 20
2.3 Neutrophile Granulozyten 21
2.4 Antineutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCA) 24
2.4.1 Antikörper gegen Proteinase 3 28
2.4.2 Antikörper gegen Myeloperoxidase 30
2.5 ANCA-assoziierte Vaskulitiden beim Menschen 31
2.5.1 Wegeners Granulomatose 32
2.5.2 Kawasaki-Syndrom 33
2.6 Nachweisverfahren von ANCA 34
2.6.1 Immunfluoreszenz 34
2.6.2 Durchflusszytometrie 35
2.6.3 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 36
3. MATERIAL UND METHODEN 37
3.1 Geräte und Materialien 37
3.2 Chemikalien und Reagenzien 38
3.3 Medien, Puffer und Lösungen 39
3.4 Untersuchungsmaterial 40
3.4.1 Hunde mit SRMA 405
3.4.2 Hunde mit weiteren Erkrankungen 41
3.4.3 Kontrollgruppe 41
3.5 Untersuchungsmethoden 42
3.5.1 Gewinnung des Serums 42
3.5.2 Gewinnung des Liquor cerebrospinalis 42
3.6 ELISA 42
3.6.1 Vorversuche 43
3.6.2 Durchführung 43
3.6.3 Auswertung 44
3.7 Durchflusszytometrie 46
3.7.1 Testdurchführung 47
3.7.1.1 Isolierung der neutrophilen Granulozyten 47 3.7.1.2 Ansatz 1: Permeabilisierung der neutrophilen Granulozyten 48 3.7.1.2.1 Permeabilisierung mit Saponin 48 3.7.1.2.2 Permeabilisierung mit FACS Permeabilizing Solution 54 3.7.1.2.3 Permeabilisierung mit Tween 20 54 3.7.1.3 Ansatz 2: Apoptose der neutrophilen Granulozyten 55
3.7.2 Auswertung 56
3.8 Indirekte Immunfluoreszenz 57
3.8.1 Versuchsdurchführung 57
3.8.2 Auswertung 58
3.9 ELISA zur Messung von IgA 59
3.9.1 Durchführung des ELISA 59
3.10 Methode der statistischen Verfahren 60
3.10.1 Parameter zur Bewertung diagnostischer Verfahren 61
4. ERGEBNISSE 62
4.1 ELISA 62
4.1.1 Vorversuche 62
4.1.2 Ergebnisse 64
4.1.2.1 Serum- und Liquorproben von Hunden mit SRMA 64 4.1.2.2 Serum- und Liquorproben von Hunden mit weiteren Erkrankungen 65 4.1.2.3 Serum- und Liquorproben von Hunden der Kontrollgruppe 69
4.1.2.4 Gesamtübersicht 70
4.1.3 Geschlechtsdisposition 72
4.1.3.1 Gesamtpopulation 73
4.1.3.2 Hunde mit SRMA 74
4.1.3.3 Hunde mit weiteren Erkrankungen 76
4.1.3.4 Hunde der Kontrollgruppe 78
4.1.4 Rassendisposition 80
4.1.5 Altersdisposition 82
4.1.6 IgA-Konzentrationen 85
4.1.6.1 IgA-Konzentrationen im Serum 85
4.1.6.2 IgA-Konzentrationen im Liquor cerebrospinalis 85
4.1.7 Verlaufsdarstellung 86
4.1.7.1 Berechnung der Korrelation innerhalb des Krankheitsverlaufs 89
4.1.8 Korrelation der Einzelergebnisse 92
4.1.9 Interassay-Varianz 93
4.1.9.1 Interassay-Varianz des PR3-ANCA-ELISA 93 4.1.9.2 Interassay-Varianz des MPO-ANCA-ELISA 94
4.1.10 Sensitivität und Spezifität 94
4.2 Indirekte Immunfluoreszenz 95
4.3 Durchflusszytometrie 97
4.3.1 Vorversuche 97
4.3.2 Permeabilisierte neutrophile Granulozyten 99 4.3.3 Apoptotische neutrophile Granulozyten 101
5. DISKUSSION 104
5.1 Methode und Resultate der Durchflusszytometrie 104 5.2 Methode und Resultate der indirekten Immunfluoreszenz 105
5.3 Methode und Resultate der ELISA 106
5.3.1 Methode der ELISA 106
5.3.2 Resultate der ELISA 108
5.3.3 Vergleich des IgA-Spiegels und der Anzahl neutrophiler Granulozyten mit den Ergebnissen der ELISA zur Messung von ANCA bei 15
Patienten im Rahmen einer Verlaufsuntersuchung 116 5.3.4 Wirkung der Glukokortikosteroidtherapie 117
5.4 Pathogenese der SRMA 119
6. ZUSAMMENFASSUNG 123
7. SUMMARY 125
8. LITERATURVERZEICHNIS 127
9. ANHANG 143
9.1 Tabellen 143
Tab. 9.1: Übersicht über die untersuchten Rassen 143 Tab. 9.2: ELISA-Ergebnisse der untersuchten Hunde mit SRMA 145 Tab. 9.3: ELISA-Ergebnisse der untersuchten Hunde der Kontrollgruppe 148
9.2 Tabellenverzeichnis 151
9.3 Abbildungsverzeichnis 153
10. DANKSAGUNG 155
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
°C Grad Celsius
Abb. Abbildung
ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (Antikörper- abhängige zelluläre Zytotoxizität)
AECA Antiendothelial cell autoantibody (Antikörper gegen Endothelzellen)
Ak Antikörper
Aqua dest. Aqua destillata
ANA Antinukleäre Antikörper
ANCA antineutrophil cytoplasmatic antibodies, antineutrophile zytoplasmatische Antikörper
BPI bactericidal / permeability increasing Protein BSH Berner Sennenhund
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CD Cluster of differentiation
CINC Cytokin-induced chemoattractants
CSF Cerebrospinal fluid, Liquor cerebrospinalis DSH Deutscher Schäferhund
EKG Elektrokardiogramm
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbant Assay et al. et alii (und andere)
Fa. Firma
FACS Fluorescence-Activated Cell Sorter FITC Fluoreszeinisothiocyanat
FL1-H Fluoreszenz 1, Grünfluoreszenz FL2-H Fluoreszenz 2, Orangefluoreszenz FSC forward light scatter, Vorwärtsstreulicht g Erdbeschleunigungskonstante; g=9,81 m/s2 G-CSF Granulocyte colony-stimulating factor
GME Granulomatöse Meningoenzephalomyelitis
HMG high-mobility-group nonhistone chromosomal proteins HLE human leukocyte elastase
HUVEC human umbilical vein endothelial cells (Zellen der humanen Vena umbilicalis)
H20 Wasser
ICAM intercellular cell adhesion molecule IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IIF Indirekte Immunfluoreszenz
IL Interleukin
IP3 1,4,5-Inositol-Triphosphat
ITAM immunreceptor tyrosine based activation motif (Tyrosin-Aktivierungsmotiv)
KH Krankheit
MCP-1 monocyte chemoattractant protein-1 MIF-Puffer Membranimmunfluoreszenz-Puffer n Anzahl, Menge
NADPH Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat nm Nanometer
Nr. Nummer
OD Optische Dichte
min Minuten
mk männlich kastriert
Mon. Monate
OPD o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid
PECAM platelet endothelial cell adhesion molecule
PBS Phosphate Buffered Saline, phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH Potentia hydrogenii
PMN polymorphkernige neutrophile Granulozyten PTU Propylthiouracil
r Produktmoment- Korrelationskoeffizient nach Pearson ROI reactive oxygen intermediates
R-PE R-Phycoerythrin SD Standardabweichung
sec Sekunden
SRMA steroid-responsive meningitis-arteritis, steril-eitrige Meningitis-Arteriitis
SSC side scatter, Seitwärtsstreulicht Tab. Tabelle
TMB 3,3',5,5' Tetramethylbenzidin TNF-alpha Tumornekrosefaktor alpha u.a. unter anderem
UV ultraviolettes Licht
VCAM-1 vascular cell adhesion molecule-1 VK Variationskoeffizient
wk weiblich kastriert
ZNS Zentrales Nervensystem
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1. EINLEITUNG
Die steril-eitrige Meningitis-Arteriitis (steroid responsive meningitis-arteritis (SRMA)) ist eine weltweit auftretende, sehr schmerzhafte Erkrankung der Meningen beim Hund.
Bei der akuten oder klassischen Form der Erkrankung zeigen die Tiere Symptome einer Meningitis, wie Fieber, Steifheit und hochgradige Schmerzhaftigkeit im Nackenbereich. Im Serum und Liquor cerebrospinalis lässt sich eine hochgradige neutrophile Pleozytose nachweisen. Die protrahierte oder chronische Verlaufsform äußert sich zusätzlich in vermehrt auftretenden neurologischen Ausfällen. Im Liquor cerebrospinalis treten dabei vor allem monomorphkernige Zellen auf.
Kennzeichnend für beide Formen der SRMA ist der intrathekale und systemische Nachweis von erhöhten IgA-Werten, die medikamentös nicht zu beeinflussen sind.
Die histologische Untersuchung des zentralen Nervensystems (ZNS) zeigt eine hochgradige, eitrige Meningitis, aber auch eine nekrotisierende Vaskulitis im Bereich der spinalen Meningen mit einer hochgradigen Invasion von Entzündungszellen. In einigen Fällen betreffen die Gefäßveränderungen auch Koronar- und Mediastinalarterien.
SRMA kann bei allen Rassen auftreten, es besteht jedoch eine Prädisposition für Berner Sennenhunde, Beagle und Boxer. Betroffen sind vor allem junge, adulte Hunde im Alter von acht bis 18 Monaten, die Krankheit wird aber auch bei Hunden anderer Altersgruppen beobachtet. Eine Geschlechtsdisposition besteht nicht.
Die Pathogenese dieser Erkrankung ist noch weitgehend ungeklärt. Als Ursache der SRMA wird ein noch unbekannter Faktor vermutet, der eine Dysregulation des Immunsystems auslöst. Eine erhöhte systemische und intrathekale IgA-Synthese scheint im Mittelpunkt dieser Dysregulation zu stehen. Durch die hochgradige neutrophile Pleozytose im Liquor cerebrospinalis in der akuten Phase der Erkrankung kann das Gewebe durch Freisetzung toxischer Mediatoren und lysosomaler Proteine dieser Entzündungszellen geschädigt werden. Eine mögliche Ursache der Freisetzung toxischer Mediatoren ist die Bindung von antizytoplasmatischen Antikörpern an neutrophile Granulozyten.
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Es wird bei einigen immunbedingten Vaskulitiden des Menschen vermutet, dass antineutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCA), dazu zählen Antikörper gegen Myeloperoxidase (MPO) und Proteinase 3 (PR3), eine wichtige Rolle in der Pathogenese spielen. Zu diesen ANCA-assoziierten Vaskulitiden gehören Erkrankungen wie die Wegeners Granulomatose oder das Kawasaki-Syndrom. Auch hier ist die Pathogenese noch weitgehend ungeklärt. Im pathologisch-histologischen Bild gibt es deutliche Übereinstimmungen mit der SRMA, daher gilt diese als anerkanntes Tiermodell für humane Vaskulitiden unbekannter Genese.
Ziel dieser Arbeit war es daher, ein Testsystem zu entwickeln, mit dem ANCA im Serum und im Liquor cerebrospinalis des Hundes gemessen werden können. Dazu sollte ein ELISA zum Nachweis von humanen Antikörpern gegen PR3 und MPO für den Hund modifiziert und die gewonnenen Ergebnisse mit Hilfe von zwei anderen Nachweisverfahren wie die indirekte Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie überprüft werden.
In einem zweiten Schritt sollte die pathogenetische Bedeutung der Autoantikörper für die Entstehung von SRMA, die Möglichkeit der Frühdiagnostik von Rezidiven mit Hilfe der routinemäßigen Messung von ANCA und die prognostische Bedeutung geklärt werden.
Für die Studie standen an SRMA erkrankte Hunde im Vergleich zu gesunden und Hunden mit anderen neurologischen Erkrankungen sowie Verlaufsuntersuchungen zur Verfügung.
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2. LITERATURÜBERSICHT
2.1 Steril-eitrige Meningitis-Arteriitis
2.1.1 Klinik
Die steril-eitrige Meningitis-Arteriitis des Hundes, im englischen Sprachgebrauch als
"steroid-responsive meningitis-arteritis" (SRMA) bezeichnet, ist eine hochgradige eitrige Meningitis und nekrotisierende Vaskulitis im Bereich der spinalen Meningen, die sich in typischen Meningitis-Symptomen äußert. Kennzeichnend für die Erkrankung sind sowohl ein Anstieg der intrathekalen und systemischen IgA-Werte als auch eine hochgradige Infiltration mit neutrophilen Granulozyten im Liquor cerebrospinalis mit Zellzahlen von mehreren tausend Zellen pro Mikroliter Liquor cerebrospinalis [TIPOLD u. JAGGY, 1994a].
Neben der Staupe, der granulomatösen Meningoenzephalomyelitis (GME) und der Infektion mit Protozoen ist die SRMA die häufigste entzündliche Erkrankung im Zentralnervensystem (ZNS) und tritt weltweit auf [TIPOLD, 1997].
Die SRMA ist identisch mit Erkrankungen, die unter Begriffen wie Polyarteriitis beim Beagle [HARCOURT, 1978], nekrotisierende Vaskulitis beim Berner Sennenhund [MERIC et al., 1986] oder Beagle [SCOTT-MONCRIEFF et al., 1992], Beagle-Pain- Syndrome [HAYES et al., 1989], canines Schmerzsyndrom [BURNS et al., 1991] und canines juveniles Polyarteritiis-Syndrom [FELSBURG et al., 1992] beschrieben wurden.
Es kann jede Rasse erkranken, aber es besteht eine Rassenprädisposition für Beagle [RUBEN et al., 1989], Boxer und Berner Sennenhunde [NIEDERHAUSER et al., 1986]. Eine Geschlechtsprädisposition besteht nicht [TIPOLD u. JAGGY, 1994a]. Die Krankheit kann in jedem Alter auftreten, die Symptome finden sich jedoch am häufigsten bei Tieren im Alter von acht bis 18 Monaten [TIPOLD u. JAGGY, 1994a].
Mehrfach wurden gehäuft auftretende SRMA-Erkrankungen bei Hunden mit engen verwandtschaftlichen Beziehungen beobachtet. Deshalb wird von einigen Autoren eine genetisch determinierte Disposition für SRMA vermutet [MERIC et al., 1986;
SCOTT-MONCRIEFF et al., 1992; PONCELET u. BALLIGAND, 1993].
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Die SRMA tritt in zwei Formen auf. Dazu zählen die akute Form und die atypische, protrahierte oder chronische Form.
Bei der akuten Form der SRMA treten typische Meningitis-Symptome wie eine steife Kopf-Halshaltung, hochgradige Schmerzhaftigkeit, Apathie und Fieber auf [RUSSO et al., 1983; MERIC et al., 1985]. Die atypische, protrahierte Form zeichnet sich zudem häufig durch neurologische Defizite im Sinne einer Rückenmarksläsion aus [TIPOLD, 1994b].
Im Liquor cerebrospinalis tritt bei einem akuten Verlauf eine hochgradige neutrophile Pleozytose, ein gering- bis mittelgradiger Anstieg des Proteingehaltes [RUSSO et al., 1983; PRESTHUS, 1991] und eine Erhöhung des intrathekalen IgA- Wertes auf. Bei der protrahierten Form der Erkrankung treten überwiegend monomorphkernige Zellen wie Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen auf.
Häufig fehlen jedoch die typischen Zellzahlerhöhungen im Liquor cerebrospinalis.
Der Protein- und IgA-Gehalt bleiben unverändert hoch [TIPOLD u. JAGGY, 1994a].
Die Untersuchung des Blutes zeigt bei der akuten Form eine Neutrophilie mit Linksverschiebung, eine beschleunigte Senkung der Erythrozyten [MERIC et al., 1985] und - wie im Liquor cerebrospinalis - einen Anstieg des IgA- Gehaltes. Bei der protrahierten Verlaufsform bleibt der IgA-Gehalt erhöht, die übrigen Werte der Blutuntersuchung liegen in den meisten Fällen innerhalb des Referenzbereiches [TIPOLD u. JAGGY, 1994a].
Eine Therapie mit Antibiotika hat keinen positiven Effekt auf den Krankheitsverlauf [RUSSO et al., 1983]. Die Therapie mit Glukokortikosteroiden wie Prednisolon verbessert den Krankheitszustand in den meisten Fällen innerhalb mehrerer Stunden drastisch [PONCELET u. BALLIGAND, 1993; CIZINAUSKAS et al., 2000]. Die Therapie wird unter regelmäßigen Kontrolluntersuchungen des Liquor cerebrospinalis über einen ungefähren Zeitraum von sechs Monaten durchgeführt.
Die Glukokortikosteroiddosis wird dabei den jeweiligen Untersuchungsbefunden angepasst und bei gutem Krankheitsverlauf schrittweise reduziert [CIZINAUSKAS et al., 2000; TIPOLD, 1997]. Auch die zusätzliche oder alternierend jeden zweiten Tag eingesetzte Applikation von immunsuppressiven Medikamenten wie dem Purinanalog Azathioprin zeigt gute Therapieerfolge [TIPOLD, 1997].
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Für die erkrankten Hunde besteht bei frühzeitiger Diagnose und Therapie eine gute Prognose für Überleben und vollständige Heilung [MERIC et al., 1985]. Bei älteren Tieren mit hohem IgA-Spiegel im Liquor cerebrospinalis und häufigeren Rezidiven ist die Prognose weniger günstig [CIZINAUSKAS et al., 2000].
Zu den möglichen Differentialdiagnosen zählen bakteriell, viral, protozoär oder mykotisch bedingte Enzephalitiden und die granulomatöse Meningoenzephalomyelitis. Auch Diskospondylitis, Polyarthritis und eine immunvermittelte Polymyositis können im klinischen Bild der SRMA ähneln. Zu den möglichen Differentialdiagnosen zählen weiterhin degenerative Veränderungen wie der Diskusprolaps.
2.1.2 Pathologie und Histologie
Bei der histologischen Untersuchung akut erkrankter Tiere zeigt sich eine eitrige Meningitis, die alle Regionen der Meningen betreffen kann, vor allem aber im zervikalen Bereich sehr ausgeprägt ist. In einigen Fällen betreffen die Gefäßveränderungen auch Koronar- und Mediastinalarterien.
Bei der akuten Verlaufsform treten in mittelgroßen bis großen Arteriolen und kleinen Arterien Schwellungen der Endothelzellen, Schwellung der Nuklei der Zellen der Tunica muscularis und eine hyaline Degeneration auf [TIPOLD et al., 1995].
Die Periarteriitis ist gekennzeichnet durch eine Invasion neutrophiler Granulozyten und monomorphkerniger Zellen. In den Gefäßen können Ablagerungen von fibrinoidem Material in der Adventitia und Media beobachtet werden [HOFF u. VANDEVELDE, 1981; SPENCER, 1987]. Die Ruptur der geschädigten Gefäße kann zu meningealen Hämorrhagien führen. Im umliegenden Gewebe selbst findet eine Invasion von Makrophagen, Plasmazellen, Lymphozyten und polymorphonukleären Zellen statt [HARCOURT, 1978; HAYES et al., 1989]. Eine Ablagerung von Immunglobulinen und Immunkomplexen ist in diesem Stadium nicht nachweisbar [TIPOLD et al., 1995].
Im Bereich der meningealen Läsionen und perivaskulären Infiltraten treten
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hauptsächlich B-Lymphozyten auf. In den entzündeten Arterien sind als Lymphozytenpopulation ausschließlich T-Lymphozyten vorhanden [TIPOLD et al., 1999].
Bei chronisch erkrankten Hunden besteht eine geringere Infiltration der Meningealarterien mit Entzündungszellen als bei der akuten Form. Im Serum sind bei einigen Hunden zirkulierende IgG-Immunkomplexe nachweisbar. Die Arterienwände im Bereich der Leptomeninx sind fibrös verdickt und fokal kalzifiziert. Zelluläre Proliferation in der Gefäßwand und Fibrosierung der Intima führt bis zur Stenose der Gefäße [TIPOLD et al., 1995]. In einigen Fällen wird infolge Behinderung des Abflusses des Liquor cerebrospinalis ein Hydrozephalus beobachtet [TIPOLD u. JAGGY, 1994a]. Im Bereich des Rückenmarks entstehen zum Teil milde multifokale axonale Degeneration, fokale neuronale Degeneration und geringgradige Gliose [RUSSO et al., 1983].
2.1.3 Pathogenese
Die Pathogenese ist noch weitgehend ungeklärt. Weder Infektionserreger [RUSSO et al., 1983; MERIC et al., 1985; PRESTHUS, 1989] noch Immunkomplexablagerungen in den Blutgefäßen [HARCOURT, 1978;
SCOTT-MONCRIEFF et al., 1992; TIPOLD et al., 1995] konnten bis jetzt bei erkrankten Hunden eindeutig als Auslöser der Erkrankung identifiziert werden.
Aufgrund dieser Tatsache und der guten Therapieerfolge bei Behandlung mit Glukokortikosteroiden wird ein immunpathologischer Mechanismus vermutet [RUSSO et al., 1983; MERIC et al., 1985; FELSBURG et al., 1992]. Der Nachweis aktivierter T-Lymphozyten deutet auf einen eventuellen Antigen-Kontakt [TIPOLD, 2000a]. Auch ein Einfluss von Superantigenen auf die Pathogenese ist möglich [TIPOLD, 1996].
Kennzeichnend für die SRMA sind intrathekal und systemisch erhöhte IgA-Werte, die sowohl bei der akuten als auch bei der protrahierten Form der Erkrankung auftreten [TIPOLD u. JAGGY, 1994a]. Eine Erhöhung des IgA-Wertes im Liquor cerebrospinalis kann bei allen entzündlichen Veränderungen im ZNS auftreten,
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allerdings ist nur bei SRMA-erkrankten Tieren auch der Nachweis eines gleichzeitigen Anstieges im Serum möglich [TIPOLD, 1997]. Die Funktion von IgA im ZNS ist bis jetzt noch nicht geklärt. Die erhöhte IgA-Produktion bei den an SRMA erkrankten Hunden wird möglicherweise durch ein infektiöses Agens verursacht, das jedoch noch nicht isoliert werden konnte.
Die Invasion von polymorphkernigen Zellen in den Meningealraum wird durch die intrathekale Freisetzung von Interleukin-8 und wahrscheinlich auch anderen chemotaktischen Faktoren wie C5a begünstigt. Die chemotaktische Aktivität ist keine Begleiterscheinung des Entzündungsprozesses, sondern ursächlich an der Einwanderung von Entzündungszellen beteiligt [BURGENER et al., 1998]. IL-8 zeigt eine chemotaktische Wirkung auf neutrophile Granulozyten und zum Teil auf T- Lymphozyten. Die chemotaktische Aktivität für polymorphkernige neutrophile Granulozyten korreliert positiv sowohl mit der Höhe des IgA-Wertes, als auch mit dem IL-8-Gehalt im Liquor cerebrospinalis [BURGENER et al., 1998].
Vor allem Hunde mit Rezidiven und mit konstant erhöhter Zellzahl und erhöhtem IgA- Gehalt im Liquor cerebrospinalis zeigen eine hohe chemotaktische Aktivität für Leukozyten, wobei hingegen Hunde mit guter Therapieantwort eine geringere chemotaktische Aktivität aufweisen [BURGENER et al., 1998].
Die bei der protrahierten Form beobachteten neurologischen Ausfälle entstehen vermutlich durch eine starke Verdickung der Gefäße infolge der entzündlichen Infiltration der Gefäßwand, die eine leichte Kompression des Rückenmarks bzw. eine Hypoxie bewirken. Zusätzlich verursachen entzündungsbedingte Veränderungen im Zellmetabolismus eine Ischämie im Gewebe und verringern die Impulsfortleitung und synaptische Übertragung [MOORE u. CUPPS, 1983].
Bei zwei von drei an SRMA erkrankten Hunden konnten im Serum antineutrophile zytoplasmatische Antikörper nachgewiesen werden, ohne deren Bedeutung weiterzuverfolgen [FELSBURG et al., 1992].
Die bei der SRMA zu beobachtende Dysregulation des Immunsystems zeigt deutliche Übereinstimmungen mit der akuten Form des Kawasaki-Syndroms des Menschen. Es ist - wie auch bei der Wegeners Granulomatose - ein systemisch erhöhter IgA-Spiegel nachweisbar. Im Serum der Kawasaki-Patienten treten
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aktivierte Monozyten und Makrophagen auf, und es ist ein Anstieg der Anzahl peripherer B-Zellen, eine Verminderung der Anzahl peripherer T-Zellen und eine Suppression der blastogenen Antwort auf eine mitogene Stimulation zu beobachten [FELSBURG et al., 1992].
2.2 Autoantikörper beim Hund
Antikörper (Ak) werden nach Kontakt des Organismus mit körperfremden Strukturen, den Antigenen, von Plasmazellen gebildet. Die Immunglobuline (Ig) reagieren spezifisch mit dem entsprechenden Antigen. Sie sind Träger der humoralen Immunität.
Autoantikörper sind Antikörper gegen körpereigene Strukturen. Der Nachweis von Autoantikörpern stellt nicht zwingend eine pathologische Situation dar.
Sogenannte "natürliche Autoantikörper" sind hauptsächlich IgM-Antikörper, die polyreaktiv sind und eine geringe Affinität zeigen. Sie werden meist von nicht-mutierten CD5+ B-Zellen gebildet und haben eine hohe Anzahl an kreuzreagierenden Idiotypen. Dagegen sind mit Autoimmunkrankheiten assoziierte Antikörper monospezifische IgG-Ak mit einer hohen Affinität. Sie werden von B-Lymphozyten mit veränderten VH- und VL-Segmenten gebildet, die somatische Mutationen als Reifungsprozess durchlaufen haben. Die Mutation erhöht die Affinität der Antikörper für Autoantigene [CALVANICO, 1993].
Eine Autoimmunkrankheit entsteht durch eine Störung der Kontroll- und Regulationsmechanismen des Immunsystems. Dadurch wird die Immuntoleranz gegenüber körpereigenem Gewebe aufgehoben [FAUCI, 1980]. Dieser Prozess kann sich bei Kontakt des Immunsystems mit körpereigenen Antigenen bilden, die normalerweise vom Immunsystem separiert sind und durch Verletzung oder Entzündung in die Blutbahn gelangen, wie zum Beispiel Augenlinsenproteine oder Spermazellen. Auch durch den Einfluss von Viren, durch Neoplasien oder durch eine Veränderung von körpereigenen Substanzen durch Medikamente können Autoantikörper entstehen. Zudem können Kreuzreaktionen durch Antikörper gegen Fremdantigen stattfinden, die dann als Autoantikörper wirken. Die Ursache der
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Entstehung von autoaggressiven Immunreaktionen ist jedoch in den meisten Fällen nicht geklärt [KANTOR, 1988].
Beim Hund sind bei mehreren Erkrankungen Autoantikörper nachweisbar.
Antinukleäre Antikörper (ANA) treten zum Beispiel beim systemischen Lupus erythematosus (SLE) auf. Die schädigende Wirkung der ANAs besteht in der Bildung und Ablagerung von Immunkomplexen [SHULL et al., 1983]. SLE verursacht vielfältige Symptome. Dazu zählen Polyarthritiden, Nephropathien, hämolytische Anämie, Hautveränderungen, Perikarditis und weitere Krankheitserscheinungen [GRINDEM et al., 1983]. ANAs sind aber auch bei Patienten nachweisbar, die wegen unklarer Beschwerden wie Hautveränderungen, Bewegungsstörungen und anderen Erkrankungen untersucht wurden und sind damit nicht pathognomonisch für SLE [GROßJUNG, 1996].
Eine weitere Erkrankung, bei der Autoantikörper auftreten, ist die rheumatoide Arthritis. Es sind sowohl Antikörper gegen IgG (Rheumafaktor) als auch Antikörper gegen Kollagen und Knorpelstrukturen zu finden [PASTORET et al., 1998].
Bei der Kaumuskelmyositis sind Antikörper gegen Typ 2-M Muskelfasern nachweisbar [GARLEPP et al., 1984]. Auch bei Krankheiten wie den primären autoimmunhämolytischen Anämien (AIHA) (Ak gegen Erythrozyten), der immunbedingten Thrombozytopenie (ITP) (Ak gegen Thrombozyten) oder der erworbenen Myasthenia gravis (Ak gegen Acetylcholinrezeptoren) ist die Wirkung von Autoantikörpern Ursache der Erkrankung [GERSHWIN et al., 1995].
2.3 Neutrophile Granulozyten
Neutrophile Granulozyten bilden 60 - 75 % der Blutleukozyten bei Säugetieren. Bei einer akuten Entzündung besteht der größte Anteil der Entzündungszellen aus Neutrophilen [PASTORET et al., 1998]. Neutrophile sind wenige Stunden nach Eintritt der Infektion als erste Entzündungszellen im Gewebe nachweisbar [GERSHWIN et al., 1995].
Die Wirkung der aktivierten Neutrophilen besteht in der Phagozytose, der Degranulation von zytotoxischen Proteinen [SPITZNAGEL, 1983] und der Synthese
22 von Zytokinen [CASSATELLA, 1999].
Neutrophile entstehen aus pluripotenten Stammzellen im Knochenmark. Die Entwicklung vom Myeloblasten bis zum neutrophilen Granulozyten im Gewebe dauert bis zu 144 Stunden, im Falle einer Infektion kann die Dauer auf bis zu 48 Stunden verkürzt sein [FLIEDNER et al., 1964]. Die Überlebenszeit im Gewebe beträgt bis zu vier Tage [VON SANDERSLEBEN et al., 1989].
Neutrophile wandern entlang eines Konzentrationsgradienten von chemotaktischen Faktoren. Diese Faktoren werden unter anderem freigesetzt durch Bakterien, Epithelzellen, Endothelzellen, aktivierte Makrophagen oder durch nekrotische Zellen [WITKO-SARSAT et al., 2000].
Der erste Schritt der neutrophilen Granulozyten auf dem Weg vom Gefäßlumen zum Entzündungsherd im Gewebe ist das Rollen an dem vaskulären Endothel im Bereich der postkapillären Venolen, die entzündungsbedingt erweitert sind und in denen dadurch der Blutfluss verlangsamt ist. Der Prozess des Rollens geschieht durch die Interaktion von E- und P-Selektin auf der Oberfläche von aktivierten Endothelzellen und entsprechenden Rezeptoren auf Neutrophilen. Der Prozess ist reversibel [BEVILACQUA, 1993]. Die nachfolgende Adhäsion der stimulierten neutrophilen Granulozyten an Endothelzellen ist vermittelt durch die Expression von membrangebundenen Glykoproteinen, den Integrins, die an Rezeptoren auf stimulierten Endothelzellen binden. Zu diesen Rezeptoren zählen ICAMs (intercellular cell adhesion molecules), VCAMs (vascular cell adhesion molecules) und PECAMs (platelet endothelial cell adhesion molecules) [ALBELDA et al., 1994].
Durch die irreversible Bindung an die Rezeptoren wird die Stabilität des Zytoskelett der Granulozyten so verändert, dass sie sich in die Endothelzwischenräume schieben können [CARLOS et al., 1994]. Die Öffnung des Zellverbandes entsteht durch eine Kontraktion der Endothelzellen. Die Kontraktion wird bedingt durch die Stimulation von IP3 (1,4,5-Inositol-Triphosphat), welches eine Veränderung der Formation der Aktinfilamente verursacht. Auf die IP3-Stimulation haben Histamine, Thromboxane, Leukotriene, TNF-alpha und der Platelet-activating-Faktor Einfluss [GRANGER et al., 1994].
Nach der Migration in das Gewebe wandern die neutrophilen Granulozyten entlang
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dem chemotaktischen Gefälle zu dem Entzündungsherd. Dort beginnen sie mit der Phagozytose der durch Immunglobuline und Komplementfaktoren opsonierten Partikel. Nach Aufnahme in die Zelle werden die Partikel durch oxidative Mechanismen, die die Zellmembran angreifen, vernichtet. Durch die Wirkung von dem Enzym NADPH-Oxidase (Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat) werden Sauerstoffradikale gebildet. Sie sind die Vorstufe für eine Serie von mikrobiziden Oxidantien wie O2-
und H2O2 [BAGGIOLINI et al., 1993]. Ein Bestandteil des Mechanismus ist der H2O2-MPO-Halid-Komplex, durch den Hypochlorid entsteht [JOHNSON et al., 1987].
Der zweite Weg der Neutrophilen, gegen Pathogene zu wirken, besteht in der Freisetzung von antimikrobiellen Proteinen aus Granula in Phagolysosomen oder in den Extrazellularraum. Zu diesen Proteinen zählen das BPI-Protein (bactericidal / permeability increasing Protein), das bei Freisetzung in den Phagolysosomen gegen gramnegative Bakterien wirkt und in den azurophilen Granula nachweisbar ist. Hier finden sich weitere Mikrobizide wie Elastase, das unter anderem eine IL-8-Synthese in Endothelzellen induziert [BAGGIOLINI et al., 1992], Cathepsin G, Azurozidin, Defensine, Proteinase 3 oder Myeloperoxidase [FOURET et al., 1989]. In den spezifischen oder sekundären Granula sind Metalloproteinasen, zu denen Gelatinase und Kollagenase zählen, und mikrobizide Proteine wie Laktoferrin und Kathelizidin vorhanden. Die tertiären Granula enthalten Gelatinase [WITKO-SARSAT et al., 2000].
Aktivierte Neutrophile produzieren in vitro eine große Anzahl von Zytokinen, die als Mediatoren eine wichtige Rolle in der Immunantwort spielen. Sie beeinflussen die Differenzierung und Teilung von hämopoetischen Stammzellen, die Aktivierung von Leukozyten und Phagozyten, sie wirken als Zytotoxine oder Entzündungsmediatoren.
Dazu zählen proinflammatorische Zytokine wie TNF-alpha, IL-1-alpha, IL-1-beta und IL-12. Als Chemokine werden zum Beispiel IL-8 und CINC (cytokin-induced chemoattractants) gebildet. Weitere Zytokine und Wachstumsfaktoren sind IFN-alpha und IFN-beta oder G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor). Auch IL-3, IL-18 und TGF-alpha (tumor growth factor-alpha) werden unter bestimmten Bedingungen exprimiert [CASSATELLA, 1999].
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In vitro-Versuche zeigen, dass geringe Konzentrationen von chemotaktischen Faktoren - hier crIL-8 (canines rekombinantes Interleukin-8) und hrC5a (humanes rekombinantes C5a) - eine verstärkte Aktivierung caniner neutrophiler Granulozyten zeigen, wenn die Zellen erneut mit dem gleichen Agens stimuliert werden. Dieses Priming wird auch durch eine Kreuzstimulation durch crIL-8 als erste (bzw. zweite) und hrC5a als zweite (bzw. erste) Stimulation verursacht. Das Phänomen könnte in vivo eine wichtige Funktion bei der Aktivierung und dem Rekruitment von neutrophilen Granulozyten durch geringe Konzentrationen von chemotaktischen Faktoren haben [BURGENER et al., 1998].
2.4 Antineutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCA)
Antineutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCA) sind Autoantikörper der Immunglobulinklasse IgG, die an Rezeptoren der körpereigenen neutrophilen Granulozyten binden. Zu den Hauptantigenen, die bei aktivierten Granulozyten auch auf der Zellmembran exprimiert bzw. degranuliert werden, zählen Proteinase 3 (PR3) und Myeloperoxidase (MPO).
ANCA können bei verschiedenen Immunvaskulitiden des Menschen nachgewiesen werden. Zu diesen ANCA-assoziierten Vaskulitiden zählen unter anderem die Wegeners Granulomatose und das Kawasaki-Syndrom. Bei zwei von drei an SRMA erkrankten Hunden wurden ANCA im Serum nachgewiesen [FELSBURG et al., 1992]. ANCA können aber auch bei verschiedenen anderen Erkrankungen des Menschen nachgewiesen werden, bei denen keine Vaskulitiden auftreten. Zu diesen Erkrankungen zählen unter anderem auch HIV-Infektionen und andere akute und chronische Infektionen [HAGEN et al., 1993]. Die Antigene, gegen die ANCA gerichtet sind, sind dabei zum Teil noch nicht identifiziert.
Auch bei 58 % der Patienten mit ulzerativer Colitis konnten mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz MPO-ANCA nachgewiesen werden [RUMP et al., 1993]. ANCA gegen MPO zeigten sich in verschiedenen Studien bei 20 - 40 % der Patienten mit Morbus Crohn [SNOOK, 1989; SAVIGE, 1999], bei 20 % der Patienten mit Lupus
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erythematosus [NASSBERGER, 1989], bei 80 % der Patienten mit chronisch aktiver Hepatitis und bei 25 - 30 % der Patienten mit rheumatoider Arthritis [SAVIGE, 1999].
Der Einfluss der ANCA auf die Pathogenese der Erkrankungen ist noch nicht geklärt. Vermutlich sind ANCA nicht die Ursache für die genannten Erkrankungen des Menschen, sondern eine Folge der inflammatorischen Prozesse [SALANT, 1999]. Zu den Hypothesen über die schädigende Wirkung der Autoantikörper zählen direkte Aktivierung von neutrophilen Granulozyten und Monozyten, die Bindung an Endothelzellen und die Immunkomplexbildung [FALK et al., 2000].
Tab. 2.1: Erkrankungen des Menschen mit möglichem ANCA-Nachweis.
[nach HAGEN et al., 1993]
Krankheiten Zielantigen Wegeners Granulomatose PR3, selten MPO Kawasaki-Syndrom PR3 und MPO Mikroskopische Polyarteriitis PR3 und MPO Churg-Strauss-Syndrom MPO
Polyarteriitis nodosa selten, sonst PR3 oder MPO systemische
Vaskulitiden
andere systemische
Vaskulitiden selten, nicht PR3 oder MPO Rheumatoide Arthritis unbekannt, Laktoferrin, ANA,
selten MPO Rheumatische
Erkrankungen Systemischer Lupus
erythematosus selten MPO oder Laktoferrin Ulzerative Colitis Kathepsin-G, Laktoferrin,
unbekannt Entzündliche
Darmerkrankungen
Morbus Crohn Kathepsin-G, Laktoferrin, unbekannt
chronische Lebererkrankungen Kathepsin-G, Laktoferrin, unbekannt
akute / chronische Infektionen unbekannt andere
Erkrankungen
Infektion mit humanem
Immundefizienz-Virus (HIV) unbekannt, PR3 und MPO
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Die Aktivierung von neutrophilen Granulozyten durch ANCA-IgG findet durch die Bindung des Fc-Anteil des Antikörpers an den FcγRIIa-Rezeptor (CD 32) und an den FcγRIIIb-Rezeptor (CD 16b) [PORGES et al., 1994; KOCHER et al., 1998] statt.
Die zytoplasmatische Domäne des FcγRIIa-Rezeptors enthält ein Tyrosin- Aktivierungsmotiv (ITAM), das rezeptorvermittelte Funktionen wie Degranulation, Phagozytose, Freisetzung von Sauerstoffradikalen [PORGES et al., 1994], antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität, Zytokinproduktion und -freisetzung aktiviert [KIMBERLY, 2000]. Der Rezeptor hat zudem eine besondere Affinität zu humanen IgG3-Subklassen [KALLENBERG, 1998].
Die Bindung an den FcγRIIIb-Rezeptor führt zur Aufregulierung von CD11b/CD18 Adhäsionsmolekülen. Sie verursachen das Rollen der neutrophilen Granulozyten auf der Endotheloberfläche und nachfolgend die Adhäsion an Endothelzellen, wo sie den Blutfluss stören und das Gewebe schädigen können [KOCHER et al., 1997].
Da ANCA die intakte Zellmembran von neutrophilen Granulozyten nicht durchdringen können, ist eine Bindung nur möglich, wenn die Antigene auf der Oberfläche der Zellen exprimiert werden. Die Exprimierung geschieht auf der Oberfläche von zytokin-aktivierten und nicht-apoptotischen neutrophilen Granulozyten [FALK et al., 1990; CSERNOK et al., 1994], aber auch auf der Zellmembran apoptotischer neutrophiler Granulozyten [GILLIGAN et al., 1996].
Die Bindung von ANCA an Neutrophile führt zur Degranulation mit der Freisetzung lytischer Enzyme, dazu zählen auch PR3 und MPO, zur Produktion freier Sauerstoffradikale [FALK et al., 1990] und zur Sekretion von Zytokinen wie IL-1-beta (Interleukin 1-beta) [BROOKS et al., 1996; KALLENBERG, 1998] und IL-8 [COCKWELL et al., 1999].
ANCA aktivieren zudem den Lipoxygenasestoffwechsel neutrophiler Granulozyten.
Dadurch wird die Produktion des Leukotriens B4 erhöht, welches die Produktion und Freisetzung von Sauerstoffmetaboliten stimuliert und bei Freisetzung auf neutrophile Granulozyten chemotaktisch wirkt [GRIMMINGER, 1996].
An TNF-aktivierte Neutrophile gebundene ANCA verursachen eine beschleunigte Apoptose der Zellen durch Erzeugung von reaktiven Sauerstoffradikalen. Bei der Apoptose ist normalerweise der Abbau des Zellkernes mit spezifischen
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Veränderungen an der Zellmembran verbunden. Durch die Membranveränderungen wird die Zelle von Makrophagen als apoptotisch erkannt. Die ANCA-induzierte Apoptose verursacht jedoch die Abkopplung der nukleären von den Membranveränderungen. Dadurch stirbt die Zelle ab, ohne dass sie von außen als tot erkannt wird. Die Erkennung und Phagozytose der apoptotischen Zellen durch Makrophagen ist somit vermindert bzw. verlangsamt [HARPER et al., 1998]. Die Ansammlung von apoptotischen Neutrophilen hat einen hohen phlogistischen Effekt und verursacht eine weitere Gewebeschädigung [SAVAGE, 2000].
Bei der Bindung an Monozyten verursachen ANCA die Produktion von Sauerstoffmetaboliten [EWERT et al., 1991] und von MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), von dem bekannt ist, dass es eine wichtige Rolle bei der Bildung von granulomatösen Veränderungen spielen kann [CASSELMANN et al., 1995].
ANCA binden zudem an das Enzym HLE (human leucocyte elastase), das neben neutrophilen Granulozyten auch Monozyten exprimieren [BROUWER et al., 1994].
Auch BPI (bactericidal / permeability increasing Protein) gilt als wichtiges Antigen für ANCA bei humanen Vaskulitiden [ZHAO et al., 1995]. Bei einigen ANCA-positiven Seren kann eine Bindung an Azurozidin nachgewiesen werden. Azurozidin gehört wie PR3 zu der Familie der neutralen Serinproteinasen, zeigt aber im Gegensatz zu PR3 keine proteolytische Aktivität [ZHAO u. LOCKWOOD, 1996].
Weitere zytoplasmatische Rezeptoren, für die ANCA-Bindungen nachgewiesen werden konnten, sind alpha-Enolase, Katalase, Aktin, Cathepsin G, Laktoferrin, Lysozym, HMG1, HMG2 (high-mobility-group nonhistone chromosomal proteins) und weitere, nicht identifizierte Strukturen [SAVIGE et al., 1999].
Die bisher durchgeführten in vivo Tiermodelle zeigen, dass die alleinige Anwesenheit von ANCA nicht pathogen wirkt, sondern zusätzliche Faktoren zum Priming oder zur Stimulation der neutrophilen Granulozyten und Monozyten nötig sind, um eine Bindung der ANCA an die Zellen und damit eine gewebeschädigende Wirkung zu ermöglichen [BROUWER et al., 1993; HEERINGA et al., 1998; SALANT, 1999].
28 2.4.1. Antikörper gegen Proteinase 3
Proteinase 3 (PR3) oder Myeloblastin ist eine 29 kD neutrale Serinproteinase in den azurophilen (alpha-) Granula [FOURET et al., 1989] und der Plasmamembran von sekretorischen Vesikeln polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten [WITKO-SARSAT et al., 1999]. PR3 wird auch auf der Zellmembran aktivierter [CSERNOK et al., 1994] oder apoptotischer neutrophiler Granulozyten [GILLIGAN, 1996] exprimiert. Außerdem ist PR3 in bestimmten Subpopulationen in monozytären Lysosomen nachweisbar [BROUWER et al., 1994].
PR3 wird synthetisiert als Präproenzym, das erst nach zwei weiteren intrazellulären proteolytischen Entwicklungsschritten enzymatische Wirkung besitzt. Nach Abspaltung des Signalpeptids und dem Verlassen des endoplasmatischen Retikulums trägt PR3 noch ein N-terminales Aktivierungs-Dipeptid, welches das Proenzym in einer inaktiven Form hält. Die Abspaltung dieses Peptids führt zu einer Einfaltung des freien N-Terminus. Dadurch wird die aktive Seitentasche zugänglich und das Enzym erreicht seine enzymatische Aktivität. In den azurophilen Granula liegt PR3 in N-terminaler Form vor [SPECKS, 2000].
Die Translokation von intragranulärem PR3 auf die Zelloberfläche findet nach der Aktivierung der neutrophilen Granulozyten durch TNF-alpha und IL-8 statt [CSERNOK et al., 1994].
Am Ort der Entzündung wird PR3 von aktivierten neutrophilen Granulozyten in großen Mengen freigesetzt und verursacht die Hydrolyse von Matrixproteinen und bioaktiven Polypeptiden [BANK et al., 2000]. PR3 ist beteiligt am Abbau von z.B.
Elastin, Proteoglykanen, Membranbestandteilen und den 4 Subklassen von humanem IgG [WIIK, 2000].
In vitro verursacht PR3 die Apoptose von bovinen Endothelzellen der Pulmonalarterien [TAEKEMA-ROELVINK, 1998] und die Trennung und Zytolyse von Endothelzellen der humanen Vena umbilicalis (HUVEC) [BALLIEUX et al., 1994].
Bei Endothelzellen ist in Anwesenheit von PR3 in vitro eine erhöhte Produktion von IL-8, das eine starke chemotaktische Wirkung auf neutrophile Granulozyten hat, und von MCP-1, das chemotaktisch auf Monozyten und T-Zellen wirkt, nachgewiesen.
Zudem verursacht PR3 die erhöhte Expression von verschiedenen
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Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen. Deshalb wird eine Bindung zwischen PR3 und Endothelzellen vermutet [TAEKEMA-ROELVINK, 2000].
Antikörper gegen Proteinase 3 zeigen bei der Immunfluoreszenzfärbung eine diffuse granuläre zytoplasmatische Färbung mit zentraler Akzentuierung und Aussparung des Zellkernes. Durch das typische Färbebild werden die Antikörper auch als cANCA (cytoplasmatic ANCA) bezeichnet [HOFFMANN u. SPECKS, 1998].
Frei zirkulierendes PR3 wird durch das Enzym alpha-1-Antitrypsin inaktiviert. Die Bindung von Anti-PR3 an freies PR3 verhindert jedoch die Inaktivierung. Die Komplexbildung verlangsamt vermutlich den Abbau des PR3 und verursacht eine Ansammlung der Anti-PR3-PR3-Komplexe im Gewebe. Die spätere Dissoziation der Verbindung führt zu einer weiteren Schädigung des Gewebes durch das noch aktive Enzym [DAOUK et al., 1995].
Bei Patienten mit Entzündungen des Respirationstraktes, die PR3-ANCA im Serum zeigten, wurden große Mengen PR3-alpha-1-Antitrypsin-Komplexe im purulenten Sputum nachgewiesen. Die Anwesenheit von PR3 kann zu einer Immunantwort mit Bildung von Autoantikörpern (ANCA) bei empfänglichen Individuen führen [BALLIEUX et al., 1992].
Anti-PR3-Antikörper verursachen bei Bindung an Endothelzellen die Expression von VCAM-1 und die Ausschüttung von IL-8 [MAYET et al., 1999].
In vitro ist unter dem Einfluss von PR3 und PR3-ANCA eine signifikante Proliferation von T-Lymphozyten, die von Patienten mit ANCA-assoziierten Immunvaskulitiden gewonnen wurden, nachgewiesen. Die T-Zellantwort dauert durch alle Krankheitsstadien auch während der Remission an [KING et al., 1998].
Antikörper gegen PR3 treten bei der humanen Wegeners Granulomatose, aber auch bei dem Kawasaki-Syndrom und in geringerem Umfang bei der mikroskopischen Polyangiitis auf.
30 2.4.2. Antikörper gegen Myeloperoxidase
Myeloperoxidase (MPO) ist ein Hämoprotein [SPECKS, 2000] und lässt sich sowohl in den azurophilen Granula polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten, als auch in der Plasmamembran stimulierter neutrophiler Granulozyten [FOURET et al., 1989]
und in den Lysosomen bestimmter Untergruppen von Monozyten nachweisen [BROUWER et al., 1994]. Auch apoptotische neutrophile Granulozyten exprimieren MPO auf der Zellmembran [GILLIGAN, 1996]. Als kationisches Protein mit einem isoelektrischen Punkt von 9,1 kann MPO nach der Degranulation von aktivierten neutrophilen Granulozyten an anionische Strukturen wie Basalmembranen oder die Oberfläche von Endothelzellen binden [HEERINGA et al., 1998].
MPO ist ein Tetramer, das aus zwei kleinen und zwei großen Untereinheiten besteht, die über Disulfid-Brücken miteinander verbunden sind. Das Präproenzym besteht aus dem Signalpeptid, einem großen Propeptid und einer kleinen und großen Untereinheit. Nach Abspaltung des Signalpeptids und einer Asparagin-gebundenen Glykosylierung entsteht das hämfreie Apoproenzym. Durch Bindung einer prosthetischen Hämgruppe wird das Proenzym katalytisch aktiv. Das amino-terminale Propeptid, ein kleines Peptid zwischen der leichten und schweren Kette und ein Serin-Rest am C-Terminus werden abgetrennt. Als letzter Schritt in der MPO-Synthese werden Oligosaccharidseitenketten zu komplexen Formen verändert [GULLBERG et al., 1999].
MPO verursacht die Produktion freier Sauerstoffradikale und ist in der Lage, autologe Proteine zu Autoantigenen zu verändern [WIIK, 2000]. Der wichtigste Mechanismus zur Abwehr von Bakterien oder Pilzen entsteht, wenn H2O2 und MPO in Anwesenheit von Halidionen (bevorzugt Chloridionen) auftreten. Der H2O2-MPO-Halid-Komplex verursacht die Peroxidation von Chloridionen zu Hypochlorid (HOCl), welches Zellwände halogeniert und in der Zellmembran vorhandene Aminosäuren in Aldehyde umsetzt [JOHNSON et al., 1987].
Antikörper gegen MPO zeigen ein perinukleäres Färbungsmuster mit oder ohne Fluoreszenz des Zellkernes und werden deshalb auch als pANCA (perinuclear ANCA) bezeichnet [HOFFMANN u. SPECKS, 1998; SAVIGE, 1999].
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In einem Tiermodell wurden Ratten (Brown Norway rats) mit humaner MPO immunisiert und bildeten daraufhin Anti-MPO-Antikörper. Nach der renalen Injektion von einem PMN-Lysosomal-Extrakt (PMN - polymorphkernige neutrophile Granulozyten), das die Produkte aktivierter neutrophiler Granulozyten enthielt (PR3, MPO und H2O2), entwickelten die Tiere eine nekrotisierende Glomerulonephritis (NCGN - necrotizing crescentic glomerulonephritis) mit interstitiellen Infiltraten und einer renalen Vaskulitis. Vierundzwanzig Stunden nach Beginn der Infusion mit dem PMN-Lysosomal-Extrakt waren Immunkomplexe im Bereich der glomerulären Basalmembran vorhanden, vier Tage nach Ende der Infusion waren sie nicht mehr nachweisbar. Wahrscheinlich entstanden die Läsionen bei dieser Erkrankung durch Immunkomplexe [BROUWER et al., 1993]. Die systemische Injektion des PMN- Lysosomal-Extraktes bei den MPO-immunisierten Ratten führte zu nekrotisierenden Vaskulitiden in Lunge und Darm [HEERINGA et al., 1998]. Bei Katzen ist das Lupus- ähnliche Syndrom bekannt, das durch die experimentelle Applikation von Propylthiouracil (PTU), einem Thyreostatikum, entsteht. In einer Studie wurden MPO-ANCA im Serum dieser Katzen nachgewiesen. Die Ursache für die Bildung der ANCA wird in der oxidativen Wirkung von MPO vermutet, das Propylthiouracil metabolisiert und seinerseits der PTU-Metabolit MPO so verändert, dass es als fremd erkannt wird und Auto-Antikörper entstehen. Es konnte nicht geklärt werden, ob die ANCA am Krankheitsgeschehen beteiligt oder ein Epiphänomen sind [WALDHAUSER et al., 1995].
MPO-Antikörper treten beim Menschen vor allem bei mikroskopischer Polyangiitis, der rasch progressiven Glomerulonephritis, dem Kawasaki-Syndrom und in geringerem Umfange bei dem Churg-Strauss-Syndrom auf.
2.5 ANCA-assoziierte Vaskulitiden beim Menschen
Zu den ANCA-assoziierten Vaskulitiden des Menschen zählen die Wegeners Granulomatose, das Kawasaki-Syndrom, das Churg-Strauss-Syndrom, die mikroskopische Polyangiitis, die rasch progressive Glomerulonephritis und die
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ANCA-assoziierte renale Vaskulitis. Exemplarisch werden hier die Krankheitsbilder der Wegeners Granulomatose und des Kawasaki-Syndroms beschrieben.
Unklar bei den genannten Erkrankungen ist, ob das Auftreten der ANCA ein Epiphänomen ist oder ob die Antikörper wesentlich zur Pathogenese beitragen [SALANT, 1999]. Einige Autoren [MOSCARDI et al., 1997] vermuten, dass der gelungene Nachweis von ANCA im Serum immer auf einen Krankheitsprozess hinweist.
Eine mögliche Erklärung für die Enstehung der ANCA-assoziierten Vaskulitiden ist das Two-hit-Modell: Es müssen sowohl ANCA im Serum auftreten als auch eine Aktivierung von neutrophilen Granulozyten und Monozyten stattfinden [FALK et al., 2000]. Erst nach der Aktivierung dieser Zellen ist eine Bindung der ANCA an diese möglich und die oben beschriebenen schädigenden Wirkungen auf den Organismus können entstehen. Das Agens, das die Aktivierung der Entzündungszellen verursacht, ist noch unbekannt.
2.5.1 Wegeners Granulomatose
Die Wegeners Granulomatose ist charakterisiert durch eine granulomatöse Entzündung des Respirationstraktes, eine Glomerulonephritis und eine systemisch nekrotisierende Vaskulitis, die vor allem kleinere Blutgefäße betrifft [DONALD et al., 1976; FAUCI et al., 1983]. Neurologische Ausfälle entstehen durch intrazerebrale oder subarachnoidale Blutungen oder durch zerebrale Granulome [LEHMANN, 1981]. Die Granulome sind im frühen Stadium gekennzeichnet durch eine Infiltration mit neutrophilen Granulozyten, später treten monomorphkernige Zellen auf.
Sowohl die IgA- als auch die IgE- Werte im Serum der betroffenen Patienten sind häufig erhöht [BERLIT et al., 1983]. Ein wichtiger serologischer Marker für die Diagnostik der Krankheit ist das Auftreten von ANCA [VAN DER WOUDE et al., 1985], das Hauptantigen ist hierbei PR3 [JENNE et al., 1990; EWERT et al., 1991].
Bei der klassischen, also systemischen Form der Wegeners Granulomatose sind bei fast allen der Patienten cANCA nachweisbar. Bei der lokalen Form, durch die
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Manifestation der Erkrankung in einzelnen Organen gekennzeichnet, sind bei der Hälfte der Erkrankten Antikörper gegen PR3 vorhanden [GROSS, 2000].
Einige Studien zeigen, dass ein Anstieg des ANCA-Titers positiv mit dem Auftreten eines Rezidivs korreliert und bei Patienten absinkt, die eine gesundheitliche Besserung zeigen [NOLLE et al., 1989]. Diese Ergebnisse stehen im Widerspruch zu anderen Untersuchungen, bei denen 76 % der Patienten mit Wegeners Granulomatose unabhängig vom Krankheitsgeschehen verlaufende ANCA-Titer aufwiesen [KERR et al., 1993].
Bei 60 - 70 % der Patienten konnten in einer Studie ein chronischer Befall mit Staphylococcus aureus im Bereich der Nasenschleimhäute nachgewiesen werden.
Die Patienten hatten eine achtmal höhere Rezidivrate als Patienten ohne diese Infektion [STEGEMANN et al., 1994]. Eine Behandlung mit Antibiotika (Sulfamethoxazol und Trimethoprim) reduzierte die erhöhte Rezidivrate [STEGEMANN et al., 1996].
2.5.2 Kawasaki-Syndrom
Das Kawasaki-Syndrom oder mukokutanes Lymphknotensyndrom (MCLS) ist eine akut fieberhafte Erkrankung mit multipler Organbeteiligung, die im Kleinkindesalter bis zu fünf Jahren auftritt.
Das Syndrom ist gekennzeichnet durch eine systemische Vaskulitis, die vor allem mittelgroße Muskelarterien betrifft. Zu den klinischen Symptomen zählen Fieber, nicht-eitrige Konjunktivitiden, Entzündungen der Mund- und Rachenschleimhaut und Rötung und Schuppung der Palmar- und Plantarflächen der Hände und Füße [KAWASAKI, 1967]. Zudem entsteht eine zervikale Lymphadenopathie. Zu den kardiovaskulären Komplikationen durch Schädigung der Koronararterien zählen eine Dilatation der Koronararterien, perikardialer Erguss, Perikarditis, Myokardinfarkte, ventrikuläre Aneurismen, eine Mitralinsuffizienz und daraus resultierend multiple Formen von EKG-Veränderungen. Auch Meningitiden, gastrointestinale Störungen, Proteinurie, tubuläre interstitielle Nephritis, Arthropathien und Paralysen gehören zum Krankheitsbild [SHULMAN et al., 1995]. Im Serum der Patienten findet man eine
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polymorphonukleäre Leukozytose und einen Anstieg des IgA-Wertes [FELSBURG et al., 1992], im Liquor cerebrospinalis besteht eine Pleozytose. Die labordiagnostisch gewonnenen Ergebnisse zeigen eine deutliche Ähnlichkeit mit der SRMA. Sowohl ANCA als auch Antikörper gegen Endothelzellen (AECA) sind nachweisbar. Vermutlich ist die Ursache der Erkrankung ein infektiöser Prozess und verschiedene Erreger werden als auslösendes Agens diskutiert. Als Superantigene werden Staphylokokken, pyrogenes Exotoxin produzierende Streptokokken oder ähnliche Erreger vermutet [DILLON, 2000].
Die SRMA zeigt sowohl Übereinstimmungen mit dem Kawasaki-Syndrom als auch mit der Wegeners Granulomatose. Da bei diesen humanen Erkrankungen der Nachweis von ANCA zu einem wichtigen diagnostischen Mittel zählt, sollten in der vorliegenden Studie das Auftreten von ANCA bei Hunden mit SRMA im Vergleich zu Hunden mit anderen Erkrankungen und gesunden Hunden untersucht werden, um die Diagnostik der SRMA zu verbessern und Hinweise auf die Pathogenese zu erhalten.
2.6 Nachweisverfahren von ANCA 2.6.1 Immunfluoreszenz
Bei der indirekten Immunfluoreszenz (IIF) wird der nachzuweisende Antikörper nach Bindung an das Antigen auf einem beschichteten Objektträger fluoreszenzgefärbt und im Fluoreszenzmikroskop anhand der Intensität und Lokalisation der Färbung beurteilt. Das verwendete Antigen besteht beim Nachweis von ANCA aus membranpermeabilisierten neutrophilen Granulozyten. Die im Serum oder Liquor cerebrospinalis vorhandenen Antikörper werden mit fluoreszenzkonjugiertem Immunglobulin gefärbt und die intrazelluläre Fluoreszenz beurteilt [VAN DER WOUDE, 1985; WIIK, 1989; FELSBURG et al., 1992].
Man unterscheidet dabei Färbungen von vier verschiedenen Antikörpertypen:
cANCA, atypische cANCA, pANCA und atypische ANCA.
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cANCA zeigen bei der Bindung an PR3 eine klassische granulär zytoplasmatische Fluoreszenz mit zentraler oder interlobulärer Akzentuierung. Atypische cANCA bilden eine diffuse, flächige Färbung des Zytoplasmas ohne interlobuläre Akzente. Diese ANCA binden sowohl an MPO als auch an BPI, aber auch an unbekannte Rezeptoren. Bei der Bindung von pANCA an MPO tritt eine perinukleäre Fluoreszenz mit oder ohne nukleärer Färbung auf. Das gleiche Färbemuster zeigt sich auch, wenn granulozytenspezifische ANAs im Serum vorhanden sind und an die neutrophilen Granulozyten binden. Die Bindung von atypischen ANCA verursacht eine sowohl zytoplasmatische als auch perinukleäre Fluoreszenz. Zu den Rezeptoren dieser Antikörper zählen sämtliche Neutrophil-spezifische antigene Strukturen außer PR3, MPO und BPI [SAVIGE et al., 1999].
Die Ergebnisse der IIF sind immer dann schwierig zu beurteilen, wenn ANAs im Serum präsent sind, da sie ein identisches Färbebild wie pANCA produzieren können, bei einer hohen Hintergrundfluoreszenz und wenn weitere undefinierte Antikörper im Serum vorhanden sind [POLLOCK et al., 1999].
2.6.2 Durchflusszytometrie
Bei der Analyse im FACS (FACS - Fluorescence-Activated Cell Sorter) werden Einzelzellen oder Zellbestandteile in Suspension anhand optischer und chemophysikalischer Eigenschaften wie Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften untersucht. Die Messung beinhaltet die Differenzierung der Zellen nach der Granularität, der relativen Zellgröße und nach maximal drei verschiedenen Fluoreszenzfärbungen.
Da sich die Rezeptoren bei intakten ruhenden neutrophilen Granulozyten im Zytoplasma befinden, muss die Zellmembran permeabilisiert werden, um ein Eindringen der ANCA in die Zelle zu ermöglichen [YANG et al., 1994]. Diese Methode wurde auch in der vorliegenden Arbeit in verschiedenen Variationen verwendet.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die neutrophilen Granulozyten durch Aktivierung zu einer Expression von PR3 und MPO auf der Zellmembran zu
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stimulieren. Dafür werden die Zellen mit TNF-alpha aktiviert, bevor sie mit Patientenserum inkubiert werden [SUZUKI et al., 1995]. Da auch apoptotische Neutrophile PR3 und MPO auf der Oberfläche exprimieren, wurde ein Verfahren etabliert, bei dem der Mechanismus genutzt wird und apoptotische Neutrophile verwendet werden [GILLIGAN et al., 1996].
2.6.3 Enzyme Linked Immuno Sorbant Assay (ELISA)
Mit dem 1971 entwickelten Enzymimmunoassay [ENGVALL u. PERLMANN, 1971;
VAN WEEMEN u. SCHUURS, 1971] lassen sich Antigene oder Antikörper nachweisen. An einen Träger (solide Phase) sind hochreine Antikörper bzw.
Antigene fixiert. Nach der Inkubation der Festphase mit dem nachzuweisenden Antikörper oder Antigen wird ungebundenes Material durch Waschen beseitigt. Als Indikator für die erfolgte Antigen-Antikörper-Bindung fungieren Konjugate, die spezifisch gegen den gebundenen Antikörper gerichtet sind. Diese Marker sind Immunglobuline, die mit Enzymen, meist Peroxidase, gekoppelt sind. Die Zugabe von Enzymsubstrat ergibt eine Farbreaktion, die qualitativ oder quantitativ bestimmt wird [ROLLE u. MAYR, 1993].
ELISA sind eine anerkannt sichere Methode zum Nachweis von ANCA beim Menschen in der Routinediagnostik [SAVIGE et al., 1999].
In einer Studie, die fünf von den zur Zeit kommerziell erhältlichen ELISA zum Nachweis von ANCA beim Menschen verglich, erreichten ELISA zum Nachweis von PR3-ANCA eine Sensitivität von 88 - 100 % und eine Spezifität von 91 - 100 %. Die MPO-ANCA-ELISA zeigten eine Sensitivität von 59 - 100 % und eine Spezifität von 83 - 100 % [POLLOCK et al., 1999].
Die für die vorliegende Studie verwendeten ELISA Varelisa MPO-ANCA und Varelisa PR3-ANCA der Fa. Pharmacia und Upjohn sind indirekte nicht kompetitive Immunoassays zur qualitativen und quantitativen Diagnostik von ANCA-IgG im Serum oder Plasma. Die Beschichtung der Mikrotiterplatten erfolgte mit humanem MPO bzw. PR3.
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3. MATERIAL UND METHODEN
3.1 Geräte und Materialien
- Deckgläser, Cat. No. 470820, Fa. Brand, Wertheim - FACSCalibur, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- FACS-Röhrchen, Cat. No. 352008, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg - Filterkarten für Objektträgerhalter, Cat. No. 1694, Fa. Hettich, Tuttlingen - Fluoreszenzmikroskop Axiophot, Fa. Zeiss, Oberkochen
- Mikroliter-Pipetten, regulierbar, Fa. Brand, Wertheim - Mikroskop, H600, Fa. Hund, Wetzlar
- Mikrotiterplattenphotometer, MR 5000, Fa. Dynatech, Southhampton, UK - MicroWin, Version 3, Fa. Mikrotek, Overath
- Objektträger, SuperFrost Plus, Art. No. 041300, Fa. Menzel-Gläser, Braunschweig - Objektträgerhalter für die Zentrifuge, Cat. No. 1662, Fa. Hettich, Tuttlingen
- Pipettenspitzen, Fa. Brand, Plastibrand, Wertheim - Plattenrüttler, Promax 1020, Fa. Heidolph, Kelheim
- Reagenzglasschüttler, Reax control, Fa. Heidolph, Kelheim - SAS, Version 6.12, Institut für Biometrie, Epidemiologie und
Informationsverarbeitung der Tierärztlichen Hochschule Hannover - SigmaPlot, Version 5.0, Fa. Sigma, Deisenhofen
- STATeasy für Windows (Lozan, Hamburg) - Transferpette, Fa. Brand, Wertheim
- Varelisa PR3-ANCA, Lot. Nr. QG06, Cat. No. 19248/19296 und Varelisa MPO-ANCA, Lot. Nr. QH26, Cat. No. 19348/19396, Fa. Pharmacia und Upjohn, Freiburg
- WinMDI, Version 2.8, Auswertungsprogramm für durchflusszytometrische Daten, Purdue Cytometry Website, Purdue University, West Lafayette, USA
- Zellzählkammer, Zellzählkammer nach Türk, Cat. No. 719206, Fa. Brand, Wertheim - Zentrifuge, Rotina 35R, Fa. Hettich, Tuttlingen
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- Zentrifugenröhrchen, 50 ml mit konischem Boden, Cat. No. 114822, Fa. Brand, Wertheim
- Zytokammer mit Dichtung, Cat. No. 1663, Fa. Hettich, Tuttlingen
3.2 Chemikalien und Reagenzien
- Affinity Purified Antibody Peroxidase Labeled Goat anti-Dog IgG (H+L) Peroxidase gebundenes IgG, Cat. No. 14-09-06, Lot. No. VC049 und WM050,
Fa. Kirkegaard und Perry Laboratories, Gaithersburg, USA - Bovines Serum (aus Serumpool, inaktiviert bei 56 °C für 30 min) - FACS Permeabilizing Solution, Cat.No. 340457, Lot.No. 81929, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- CPSR-1 (controlled process serum replacement Type 1), Cat. No. C-8905, Fa. Sigma Diagnostics, Deisenhofen
- Faramount, Cat. No. S 3025, Fa. Dako, Hamburg
- Globuman Berna, Humanes Normalglobulin, Cat.No. 422, Fa. Berna, Schweizerisches Serum- und Impfinstitut Bern, Schweiz
- Haema-Schnellfärbung, Lösung 1, Lösung 2 und Fixierlösung, Cat.No. LT001, Fa. Labor + Technik, Lehmann, Berlin
- Histopaque H-1119, Cat.No. 1119-1, Fa. Sigma Diagnostics, Deisenhofen - Hundeserum (aus Serumpool, inaktiviert bei 56 °C für 30 min)
- Mouse anti canine Ig (MCA 630), BatchNo. 110299, Fa. Serotec, Oxford, England - Pancoll , Dichte 1,077 g/ml, Cat.No. P04-60500, Fa. Cytogen, Ober-Mörlen
- Paraformaldehyd, Cat.No. P6148, Fa. Sigma, Deisenhofen
- Penicillin-Streptomycin-Lösung (10000 Einheiten Penicillin und 10 mg Streptomycin pro ml 0,9 % NaCl), Cat.No. P0781, Fa. Sigma, Deisenhofen
- RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamin, mit 2g/l NaHCO3), Cat.No. 04-16500, Fa. Cytogen, Ober-Mörlen
- R-PE-AffiniPure Goat anti mouse IgG (F(ab')2), Cat.No. 115-116-072, Lot.No. 45974, Fa. Jackson Immuno Research, West Grove, USA
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- Saponin, Cat.No. 232-462-6, Lot.No. 108H2614, Fa. Sigma Diagnostics, Deisenhofen
- Sheep anti canine IgG:FITC (AA132F), BatchNo. 120400, Fa. Serotec, Oxford, UK - Tween 20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate), Cat. No. P1379,
Fa. Sigma Diagnostics, Deisenhofen
- Ziegenserum (aus Serumpool, inaktiviert bei 56 °C für 30 min)
3.3 Medien, Puffer und Lösungen
PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) pH 7,4
NaCl 8,0 g KCl 0,2 g
Na2HPO4 1,15 g
KH2PO4 0,2 g Aqua dest. ad 1000 ml
PBS, doppelt konzentriert
NaCl 16,0 g KCl 0,4 g
Na2HPO4 2,3 g KH2PO4 0,4 g
Aqua dest. ad 1000 ml
MIF-Puffer (Membranimmunfluoreszenz-Puffer)
bovines Serum-Albumin 5 g Natrium-Azid, 10 %ig 500 µl PBS 500 ml
40 RPMI-Puffer; pH 8,3
bovines Serumalbumin 1 g Tris-HCl-Puffer (1M) 2,5 ml
RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamin, mit 2g/l NaHCO3) 500 ml
Kulturmedium
Penicillin-Streptomycin-Lösung 1 ml CPSR-1 2,5 ml RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamin, mit 2g/l NaHCO3) 500 ml
Paraformaldehyd-Lösung (4 %)
Paraformaldehyd 4 g PBS ad 100 ml
3.4 Untersuchungsmaterial
Für die vorliegende Arbeit wurden 158 Hunde untersucht, von denen insgesamt 219 Serumproben und 158 Proben des Liquors cerebrospinalis entnommen wurden.
Nachfolgend wird "Liquor cerebrospinalis" kurz als "Liquor" oder "CSF"
(cerebrospinal fluid) bezeichnet.
3.4.1 Hunde mit SRMA
46 der untersuchten Hunde waren an SRMA erkrankt. Diese Erkrankung wurde diagnostiziert auf Grund der folgenden klinischen und labordiagnostischen Untersuchungen. Die Patienten zeigten eine steife Kopf-Halshaltung, hochgradige Schmerzhaftigkeit und Fieber. Im Liquor cerebrospinalis bestand eine neutrophile Pleozytose. Die IgA-Werte waren sowohl im Serum als auch im Liquor cerebrospinalis erhöht. Krankheitserreger konnten nicht nachgewiesen werden. Eine
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Therapie mit Glukokortikosteroiden zeigte eine deutliche Besserung der Krankheitssymptome.
Bei 14 der Patienten wurden während des Krankheitsverlaufes mehrere Serum- und Liquorproben untersucht. Es wurden dafür je nach Patient 2 bis 10 Proben in einem Zeitraum von 20 Tagen bis 2,5 Jahren entnommen.
3.4.2 Hunde mit weiteren Erkrankungen
Von 73 Patienten, die wegen verschiedener Erkrankungen in der Klinik vorgestellt wurden, wurden insgesamt 73 Serum- und 57 Liquorproben entnommen.
Davon waren 14 Serum- und 11 Liquorproben von Hunden mit bakteriellen Enzephalitiden, 8 Serum- und 7 Liquorproben von Patienten mit viralen Enzephalitiden wie z.B. Staupe und 8 Serum- und Liquorproben von Patienten mit granulomatöser Meningoenzephalomyelitis (GME).
Von 30 Hunden mit Tumorerkrankungen des ZNS (z.B. Gliome, Meningiome, maligne Lymphome) wurden 30 Serum- und 23 Liquorproben entnommen. Von einem an meningealer Histiozytose erkrankten Patienten wurden im Laufe der Erkrankung insgesamt 5 Serum- und Liquorproben entnommen.
5 Serum- und 4 Liquorproben stammten von Hunden mit idiopathischer Epilepsie und 8 Serum- und 4 Liquorproben von Hunden mit verschiedenen immunologischen Erkrankungen (z.B. autoimmunhämolytische Anämie (AIHA) oder Myositiden).
3.4.3 Kontrollgruppe
Untersucht wurden insgesamt 39 Hunde ohne Allgemeinerkrankungen.
10 Serumproben stammten von klinikeigenen, klinisch gesunden Beaglen, die im Rahmen einer routinemäßigen Blutuntersuchung entnommen wurden.
19 Serum- und 10 Liquorproben stammten von Klinikpatienten. Diese waren bei der Allgemeinuntersuchung und labordiagnostischen Untersuchung unauffällig und wurden in der Klinik behandelt wegen akut aufgetretener, nichtinfektiöser und lokaler Erkrankungen (z.B. Lahmheiten, Frakturen, Biss- oder Unfallverletzungen, Lipome, Cauda equina oder Diskusprolapse). 10 Serumproben wurden klinisch und labordiagnostisch gesunden Blutspenderhunden entnommen.
42 Tab. 3.1: Übersicht über das Patientenmaterial
Art der Erkrankung Anzahl der untersuchten Patienten
SRMA 46
bakterielle Enzephalitiden 14
virale Enzephalitiden 8
GME 8
tumoröse Erkrankungen 30
idiopathische Epilepsie 5
immunologische Erkrankungen 8
Kontrollgruppe 39
3.5 Untersuchungsmethoden
3.5.1 Gewinnung des Serums
Blutproben wurden aus der Vena cephalica antebrachii bzw. der Vena saphena lateralis entnommen, bei 1500 x g für 10 min zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Das Serum wurde aliquotiert und bei - 20 °C gelagert.
3.5.2 Gewinnung des Liquor cerebrospinalis
Der Liquor cerebrospinalis wurde unter Vollnarkose aus der Cisterna magna in der atlanto-okzipitalen Region entnommen. Nach der Eiweißbestimmung, Zellzählung und Zelldifferenzierung wurde der Liquor cerebrospinalis abzentrifugiert, aliquotiert und bei - 20 °C tiefgefroren.
3.6 ELISA
Für die vorliegende Studie wurden die ELISA Varelisa MPO-ANCA und Varelisa PR3-ANCA verwendet. Diese Testverfahren sind indirekte nicht kompetitive Enzymimmunoassays der Firma Pharmacia und Upjohn zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von antineutrophilen zytoplasmatischen Antikörpern im humanen Serum oder Plasma.
43 3.6.1 Vorversuche
Die nötige Serum- und Liquorverdünnung wurde anhand von Verdünnungsreihen in Anlehnung an die humane Methode ermittelt.
In einer Reihe von Vorversuchen wurden die OD der Serumproben in einer Verdünnung von 1:10 bis 1:4000, die OD der Liquorproben in einer Verdünnung von 1:5 bis 1:200 bestimmt. Die optimale Verdünnung der Proben wurde im Hinblick auf eine gute photometrische Erfassbarkeit beurteilt.
Laut Hersteller werden humane Serum- und Plasmaproben 1:100 mit dem Probenpuffer verdünnt. Diese Verdünnung zeigte sich in den Vorversuchen auch für Hundeseren als sinnvoll, um gut messbare Ergebnisse zu erhalten. Die Liquorproben wurden nach der Durchführung entsprechender Verdünnungsreihen 1:10 verdünnt.
3.6.2 Durchführung
Die Mikrotiterplatten sind mit humaner gereinigter Myeloperoxidase bzw. Proteinase 3 beschichtet, an die im ersten Schritt die im Patientenserum vorhandenen spezifischen Antikörper binden.
Die Versuchsdurchführung fand bei Raumtemperatur (18 - 25 °C) statt, die verwendeten Lösungen, Serum- und Liquorproben wurden im Wasserbad auf 20 °C erwärmt. Die im Test enthaltenen Pufferlösungen wurden nach Anleitung verdünnt.
50 ml Waschpuffer (20x PBS-Konzentrat (mit 0,1 % (w/v) Natriumazid)) wurde mit 950 ml destilliertem Wasser versetzt. 20 ml Probenpuffer (5x PBS Konzentrat (mit BSA und 0,1 % (w/v) Natriumazid)) wurde mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt.
Die Mikrotiterplatte wurde einmal mit dem PBS-Waschpuffer gewaschen und auf Zellstoff ausgeklopft. Die Serumproben wurden mit dem Probenpuffer 1:100, die Liquorproben 1:10 verdünnt. Jeweils 100 µl wurde in die Kavitäten pipettiert, für ca.
30 sec auf dem Plattenrüttler vermischt und danach 30 min in einer feuchten Kammer bei 20 °C inkubiert. Die Reagenzien wurden ausgeklopft, die Platten 3 mal mit Waschpuffer ausgewaschen und nach jedem Waschgang gründlich auf Zellstoff ausgeklopft. Als enzymmarkierter Antikörper wurde Peroxidase gebundenes polyklonales anti-Hund-IgG genutzt. Das gefriergetrocknete Konjugat wurde in 1 ml
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destilliertem Wasser in Lösung gebracht und für den Versuch mit dem Probenpuffer 1:100 verdünnt. 100 µl Konjugat wurde jeweils in die Mikrotiterplattenvertiefungen pipettiert, 30 sec auf dem Rüttler vermischt und 30 min in einer feuchten Kammer bei 20 °C inkubiert. Nach dem Waschen der Platten wurde 100 µl des Enzymsubstrates (TMB (3,3',5,5' Tetramethylbenzidin)) in die Kavitäten pipettiert und 10 min in einer feuchten Kammer bei 20 °C im Dunkeln inkubiert. Danach wurden 50 µl Stoplösung (0,5 M H2SO4) in die Vertiefung gefüllt und nach 10 - 30 min weiterer Inkubation in einer feuchten Kammer im Dunkeln bei 20 °C die optischen Dichten bei 450 nm mit einem Mikrotiterplattenphotometer (MR 5000) mit Hilfe des Programms MicroWin bestimmt.
3.6.3 Auswertung
Als Referenzserum galt das positive Kontrollserum. Dieses wurde von einem Hund (s. Tab. 9.2.4, Patient 47) gewonnen, bei dem aufgrund der klinischen Symptome (Fieber, steife Kopf-Halshaltung und Hyperästhesien) und der Laborwerte (hochgradige neutrophile Pleozytose im Liquor cerebrospinalis, erhöhte systemische und intrathekale IgA-Werte und kein Nachweis von Krankheitserregern) SRMA diagnostiziert wurde. Dieser Patient war zum Zeitpunkt der Blut- und Liquorentnahme nicht medikamentös vorbehandelt. In Vorversuchen in der indirekten Immunfluoreszenz und im ELISA zeigte der Hund deutlich ANCA-positive Ergebnisse. Die optische Dichte (OD) der ELISA-Ergebnisse dieses Patienten entsprach der OD der humanen Positivkontrolle des ELISA. Das Serum des Hundes wurde aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
Der OD-Wert dieses Serums wurde gleichgesetzt mit einem fiktiven OD-Wert von 100. Anhand dieses Wertes wurden die OD-Werte der übrigen Probenextinktionen als prozentuale Relationswerte berechnet. Damit konnte die intertestale Streuung der OD-Werte, die aufgrund des äußerst sensibel auf schon geringe Abweichungen in Umgebungstemperatur, Lichteinfall oder Luftfeuchtigkeit reagierende Enzym Peroxidase entstehen, vermieden werden.
