Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1) bei steril-eitriger Meningitis-Arteriitis (SRMA) des Hundes

Aus der Klinik für kleine Haustiere und

dem Institut für Pathologie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Transforming Growth Factor-β

(TGF-β

) bei

steril-eitriger Meningitis-Arteriitis (SRMA) des Hundes

I N A U G U R AL - D I S S E R T A T I O N

Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Meike Bammert

aus Melle

Hannover 2001

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Andrea Tipold

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Andrea Tipold 2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. Ulrich Ebert

Tag der mündlichen Prüfung: 29.05.2001

Meinen Eltern

INHALTSVERZEICHNIS

Seite

I. Einleitung 1

II. Literaturübersicht 3

1. Steril-eitrige Meningitis-Arteriitis des Hundes (SRMA) 3

1.1 Allgemeiner Überblick 3

1.2 Erscheinungsbild und Diagnose 4

1.3 Therapie 6

1.4 Prognose 8

1.5 Ätiologie und Pathogenese 9

2. Immunglobulin A (IgA) 13

2.1 Vorkommen und Synthese im Körper 13

2.2 Funktion und Bedeutung im Körper 19

2.3 Vorkommen, Synthese und Bedeutung im ZNS 20

3. Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1) 22

3.1 Allgemeiner Überblick 22

3.2 Gensequenz, Struktur und Aktivierung 22

3.3 Signaltransduktion 25

3.4 Effekte im Körper 27

3.5 Effekte im ZNS 32

3.6 Therapeutischer Einsatz 33

4. Untersuchung des Liquor cerebrospinalis 35

4.1 Allgemeiner Überblick 35

4.2 Proteingehalt 35

4.3 Zellzahl 36

4.4 Zellbild 36

4.5 Spezielle Untersuchung 37

5. Sandwich-Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (S-ELISA) 39

5.1 Allgemeiner Überblick 39

5.2 Entwicklung eines S-ELISAs zum Nachweis von TGF-β₁ 39

5.3 Bewertung eines ELISAs 41

III. Material und Methode 43

1. Material 43

1.1 Patientenmaterial der ELISA-Messungen 43

1.1.1 Hunde mit SRMA 43

1.1.2 Hunde mit anderen entzündlichen oder tumorösen Erkrankungen des ZNS 43

1.1.3 Negative Kontrolltiere 44

1.2 Gewebe für immunhistochemische Untersuchungen 46

1.3 Antikörper und Reagenzien 46

1.3.1 Antikörper und Reagenzien des ELISAs zur TGF-β₁-Messung 46

1.3.2 Antikörper und Reagenzien der Immunhistochemie 47

1.4 Chemikalien 47

1.4.1 Chemikalien des ELISAs zur TGF-β₁-Messung 47

1.4.2 Chemikalien der Immunhistochemie 47

1.5 Lösungen und Puffer 48

1.5.1 Lösungen und Puffer des ELISAs zur TGF-β₁-Messung 48

1.5.2 Lösungen und Puffer der Immunhistochemie 49

2. Methode 50

2.1 Durchführung des ELISAs zur Messung von TGF-β₁ 50

2.1.1 Testprinzip des Sandwich-ELISAs 50

2.1.2 Testdurchführung 51

2.1.3 Aktivierung der Proben 53

2.1.4 Verdünnungen 53

2.1.5 Standard 54

2.2 Kontrollen des ELISAs zur TGF-β₁-Messung 54

2.2.1 Untersuchung auf Kreuzreaktivität 54

2.2.1.1 Sequenzvergleich: humanes TGF-β₁ – canines TGF-β₁ 54

2.2.1.2 Vergleich des TGF-β1-Gehaltes: humanes Serum – canines Serum 55

2.2.1.3 Immunhistochemie 55

2.2.2 Untersuchung der Genauigkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit des Testkits 59

2.2.2.1 „Spicken“ von Proben und Lösungen mit bekannten Konzentrationen eines humanen, natürlichen TGF-β₁(Genauigkeit) 59

2.2.2.2 Vergleich der Messungen intra- und interassay (Präzision und Reproduzierbarkeit) 59

2.3 Durchführung des ELISAs zur Messung von IgA 60

2.4 Statistische Auswertung 60

2.5 Berechnung der Spezifität und Sensitivität der Messung von intrathekalem TGF-β₁ 61

IV. Ergebnisse 62

1. Auswertung des ELISAs zur TGF-β₁-Messung 62

1.1 Untersuchung auf Kreuzreaktivität 62

1.1.1 Sequenzvergleich: humanes TGF-β₁ – canines TGF-β₁ 62

1.1.2 Vergleich des TGF-β₁-Gehaltes: humanes Serum – canines Serum 62

1.1.3 Auswertung der Immunhistochemie 62

1.1.3.1 Entwicklung der immunhistochemischen Methode zum Nachweis von TGF-β1 62

1.1.3.2 Anwendung der entwickelten immunhistochemischen Methode auf das ZNS 63

1.1.3.3 In-situ-Hybridisierung 64

1.2 Genauigkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit des Testkits 67

1.2.1 Berechnung der Genauigkeit 67

1.2.2 Berechnung von Präzision und Reproduzierbarkeit 68

2. Resultate der Konzentrationsbestimmungen von TGF-β₁ und IgA in Serum- und Liquorproben von Hunden mit SRMA im Vergleich zu gesunden Hunden und Hunden mit anderen ZNS-Erkrankungen 70

2.1 TGF-β₁-Konzentration im Serum 70

2.2 TGF-β₁-Konzentration im Liquor cerebrospinalis 72

2.3 IgA-Konzentration im Serum 72

2.4 IgA-Konzentration im Liquor cerebrospinalis 72

2.5 Spezifität und Sensitivität der Messung von intrathekalem TGF-β₁ 77

2.6 Korrelationen 78

3. Ergebnisse der Konzentrationsbestimmungen von intrathekalem TGF-β₁ und IgA bei SRMA-Patienten im Verlauf einer Behandlung mit Glukokortikosteroiden 80

V. Diskussion 84

1. Methode zur Konzentrationsbestimmung von caninem TGF-β₁ in Serum und Liquor cerebrospinalis 84

2. Resultate der Messungen 87

2.1 TGF-β₁ und IgA in Serum und Liquor cerebrospinalis bei Hunden mit SRMA, neurologisch gesunden Hunden und Hunden mit anderen entzündlichen oder tumorösen Erkrankungen des ZNS 87

2.2 Wirkung der Glukokortikosteroidtherapie auf die systemischen und intrathekalen Konzentrationen von TGF-β₁und IgA 94

3. Pathogenese der steril-eitrigen Meningitis-Arteriitis 97

VI. Zusammenfassung / Summary 102

VII. Literaturverzeichnis 106

VIII. Anhang 127

1. Protokolle 127

1.1 Methode zum immunhistochemischen Nachweis von TGF-β₁im ZNS 127

1.2 ELISA-Protokoll zur Messung von IgA 129

2. Tabellen 131

3. Abbildungen 137

IX. Danksagung 138

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen:

µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer Abb. Abbildung

ABC Avidin and Biotinylated horseradish peroxidase

macromolecular Complex

ADCC Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität, antibody- dependent cellular cytotoxicity

AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol

BE bakterielle Enzephalitis

BMP bone morphogenetic protein

BSA Bovines Serum Albumin

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

ca. circa

CD Cluster of Differentiation

C_H konstante Domäne der schweren Kette eines

Immunglobulins

CNS Central Nervous System

Co-Smad Partner-Smad CSF Cerebrospinal fluid, Liquor cerebrospinalis

CV Variationskoeffizient (%)

DAB 3,3’Diamino-benzidin-tetrahydrochlorid Dihydrat

d.h. das heißt

DNS Desoxyribonukleinsäure EAE experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis

EGF Epidermal Growth Factor

EIA Enzymimmunassay ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

et al. und andere

evtl. eventuell Fa. Firma g Gramm

GME Granulomatöse Meningoenzephalomyelitis

HE-Färbung Hämatoxylin-Eosin-Färbung

HEPES N-[2-Hydroxyethyl]Piperazin-N’-2-Ethansulfonsäure

H₂NaO₄P Natriumdihydrogenphosphat

H₂O Wasser

H₂O₂ Wasserstoffsuperoxid

HRP Horseradish-Peroxidase

H₂SO₄ Schwefelsäure

HSP Henoch-Schönlein Purpura

IFN Interferon Ig Immunglobulin IgA-N IgA-Nephropathie IL Interleukin

I-Smad inhibierendes Smad

KCl Kaliumchlorid kDa Kilodalton kg Kilogramm KH₂PO₄ Kaliumdihydrogenphosphat

KM Körpermasse

LAP latency-associated protein

LTBP latent TGF-β binding protein

log Logarithmus

m molar, Molarität

mAb monoklonaler Antikörper

mg Milligramm ml Milliliter

mm³ Kubikmillimeter

mM millimolar, Millimolarität

mRNS Messenger-Ribonukleinsäure

n Anzahl, Menge

N normal, Normalität

NaCl Natriumchlorid

Na₂HPO₄ Natriumhydrogenphospat

NaN₃ Natriumacid

NaOH Natronlauge ng Nanogramm nm Nanometer Nr. Nummer

OPD o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid

PBS Phosphate-Buffered Saline, phosphatgepufferte Salz-

lösung

PDGF Platelet-derived Growth Factor

pg Picogramm

pH Potentia hydrogenii

Pro-TGF-β latente Form des TGF-β

Q1 unteres Quartil

Q3 oberes Ouartil

r Produktmoment-Korrelationskoeffizient nach Pearson RNS Ribonukleinsäure

r_s Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman

R-Smad Rezeptor-reguliertes Smad

±s Standardabweichung des arithmetischen Mittelwertes SE Sensitivität

S-ELISA Sandwich-Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Smad zusammengesetzt aus Sma (small body size) und Mad (mother against dpp)

SP Spezifität

SRMA steroid-responsive Meningitis-Arteriitis bzw. steril-eitrige Meningitis-Arteriitis

Tab. Tabelle

TβR Rezeptor für TGF-β

TGF-β Transforming Growth Factor-β

TNF Tumor Nekrose Faktor

TRS Target Retrieval Solution

TUF Target Unmasking Fluid

u.a. unter anderem

VE virale Enzephalitis

V_HDJ_H Gene der variablen Region der schweren Kette eines Immunglobulins

WHO World Health Organization, Weltgesundheitsorganisation

x arithmetischer Mittelwert

z.B. zum Beispiel

ZNS Zentrales Nervensystem

z.T. zum Teil

I. Einleitung

Die steril-eitrige Meningitis-Arteriitis, die im deutschen und englischen Sprachraum auch unter „steroid responsive meningitis-arteriitis“ (SRMA), „canine juvenile polyarteriitis syndrome“ und „Beagle pain syndrome“ bekannt wurde, ist eine höchst schmerzhafte Krankheit der Meningen noch unbekannter Ätiologie. Sie kommt weltweit bei Hunden vor und gilt als anerkanntes Tiermodell für Vaskulitiden unbekannter Genese des Menschen, wie zum Beispiel das Kawasaki-Syndrom.

Klinisch werden zwei Formen dieses Krankheitsbildes unterschieden: Die klassische Form ist durch steife Kopf-/Halshaltung, Schmerzen, Fieber und neutrophile Pleozytose im Liquor cerebrospinalis (CSF) charakterisiert. Bei der zweiten, atypischen, mehr protrahiert verlaufenden Form treten zusätzlich vermehrt neurologische Ausfälle auf, und im Liquor cerebrospinalis werden vor allem mononukleäre Zellen gefunden.

Die Symptomatik ist auf eine eitrige Meningitis sowie entzündlich-stenotische Gewebeveränderungen der Arterien, besonders im Bereich der spinalen Meningen, aber auch der Koronar- und Mediastinalarterien zurückzuführen. Die Ursache der Prädilektion der Erkrankung für die Meningealarterien und Meningen ist bisher nicht bekannt.

Bezüglich der Ätiologie wird ein noch unbekannter Umweltfaktor vermutet, der eine Dysregulation des Immunsystems induziert. Diese führt neben einer vermehrten intrathekalen Synthese von Immunglobulin (Ig) G zu einer deutlich erhöhten, unkontrollierten, intrathekalen sowie systemischen Produktion von Immunglobulin A. Als Begleiterscheinung bewirkt ein chemotaktischer Stimulus eine massive Invasion von Entzündungszellen in die Meningen und Blutgefäße, in deren Folge es zur Schädigung des Gewebes und somit zur Manifestation klinischer Symptome kommt.

Die Ursache für diese erhöhte IgA-Synthese ist nicht bekannt. Eine mögliche Erklärung wäre eine gesteigerte Produktion des Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1) durch Meningealzellen oder Entzündungszellen. Dieses Zytokin bewirkt einen Isotypwechsel von IgM zu IgA.

Ziel dieser Arbeit war es, die intrathekale und systemische Produktion von TGF-β1 von an SRMA erkrankten Hunden im Vergleich zu neurologisch gesunden als auch andersartig neurologisch erkrankten Tieren zu ermitteln. Damit sollte die Frage beantwortet werden, ob dieses Zytokin hauptverantwortlich für die überschießende IgA-Produktion bei SRMA ist und ob eine Blockierung dieses Zytokins die Krankheit beeinflussen könnte. Die TGF-β1- Synthese sowie die intrathekale und systemische IgA-Produktion wurden daher auch im

Verlauf gemessen und der Einfluß einer Behandlung mit Glukokortikosteroiden untersucht.

Das biologisch aktive TGF-β₁ wurde im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe eines ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)-Systems vom „Sandwich“-Typ im Liquor cerebrospinalis und im Serum nachgewiesen.

Als Kontrolle für den ELISA dienten immunhistochemische Untersuchungen sowie die Bestimmung von TGF-β₁-mRNS mit Hilfe der In-situ-Hybridisierung auf Gehirnschnitten von an SRMA erkrankten, euthanasierten Hunde.

II. Literaturübersicht

1. Steril-eitrige Meningitis-Arteriitis des Hundes (SRMA)

1.1 Allgemeiner Überblick

Die steril-eitrige Meningitis-Arteriitis des Hundes ist ein in der Kleintierpraxis häufig anzutreffendes Krankheitsbild (MERIC et al. 1985, 1986; PRESTHUS 1991; TIPOLD u.

JAGGY 1994). Neben der Staupe, der Granulomatösen Meningoenzephalomyelitis (GME) und der protozoären Enzephalitis gehört die SRMA zu den wichtigsten entzündlichen Erkrankungen des Zentralen Nervensystems (ZNS) beim Hund (TIPOLD 1995). Eine sehr ähnliche Krankheit, bei der zusätzlich auch das Gewebe des Rückenmarkes betroffen ist, wurde 1990 von IRVING und CHRISTMAN als „Corticosteroid-Responsive Meningomyelitis“

beschrieben. SRMA ist höchstwahrscheinlich identisch mit in Beagle-Kolonien vorkommenden Erkrankungen, die unter folgenden Namen beschrieben wurden: „Beagle Pain Syndrome“ (HAYES et al. 1989), „Necrotizing Vasculitis“ oder „Polyarteriitis“

(HARCOURT 1978; STEJSKAL et al. 1982; BROOKS 1984; SCOTT-MONCRIEFF et al.

1992), „Canine Pain Syndrome“ (BURNS et al. 1991) und „Canine Juvenile Polyarteriitis Syndrome“ (FELSBURG et al. 1992).

Neben seiner klinischen Bedeutung in der täglichen Praxis gilt die SRMA beim Hund als Tiermodell für beim Menschen vorkommende Vaskulitiden unbekannter Genese wie z.B. für das sogenannte Kawasaki-Syndrom (BURNS et al. 1991; FELSBURG et al. 1992), die Polyarteritis nodosa und die Infantile Polyarteritis (LIE 1990). Auch die IgA-Nephropathie und die Henoch-Schönlein-Purpura zeigen große Ähnlichkeiten zu SRMA (COPPO et al. 1982;

CASANUEVA et al. 1990; CEDERHOLM et al. 1991; O’DONOGHUE et al. 1992).

Die steril-eitrige Meningitis-Arteriitis kommt weltweit bei Begleithunden vor. Eine Prädisposition für Berner Sennenhunde (MERIC et al. 1985; KÄLIN et al. 1987; PRESTHUS 1991; TIPOLD u. JAGGY 1994), Beagle (HARCOURT 1978; STEJSKAL et al. 1982;

BROOKS 1984; HAYES et al. 1989; RUBEN et al. 1989; FELSBURG et al. 1992; SNYDER et al. 1995) und Boxer (PONCELET u. BALLIGAND 1993; TIPOLD u. JAGGY 1994) liegt eindeutig vor. Es kann jedoch grundsätzlich jede Rasse betroffen sein. DOUGHERTY et al.

(1991) beschreiben unter dem Namen „Juvenile-onset Polyartritis Syndrome“ ein bei Akitas auftretendes Krankheitsbild, das bei zwei von acht Tieren mit einer aseptischen Meningitis vergesellschaftet war. Bei den genannten Rassen können teilweise enge

verwandtschaftliche Beziehungen zwischen den erkrankten Tieren nachgewiesen werden, die auf einen heriditären Faktor innerhalb einer Zucht hinweisen (MERIC et al. 1986; RUBEN et al. 1989; DOUGHERTY et al. 1991; PRESTHUS 1991; SCOTT-MONCRIEFF et al. 1992;

PONCELET u. BALLIGAND 1993).

Am häufigsten sind junge adulte Hunde im Alter von 8 bis 18 Monaten betroffen, es können aber auch jüngere (vier Monate alte) sowie ältere (bis zu sieben Jahre alte) Individuen erkranken (TIPOLD 2000).

Eine Geschlechtsprädisposition liegt nicht vor (TIPOLD 2000).

Nach FELSBURG et al. (1992) ließ eine epidemiologische Studie ein vermehrtes Auftreten der Krankheit in einer Beagle-Kolonie im Frühling mit einer steigenden Fallzahl alle fünf Jahre erkennen. Bezüglich dieses Phänomens wurden Parallelen zum Kawasaki-Syndrom festgestellt, bei dem alle vier Jahre steigende Zahlen von Erkrankungen aufzuzeichnen sind (ROWLEY et al. 1988, MELISH u. HICKS 1990).

1.2 Erscheinungsbild und Diagnose

Bei der steril-eitrigen Meningitis-Arteriitis können zwei Formen unterschieden werden: eine akute klassische und eine protrahiert verlaufende atypische Form (IRVING u. CHRISMAN 1990; TIPOLD u. JAGGY 1994).

Die klassische, akut verlaufende Form stellt sich klinisch durch eine steife Kopf-Halshaltung, einen steifen Gang, eine diffuse Dolenz im Halsbereich und eine erhöhte Körperinnen- temperatur von nicht selten bis zu 42°C dar. Mit Ausnahme weniger Tiere, die nur schwache Drohreflexe und verminderte Haltungs- und Stellreaktionen aufweisen, bleibt die neurologische Untersuchung meist ohne Befund.

In der protrahiert verlaufenden Form treten neben den starken Schmerzen zusätzlich vermehrt neurologische Ausfallserscheinungen im Sinne von Rückenmarkserkrankungen oder einer multifokalen Läsion auf, die als sekundäre Veränderungen des ZNS-Parenchyms zu deuten sind (TIPOLD 2000). Diese erscheinen unter anderem in Form von Gangstörungen wie Hypermetrie, generalisierter Ataxie, Passgang, Tetra- oder Paraparese, verzögerten Haltungs- und Stellreaktionen und herabgesetzten spinalen Reflexen.

Das Krankheitsbild besitzt einen allgemein rezidivierenden Charakter, und infolge einer Reihe von Rückfällen ohne adäquate Therapie mit Glukokortikoiden kann sich aus der akuten Form ein mehr protrahierter Verlauf mit zunehmender Verschlechterung der neurologischen Ausfälle entwickeln.

Die Diagnostik der steril-eitrigen Meningitis-Arteriitis basiert auf der Kombination von klinischen Befunden, Laborergebnissen und weiteren diagnostischen Hilfsmitteln wie den bildgebenden und elektrodiagnostischen Techniken.

Die Blutuntersuchung ergibt häufig nur im akuten Krankheitsverlauf für SRMA typische Befunde. Bei diesem fallen eine Leukozytose und Neutrophilie mit Linksverschiebung sowie eine beschleunigte Senkung der Erythrozyten auf. Bei der protrahiert verlaufenden Form ist die Blutuntersuchung oft unauffällig.

Der in Vollnarkose durch zisternale Punktion entnommene Liquor cerebrospinalis (CSF=cerebrospinal fluid) zeichnet sich in der klassischen Form durch eine gering- bis mittelgradige Proteinerhöhung (positive Pandy-Reaktion ++ bis ++++) und eine hochgradige Pleozytose bis zu mehreren Tausend Zellen/µl aus. Neben einzelnen mononukleären Zellen werden vorwiegend neutrophile Granulozyten gefunden. Dieser Befund hat im deutschen Sprachraum wohl zu dem von Mikrobiologen nicht sehr geschätzten Namen „steril-eitrig“

geführt.

Im protrahierten Verlauf fallen im Liquor cerebrospinalis neben einem normalen oder schwach erhöhten Proteingehalt zumeist überwiegend mononukleäre Zellen (Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen) im Zytospinpräparat auf. Teilweise stellt sich der Liquor cerebrospinalis in der atypischen Form aber auch als normal dar, oder er weist eine geringgradige Pleozytose mit gemischtem Zellbild auf, was die Diagnose dieser Erscheinungsform oft stark erschwert (TIPOLD u. JAGGY 1994).

Die mikrobiologischen Untersuchungen des CSF sind stets negativ.

Bei beiden Formen der SRMA konnten neben einer vermehrten intrathekalen Synthese von Immunglobulin A auch erhöhte IgA-Werte im Serum gemessen werden (TIPOLD u. JAGGY 1994; TIPOLD et al. 1995). Durch die Bestimmung des intrathekalen und systemischen IgA-Spiegels kann die Diagnostik besonders in der oft schwer erkennbaren protrahierten Form stark unterstützt werden (TIPOLD u. JAGGY 1994). Diese kombinierte IgA-Erhöhung im Liquor cerebrospinalis und im Serum gilt bis dato als diagnostisch für die steril-eitrige Meningitis-Arteriitis und konnte bisher - mit Ausnahme einiger Tumore des hämatopoetischen Systems - bei keiner anderen entzündlichen Erkrankung des Nervensystems gefunden werden. Eine Differenzierung dieser Tumore (Lymphom, Myelom, Histiozytom) von SRMA ist mit Hilfe weiterführender Untersuchungen, wie z.B. bildgebenden Verfahren möglich (TIPOLD 2000).

Histopathologisch ist die SRMA durch eine teilweise schwere Meningitis charakterisiert.

Diese ist zumeist mit einer unterschiedlich ausgeprägten Arteriitis vergesellschaftet, die bis

zu schwerwiegenden Stenosen der Blutgefäße reichen kann (SNYDER et al. 1995). Die Läsionen befinden sich immer im Gewebe des ZNS, aber auch die Koronar- und Mediastinalarterien, seltener Gefäße in anderen Körperregionen können betroffen sein (TIPOLD et al. 1995).

Die akute Form der Krankheit stellt sich histologisch als eine im gesamten ZNS vorhandene, deutliche Meningitis mit Infiltrationen von Makrophagen, Plasmazellen, Lymphozyten und polymorphkernigen Zellen dar, die sich bevorzugt in der zervikalen Region zeigt. Die Läsionen der Meningealarterien bestehen aus einer Anschwellung der Nuclei in der Tunica muscularis, einer hyalinen Degeneration und einer Periarteriitis. Zusätzlich können weitere Herde einer eitrigen Entzündung mit Gefäßveränderungen und Hämorrhagien im Epiduralfett, in den äußeren Schichten der Dura mater und im Epineurium der Spinalwurzeln auftreten (TIPOLD et al. 1995).

Die protrahierte Form besitzt ein wesentlich schwächer ausgeprägtes Erscheinungsbild mit einer nur geringen Ansammlung von Entzündungszellen. In den Leptomeningen sind deutliche fibröse Zubildungen und fokale Mineralisierungen vorherrschend, und eine Verdickung der Wände der Arterien infolge einer Intimaproliferation sowie einer Fibrose führt zur Stenose der Gefäße. In einigen dieser Arterien sind in der Gefäßwand Infiltrationen von polymorphkernigen Zellen, Makrophagen und Lymphozyten, zu finden. Es kommt zur Thrombose, zur Rekanalisierung oder Mineralisierung der Gefäße (TIPOLD et al. 1995).

1.3 Therapie

Therapeutisch kommt eine mindestens sechsmonatige Langzeitbehandlung mit Gluko- kortikosteroiden zum Einsatz (Prednisolon, Prednison).

Glukokortikosteroide beeinflussen die spezifische Immunantwort beim Hund nur mäßig; als wichtigste Wirkung gilt ihr entzündungshemmender Effekt. Beim Hund, der zu den

„steroidresistenten“ Spezies gehört, kommt es durch Glukokortikosteroide nicht zur Schädigung der Lymphozyten sondern nur zu einer Lysis der Lymphoblasten. Eine Beeinflussung der B- und T-Zellen findet erst nach einer Langzeittherapie statt (TIPOLD u.

GRIOT-WENK 2000). Die entzündungshemmende Wirkung der Glukokortikosteroide basiert auf einer Hemmung der Produktion von Zytokinen, Prostaglandinen und Leukotrienen, einer Hemmung der Phagozytose, einer verminderten Monozytenausschwemmung aus dem Knochenmark sowie einer Hemmung der Neutrophilenmargination in den Gefäßen und deren Auswanderung ins Gewebe (COHN 1997; TIPOLD u. GRIOT-WENK 2000). Nach

COHN (1997) hemmen sie außerdem die Invasion von Entzündungszellen durch die Blut- Hirnschranke und führen allgemein zu einer Reduzierung der Gewebeschädigung.

CIZINAUSKAS et al. (2000) beschreiben bei Hunden mit SRMA nach Einleitung der Therapie eine schnell einsetzende Senkung der Zellzahl im Liquor cerebrospinalis, die sich bei Rezidiven wieder zu einer Pleozytose rückentwickelt. Die intrathekale Zellzahl gilt somit als sensitiver Indikator für die Effektivität der Behandlung und sollte während dieser regelmäßig überprüft werden. Die Autoren beobachteten außerdem, daß sich der IgA- Spiegel in Serum und Liquor cerebrospinalis durch eine Behandlung mit Prednisolon nicht sonderlich beeinflussen läßt und auch am Ende der Therapie noch leicht erhöhte Werte zu messen sind.

Die Dosierung der Glukokortikoide muß nach TIPOLD (2000) unter laufenden Kontrolluntersuchungen individuell eingestellt werden. Zu Beginn der Therapie sollte eine tägliche Dosis von 4 mg/kg KM über ein bis zwei Tage verabreicht werden. Für die folgenden ein bis zwei Wochen (abhängig von individuellen Kontrollen) kann die tägliche Dosierung auf 2 mg/kg KM reduziert werden. Bei regelmäßigen Kontrolluntersuchungen alle vier bis sechs Wochen nach Therapiebeginn werden Serum- und Liquorproben entnommen und untersucht. Sobald die klinische neurologische Untersuchung unauffällig ist und der Liquor cerebrospinalis normale Werte aufweist, kann die Dosierung halbiert werden bis auf diese Weise eine Dosis von 0,5 mg/kg KM/48 oder 72 Stunden erreicht wird. Bei pathologischem Liquorbefund (Pleozytose) muß die Glukokortikoiddosis beibehalten oder sogar erhöht werden, da ein die Prognose verschlechterndes Rezidiv erwartet werden muß.

Zeigen sich die Hunde nach sechs Monaten klinisch normal und wird in den letzten beiden Kontrolluntersuchungen ein unauffälliger Liquor cerebrospinalis diagnostiziert, kann die Behandlung beendet werden.

Bei Nichtansprechen der Tiere im protrahierten Stadium der Erkrankung auf eine alleinige Behandlung mit Prednisolon rät TIPOLD (2000) zu einer alternierenden Therapie mit Immunsuppressiva wie dem Purinanalogum Azathioprin (1,5-2 mg/kg KM/Tag), welches die T- und B-Zell-Antwort durch Hemmung der Lymphozytenproliferation beeinflußt (TIPOLD u.

GRIOT-WENK 2000). Das in seiner Wirkung erst nach zwei bis vier Wochen einsetzende Azathioprin verhindert nicht nur die Proliferation sich schnell teilender Zellen, sondern vermindert zusätzlich die Anzahl von Makrophagen und Monozyten und wirkt durch Beeinflussung der Leukozytenmembran entzündungshemmend. Der Effekt der Steroide auf die unspezifische Immunantwort kann in dieser Kombination mit der verminderten Lymphozytenproliferation genutzt werden. Die Nebenwirkungen beider Medikamente werden

reduziert, und bei gemeinsamer Applikation von Glukokortikosteroiden mit Azathioprin können die meist sofort wirkenden Steroide schon früher abgesetzt werden, da das Purinanalogum sozusagen die weitere Wirkung übernimmt. Bei Ansprechen auf die Therapie wird ähnlich wie bei der Behandlung mit Glukokortikosteroiden die Medikamentendosis langsam reduziert (TIPOLD u. GRIOT-WENK 2000).

Bis zum Ergebnis einer negativen bakteriologischen Untersuchung des Liquor cerebrospinalis werden anfangs häufig Antibiotika gegeben. Bei langandauernder Kortikosteroidtherapie ist wegen der Gefahr eines Magenulkus immer ein Magenschutz notwendig (TIPOLD 2000). Da es sich um eine Langzeittherapie mit hohen Dosen an Kortikosteroiden handelt, ist mit dem Auftreten von Komplikationen zu rechnen. Nach TIPOLD (2000) wird die Behandlung von 5 % der Hunde nicht vertragen. CIZINAUSKAS et al. (2000) stellten in ihrer Studie Nebenwirkungen der Glukokortikoide wie Polyurie, Polydipsie, Polyphagie und Gewichtszunahmen fest. Alle klinischen Veränderungen als auch Abweichungen im Blutbild und in der Biochemie zeigten sich nach Therapieende jedoch als reversibel.

1.4 Prognose

Die Prognose für die an der steril-eitrigen Meningitis-Arteriitis erkrankten Hunde ist allgemein als gut bis vorsichtig zu stellen (MERIC et al. 1985; IRVING u. CHRISMAN 1990;

PRESTHUS 1991; TIPOLD 2000).

Für junge Hunde im akuten Erkrankungsstadium gilt bei früh einsetzender intensiver Therapie eine relativ gute Prognose. Sie sprechen in der Regel sofort auf die Therapie an und zeigen eine rapide Besserung der Symptomatik. Je häufiger aber Schmerzschübe zu beobachten sind, desto schwieriger und langwieriger gestaltet sich die Therapie, und die Prognose wird vorsichtig. Auch in den mehr protrahiert verlaufenden Fällen mit häufigen Rezidiven ist eine vorsichtige Prognose zu stellen. CIZINAUSKAS et al. (2000) beobachteten zudem, daß ältere Hunde mit einem hohen intrathekalen IgA-Spiegel und wiederholten Rückfällen eine längere Therapiezeit benötigen und die Prognose dadurch als „vorsichtig“ zu bezeichnen ist.

1.5 Ätiologie und Pathogenese

Die Ätiologie der steril-eitrigen Meningitis-Arteriitis ist noch unbekannt. Epidemiologische Daten lassen eine Auslösung der Krankheit durch einen Umweltfaktor von eventuell infektiöser Natur vermuten. Versuche, ein Virus oder Bakterium zu isolieren, waren bis heute jedoch erfolglos (HARCOURT 1978; MERIC et al. 1986; TIPOLD 1994; TIPOLD et al. 1995).

Auch pathogenetisch gibt es noch viele Unklarheiten, die weiterer Studien bedürfen. Die deutliche Besserung der klinischen Symptomatik nach einer Therapie mit Glukokortikoiden, die pathologischen Veränderungen als auch die Laborbefunde lassen immunpathologische Mechanismen vermuten (TIPOLD et al. 1999). Wahrscheinlich führt ein noch unbekannter Stimulus zu einer Dysregulation des Immunsystems. Deren offensichtlichste Folge ist eine erhöhte systemische und intrathekale Synthese von IgA (TIPOLD et al. 1994, 1995). Die Entdeckung aktivierter T-Lymphozyten bestärkt den Verdacht eines Antigen-Kontaktes (TIPOLD 2000). Nach TIPOLD et al. (1996b) ist bei der SRMA auch ein Superantigeneinfluß nicht auszuschließen. Ein solcher wurde beim Kawasaki-Syndrom des Menschen kürzlich vermutet, konnte aber nicht eindeutig bewiesen werden (ABE et al. 1992, 1993; PIETRA et al. 1994).

Das pathohistologische Bild der betroffenen Gefäße zeigt bei der protrahierten Form der steril-eitrigen Meningitis-Arteriitis große Ähnlichkeiten mit den durch Immunkomplex- krankheiten entstehenden Gefäßveränderungen (TIPOLD et al. 1999). TIPOLD et al. (1995) entdeckten bei sechs von zehn an SRMA chronisch erkrankten Hunden zirkulierende IgG-Immunkomplexe im Serum. Das eindeutige Vorliegen von Immunglobulinablagerungen in den Blutgefäßen konnte bisher jedoch noch nicht bewiesen werden (HARCOURT 1978;

SPENCER u. GREAVES 1987; HAYES et al. 1989; SCOTT-MONCRIEFF et al. 1992;

TIPOLD et al. 1995). Die Studie von TIPOLD et al. (1995) zeigte, daß die meningealen Veränderungen bei SRMA eine Primärläsion darstellen und die Erkrankung nicht infolge einer generalisierten Immunkomplexerkrankung entsteht.

In der Literatur sind ebenfalls die in Beagle-Kolonien gemachten Beobachtungen von Amyloidablagerungen in verschiedenen Organen erwähnt (HARCOURT 1978; HAYES et al.

1989; SNYDER et al. 1995). SNYDER et al. (1995) erklären diese als eine infolge wiederholter Entzündungsschübe entstandene sekundäre Erscheinung. Als seltene, ebenfalls in Beagle-Kolonien erhobene Befunde gelten rheumatoide Faktoren (HAYES et al.

1989), antineutrophile zytoplasmatische Antikörper (FELSBURG et al. 1992) sowie antinukleare Antikörper (RUSSO et al. 1983) und ein positiver Lupus erythematosus-Test (RUSSO et al. 1983; MERIC et al. 1985).

IgA scheint bei der Pathogenese der SRMA eine zentrale Rolle zu spielen. Ähnliches wird für einige in der Humanmedizin vorkommende Immunkrankheiten wie das Kawasaki-Syndrom (FELSBURG et al. 1992), die Henoch-Schönlein-Purpura und die IgA-Nephropathie (CASANUEVA et al. 1990) vermutet, bei denen ebenfalls hohe IgA-Spiegel nachgewiesen werden konnten. Die im Liquor cerebrospinalis gemessene Erhöhung des IgG-Index (TIPOLD u. JAGGY 1994; TIPOLD et al. 1994) weist auf eine intrathekale Synthese von IgG hin, was als eine zum Teil spezifisch gegen das ZNS gerichtete Immunantwort gedeutet werden kann (TIPOLD 2000). Immunhistochemisch konnte gezeigt werden, daß auch IgA und IgM intrathekal produziert werden (TIPOLD et al. 1994; TIPOLD et al. 1995).

Eine Dysregulation des Immunsystems, die zu einer massiven IgA-Synthese führt, kann z.B.

durch einen Shift in der T-Zell-Subpopulation mit einer daraus resultierenden veränderten Interaktion zwischen den T- und den B-Zellen oder durch ein verändertes Zytokin-Muster hervorgerufen werden. TIZARD (2000, S. 373) vermutet, daß autoimmune Prozesse zu einer lokal erhöhten IgA-Synthese führen können.

Eine durch T-Zellen veränderte Regulation der Antikörpersynthese bei der Henoch- Schönlein-Purpura wurde von FEEHALLY (1988), KNIGHT (1990) und BEALE et al. (1982;

1983) beobachtet. Auch bei der IgA-Nephropathie konnte aufgrund einer defekten T-Zell-Suppressor-Funktion (SAKAI et al. 1979, CAGNOLI et al. 1985; CASANUEVA et al.

1990) oder einer erhöhten T-Helferzell-Aktivität (CAGNOLI et al. 1985; SAKAI et al. 1982) eine erhöhte IgA-Synthese beobachtet werden.

FELSBURG et al. (1992) beschreiben eine bei der SRMA auftretende abnorme Immunantwort, die sich in Form eines systemisch erhöhten IgA-Spiegels, einer erhöhten peripheren B-Zellzahl und einer erniedrigten totalen peripheren T-Zellzahl darstellt.

Zusätzlich wurden aktivierte Monozyten/Makrophagen, eine deutliche Suppression der blastogenen Antwort auf eine mitogene Stimulation sowie die Unfähigkeit, nach einer polyklonalen Aktivierung Immunglobulin-produzierende Plasmazellen zu bilden, entdeckt.

Die Autoren sehen in diesen immunregulatorischen Abnormitäten große Ähnlichkeiten zu den bei Kindern während der akuten Phase des Kawasaki-Syndroms auftretenden immunologischen Veränderungen.

Eine kürzlich beschriebene Studie (TIPOLD et al. 1999) beschäftigt sich ebenfalls mit der Verteilung der T- und B-Lymphozyten bei der steril-eitrigen Meningitis-Arteriitis. Die Verteilung der T- und B-Zellen ist allgemein von der Ätiologie einer neurologischen Krankheit, bei SRMA zusätzlich auch vom Ort der Läsion abhängig: Bei der steril-eitrigen Meningitis-Arteriitis sind, ähnlich wie bei der bakteriellen und der protozoären Enzephalitis, in

den Meningealläsionen und im peripheren Blut die B-Zellen vorherrschend. Dagegen sind in den entzündeten Arterien SRMA-spezifisch als einzige Lymphozyten-Subpopulation T-Zellen anzutreffen. In den Wänden dieser Gefäße konnte zu einem späteren Zeitpunkt der Erkrankung eine diffuse Infiltration von Immunglobulinen (IgG, IgA, IgM) nachgewiesen werden, was eine Beteiligung von Immunkomplexen im fortgeschrittenen Stadium vermuten läßt (TIPOLD et al. 1995).

Die Ähnlichkeiten zwischen SRMA und anderen ZNS-Erkrankungen des Hundes bestärkt die Autoren in der Vermutung, daß die steril-eitrige Meningitis-Arteriitis durch einen unbekannten Umweltfaktor oder einen anderen Stimulus ausgelöst wird. Nach Einsatz der Gewebeveränderungen im ZNS führen wahrscheinlich multiple Mechanismen zu einer Dysregulation des Immunsystems, die unter anderem zur Aktivierung bestimmter Leukozyten-Pools und damit auch zu einer erhöhten Immunglobulin-Produktion beiträgt.

Die Prädilektion der steril-eitrigen Meningitis-Arteriitis für die Meningealarterien und die Meningen ist bislang noch nicht vollständig geklärt. Die Mechanismen, die zu einer spezifischen Invasion von Leukozyten-Subpopulationen in das ZNS führen, sind vermutlich im Gewebe des ZNS selbst zu suchen. Daran beteiligt sind nachweislich im ZNS produzierte chemotaktische Faktoren (BURGENER et al. 1998) und aller Wahrscheinlichkeit nach ebenfalls Vorgänge, die eine Veränderung der Blut-Hirnschranke (LACY et al. 1995;

SPRENGER et al. 1996) und eine atypische Expression von Selektinen und Integrinen (GRANGER u. KUBES 1994) bewirken.

BURGENER et al. (1998) erkannten, daß die chemotaktische Aktivität für polymorphkernige Zellen bei SRMA in positiver Korrelation zum Interleukin (IL) 8 - bzw. IgA-Gehalt im Liquor cerebrospinalis steht und zudem zum Behandlungserfolg korreliert: Hunde mit schlechter klinischer Heilung und häufigen Rezidiven zeigten eine erhöhte chemotaktische Aktivität im Liquor cerebrospinalis, die bei gutem Therapieerfolg jedoch deutlich niedriger war. Durch die Behandlung mit Glukokortikoiden wurde die Invasion von Entzündungszellen durch die Blut- Hirnschranke gehemmt. Auf die chemotaktische Aktivität zeigten die Glukokortikosteroide jedoch keine Wirkung. Die Autoren sehen die intrathekale Produktion von chemotaktischen Faktoren wie IL-8 und C5a als Ursache für die spezifische Einwanderung von Entzündungszellen in den Meningealraum des Zervikalmarkes an. Der Grund für die Aufrechterhaltung dieser Produktion trotz Glukokortikoidtherapie konnte jedoch nicht geklärt werden.

Vorliegende Studie soll die beschriebenen Pathogenesestudien fortsetzen und die Frage nach der Entstehung der exzessiven intrathekalen IgA-Synthese erörtern. TGF-β₁, das

neben einer Reihe anderer komplexer Funktionen als IgA-Switch-Faktor agiert (ABBAS et al.

1996, S. 308; TIZARD 2000, S.136), könnte, intrathekal produziert, diese IgA-Synthese bei Hunden mit SRMA erklären. Daher wurde die potentielle Synthese von TGF-β₁ durch Meningeal- und Entzündungszellen näher untersucht.

2. Immunglobulin A (IgA)

2.1 Vorkommen und Synthese im Körper

Immunglobulin A ist das wichtigste Immunglobulin der mukösen Immunabwehr und befindet sich normalerweise in Sekreten wie dem Speichel, der Tränenflüssigkeit, dem Kolostrum, der Milch sowie den Sekreten des Gastrointestinal-, des Respirations- und des Urogenitaltraktes (HEREMANS 1974; TIPOLD et al. 1994; TIZARD 2000, S. 139).

Beim Hund und den meisten anderen Säugetieren gilt das IgA nach IgG und IgM quantitativ als das drittwichtigste Immunglobulin in der Zirkulation (siehe Tab. II.1). Im Hinblick auf die sekretorische Immunglobulinsynthese prädominiert es jedoch bei den monogastrischen Tierenvor allen anderen Immunglobulinen (TIZARD 2000, S. 142).

Tab. II.1: Immunglobulin-Serumspiegel beim Hund (mg/dl) (TIZARD 2000)

IgG^* IgM IgA IgE^** IgD^***

1000-2000 70-270 20-150 2,3-4,2 ?

* vier IgG-Klassen (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)

** vermutlich zwei IgE-Klassen (IgE1, IgE2)

*** wahrscheinlich vorhanden

Das canine Immunglobulin A kommt in einer monomeren und einer dimeren Form vor (DAY u. PENHALE 1988). Das monomere IgA-Molekül weist ein Molekulargewicht von 150 kDa auf. Das dimere IgA-Molekül ist mit einer J-Kette assoziierte und besitzt ein Molekulargewicht von 360 kDa (TIZARD 2000, S. 140/142) sowie eine Halbwertszeit von sechs Tagen (JUNGI 2000). Es ist in den Sekreten und im Serum prädominant und wird zum größten Teil in den Plasmazellen der Submukosa des Intestinal- und Respirationstraktes synthetisiert (HOGENESCH 1998; TIZARD 2000, S. 142).

Das vor allem in den Peyerschen Platten und in den Krypten des Darmes produzierte sekretorische IgA entsteht durch spezifische Bindung eines dimeren IgA-Moleküls an einen Poly-Immunglobulin Rezeptor, auch sekretorische Komponente genannt, und wird mit Hilfe der Transzytose durch das Zytoplasma der Epithelzellen ins Darmlumen befördert. Die sekretorische Komponente schützt es dort vor der Verdauung durch intestinale Proteasen (TIZARD 2000, S. 142).

Das dimere Serum-IgA stammt nach VAERMAN und HEREMANS (1970) aus den

Plasmazellen der Schleimhäute des Darmes, der Atemwege, der Konjunktiven und des Genitaltraktes. Diese Autoren sahen damals eine im caninen Serum bestimmte IgA- Konzentration als Maß für die tatsächliche IgA-Syntheseleistung der Submukosa des Lymphgewebes an. Als genauerer Maßstab für eine lokale IgA-Synthese gilt heute jedoch die Bestimmung dieses Immunglobulins in den Sekreten wie zum Beispiel der Tränenflüssigkeit (GINEL et al.1993b).

Die Mehrzahl der Vorläuferzellen der IgA-produzierenden Plasmazellen stammt aus den Peyerschen Platten des Kolons. Nach einer Stimulierung durch Antigene des Darmlumens gelangen die Zellen über die Lymphgefäße ins Blut, in die Milz und die Leber und wandern danach entweder zum Darm zurück oder migrieren in die verschiedenen Schleimhautgewebe des Körpers (HUSBAND et al. 1996; TIZARD 2000, S. 225/226) (siehe Abb. II.1). Durch spezifische Rezeptor-Liganden-Interaktionen am Endothel wird nach NAKACHE et al. (1989) ein selektiver Eintritt der IgA-Plasmazell-Vorläuferzellen in die Submukosa der Schleimhäute gefördert. Ihre anschließend erfolgende Speicherung, Proliferation und Immunglobulinsekretion wird durch Zytokine gesteuert (HUSBAND et al.

1996; TIZARD 2000, S. 227/228).

Abb. II.1: Verteilung stimulierter IgA-produzierender B-Zellen (modifiziert nach TIZARD (2000))

Nach ESSER und RADBRUCH (1990) stellt sich die humorale Immunantwort anfangs nur durch die Produktion von IgM dar und wird anschließend - je nach ihrem Typ - durch die Synthese verschiedener Immunglobulin-Isotypen charakterisiert. Das Isotypenmuster hängt dabei von der Art der B-Zell-Aktivierung ab, die in erster Linie durch das Antigen, den Immunisierungsweg und die regulierenden Zellen bestimmt wird.

Ein Wechsel der B-Zell-Expression von IgM zu einem anderen Isotypen findet auf chromosomaler Ebene in Form eines sogenannten Klassensprunges (Class Switching) bzw.

Isotypwechsels (isotype switching) statt. Dabei erfolgt eine Änderung der Gene in der konstanten Region der schweren Kette (C_H), indem bestimmte DNS-Sequenzen (C_H-Gene und deren Switch- oder Schalterregionen) herausgeschnitten werden. Die Gene für die variable Region (V_HDJ_H) werden mit einer anderen, stets 3‘-wärts liegenden Switchregion, die einem jeden C_H-Gen vorgelagert ist und den anderen gegenüber eine gewisse Homologie zeigt, liiert, und eine intakte, sequenzspezifisch rekombinierte Transkriptions- einheit für die schwere Kette eines neuen Isotyps entsteht. Der V_HDJ_H-Block und demzufolge auch die Antigen-Spezifität des betreffenden Antikörpers bleiben dabei unverändert.

Ein Klassensprung kann sich zu jedem Zeitpunkt während der B-Zell-Ontogenese ereignen, tritt jedoch besonders häufig bei der Bildung von naiven B-Zellen (Switch der Expression von IgM zu IgM/IgD) und bei der Aktivierung der B-Zellen (Switch der Expression von IgM oder IgM/IgD zu IgA, IgG oder IgE) auf. Die meisten B-Zellen vollziehen den Isotypwechsel direkt von der Expression des IgM zur Expression von IgA, IgG oder IgE (Saltatory Switch). So werden beim Klassensprung von der IgM- zur IgA-Synthese beispielsweise die DNS- Sequenzen C_µ bis C_ε entfernt (siehe Abb. II.2). Es können aber auch mehrere Isotypwechsel hintereinander auftreten, wobei aufgrund der deletierten Frequenzen stets eine 3‘-wärts gerichtete Folge eingehalten wird und der Wechsel immer von der rekombinanten Schalterregion aus erfolgt.

Für die Induktion eines Class Switching einer B-Zelle sind nach TIZARD (2000, S. 145) zwei Signale notwendig: Erstens erhält die B-Zelle ein Aktivierungssignal durch die Bindung ihres Oberflächenmarkers CD 40 an den Oberflächenmarker CD 154 einer T-Helferzelle (T_H-Zelle). Zweitens wird die Art des spezifischen Klassenwechsels durch bestimmte Zytokine, speziell IL-4, TGF-β₁ und Interferon-γ (IFN-γ) reguliert. Die Signale der Oberflächenmarker und des Antigens aktivieren die Rekombinase der B-Zelle, die Zytokine aktivieren die Promotorregion und setzen die Rekombinase an einer spezifischen Switchregion an.

Abb. II.2: Klassensprung von der IgM- zur IgA-Expression (modifiziert nach TIZARD (2000))

Während die T_H1-Zellen und deren Zytokine, wie bei Nagern nachgewiesen, vor allem für die zelluläre Immunität zuständig sind, fördern die in lymphoidem Schleimhautgewebe dominierenden TH2-Zellen (XU-AMANO et al. 1994; TIZARD 2000, S. 227) durch Produktion der Interleukine 4, 5, 6 und 10 die humorale Immunität (HUSBAND et al. 1996).

Der Klassensprung zu IgA wird in erster Linie durch die T_H2-Zellen und deren Zytokine bestimmt. TGF-β₁ besitzt eine Schlüsselfunktion und löst den Switch zur IgA-Produktion aus (siehe Abb. II.3). In Abwesenheit anderer Stimuli induziert das Zytokin in ruhenden B-Zellen einen Isotypwechsel von IgM nach IgA und führt so zu einer vermehrten IgA-Sekretion (TIZARD 2000, S. 227-230). IL-6 ist für eine letzte Differenzierung der B-Zellen zu IgA- produzierenden Plasmazellen, deren Proliferation und somit für die Aufrechterhaltung der IgA-Antwort notwendig. Infolge einer Expression von IL-4 kommt es zu einer Kaskade der T_H2-Zytokine. Das T_H1-Zytokin IL-2, aber auch die T_H2-Zytokine IL-5 und IL-10 fördern

ebenfalls die IgA-Sekretion, wohingegen das von T_H1-Zellen produzierte IFN-γ eine

Verminderung der IgA-Expression bewirkt (HUSBAND et al. 1996; TIZARD 2000, S. 227/228).

Infolge einer Aktivierung ruhender B-Zellen kommt es zur Proliferation und anschließend zur Differenzierung zu Plasmazellen und Gedächtniszellen, bei einer mehrfach wiederholten Aktivierung zu einem Switch der Expression (ESSER u. RADBRUCH 1990). Die dabei auftretende Class Switch-Rekombination hängt von der Fähigkeit der Zellen zur Zellteilung ab (KATAOKA et al. 1980; RABBITTS et al. 1980; ESSER u. RADBRUCH 1990).

SEVERINSON-GRONOWICZ et al. (1979) vermuten, daß die nicht mehr proliferierenden Plasmazellen keinen Klassensprung mehr ausführen können. Sie enthalten möglicherweise sogar einen Inhibitor der Switch-Rekombination (ESSER u. RADBRUCH 1990). Die meisten Gedächtniszellen durchlaufen einen Klassensprung schon nach der primären Aktivierung (OKUMURA et al. 1976; COFFMAN u. COHN 1977; SIEKEVITZ et al. 1987).

Abb. II.3: Kontrolle der IgA-Produktion (modifiziert nach TIZARD (2000))

Junge Hunde besitzen im allgemeinen niedrige IgA-Werte im Serum, die mit zunehmendem Alter ansteigen (GLICKMAN et al. 1988; BOUCHARD et al. 1992; GINEL et al. 1993a;

TIPOLD et al. 1996a; FELSBURG 1998) (siehe Tab. II.2). In der Tränenflüssigkeit konnte ein ähnliches Verhalten der IgA-Konzentration beobachtet werden (GINEL et al. 1993a).

Der normale systemische IgA-Gehalt eines adulten Hundes wird nach TIPOLD et al. (1996a)

mit einem Alter von 15 bis 18 Monaten, laut GINEL et al. (1993a) ab einem Alter von 18 Monaten erreicht (siehe Tab. II.4).

GLICKMAN et al. (1988) berichten zudem, daß bei männlichen Tieren höhere IgA-Werte gemessen werden konnten als bei weiblichen. Dieses Phänomen wurde bisher jedoch von keinem anderen der bisher genannten Autoren bestätigt.

Bei einigen Rassen werden auffällig hohe oder niedrige IgA-Serumwerte bei klinisch nicht erkrankten Tieren gemessen (DAY u. PENHALE 1988; GRIOT-WENK et al. 1999). GRIOT- WENK et al. (1999) vermuten eine hauptsächlich genetische Beeinflussung der IgA-Werte, da Haltungsbedingungen diese Werte nicht beeinflussen.

Tab. II.2: Altersabhängige Entwicklung der IgA-Konzentration im caninen Serum (FELSBURG 1998)

Alter (Wochen) IgA-Konzentration im Serum (µg/ml)

< 1 5 ± 2

2 3 ± 1

4 4 ± 1

8 7 ± 2

12 25 ± 8

16 26 ± 9

Tab. II.3: IgA-Werte von Serum und Liquor cerebrospinalis gesunder Menschen aus der Literatur

untersuchte Körperflüssigkeit

IgA-Konzentration (µg/ml) (x± s)

Autoren

Serum 200 ± 61 AMMANN u. FUDENBERG (1982) CSF 2,05 ± 0,86 KOBATAKE et al. (1980)

CSF 0,8 ± 0,5 FISHMAN (1992)

Tab. II.4: IgA-Werte der verschiedenen Körperflüssigkeiten gesunder Hunde aus der Literatur

untersuchte Körperflüssigkeit

IgA-Konzentration (µg/ml)

(Spannweite / x ± s)

Autoren

Serum 50 - 100 WHITSBREAD et al. (1984)

35 ± 8 FELSBURG et al. (1985) 44 ± 22 DAY u. PENHALE (1988) 40 - 150 FELSBURG et al. (1992) 10,9-100,1 TIPOLD et al. (1994)

CSF 0,01 - 0,2 TIPOLD et al. (1994)

Träne 28,61 ± 1,58 GINEL et al. (1993a) 25,28 ± 1,9 GINEL et al. (1993b) Kolostrum 150-340 REYNOLDS u. JOHNSON (1970)

Milch 110-620 TIZARD (1996)

2.2 Funktion und Bedeutung im Körper

IgA gilt allgemein als das wichtigste Immunglobulin der Immunabwehr auf den Schleimhäuten des Körpers (TOMASI 1972).

Das sekretorische IgA schützt die Schleimhautoberflächen vor dem Eintreten von Mikroorganismen, verhindert die Adhäsion von Viren und Bakterien an der Epitheloberfläche, neutralisiert Viren, Toxine und Enzyme und verhindert die intrazelluläre virale Replikation sowie die Epithelpassage makromolekularer Antigene (MESTECKY et al. 1986; RITS 1989;

UNDERDOWN u. SCHIFF 1986; TIZARD 2000, S. 142, 227-230). Eine bakterizide Wirkung ist ihm jedoch nicht zuzuschreiben (TIZARD 2000, S. 142).

Die Funktion des Plasma-IgAs kann noch nicht klar gedeutet werden. Die Anwesenheit von IgA-Rezeptoren auf der Oberfläche von Blutzellen läßt eine Reihe verschiedener Funktionen vermuten. So beeinflußt der IgA-Rezeptor wahrscheinlich die Regulation der IgA-Synthese und die Entfernung von IgA-Immunkomplexen (BOGERS et al. 1991). TIZARD (2000, S. 229) und BOGERS et al. (1991) beschreiben zudem ein Agieren dieses Immunglobulins als Opsonin und als Aktivator des alternativen Weges der Komplementaktivierung sowie eine Funktion des IgAs in einigen Systemen der Antikörper-abhängigen zellulären

Zytotoxizität (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC). Beim Menschen interagiert das Immunglobulin zum Beispiel mit Phagozyten und fördert durch die Bindung an einen IgA-Rezeptor einer polymorphkernigen Zelle die Phagozytose, die H₂O₂-Sekretion und die Bildung von Lysozymen; bei Interaktionen mit Monozyten und Makrophagen kommt es zur Wachstumshemmung IgA-markierter Bakterien sowie zur H₂O₂-Sekretion (BOGERS et al.

1991). Interaktionen des IgAs mit polymorphkernigen Zellen konnten beim Hund bis jetzt nicht nachgewiesen werden (BURGENER u. TIPOLD, nicht publizierte Resultate).

Die Symptome eines systemischen IgA-Mangels bei Hund und Mensch sind vielfach beschrieben (FELSBURG et al. 1985; DAY u. PENHALE 1988; GINEL et al. 1993a; TIPOLD et al. 1996a) und beweisen die existentielle Bedeutung des IgAs für eine funktionierende Immunität.

2.3 Vorkommen, Synthese und Bedeutung im ZNS

In gesunden Individuen bestimmt normalerweise das IgG die humorale Immunantwort im ZNS (FELGENHAUER u. SCHÄDLICH 1987). Bei einer Reihe neurologischer Erkrankungen und Tumore kommt es zusätzlich zu einer starken Beteiligung von IgA (BUDKA et al. 1985;

FELGENHAUER u. SCHÄDLICH 1987; TIPOLD et al. 1994). Eine intrathekale IgA- Produktion entsteht vor allem bei Hunden mit entzündlichen Erkrankungen des ZNS, wobei die höchsten intrathekalen Werte bei an SRMA leidenden Tieren zu finden sind (TIPOLD et al. 1994). Beim Menschen wird ein Dominieren des IgA₂ bei chronisch verlaufenden Erkrankungen des ZNS mit Demyelinisierungen und Entzündungen beschrieben (BUDKA et al. 1985).

Diese Beobachtungen lassen vermuten, daß eine intrathekale Immunantwort mit IgA nicht für einen bestimmten antigenen Stimulus spezifisch ist. Eine mögliche Erklärung für die hohen IgA-Werte im ZNS wäre eine chronische IgA-Produktion infolge eines persistierenden antigenen Stimulus oder eines Defizits der regulatorischen Mechanismen für die Suppression aktivierter B-Zellen (BUDKA et al. 1985; TIPOLD et al. 1994).

Der Ursprung des erhöhten IgA-Gehaltes im ZNS ist in einer intrathekalen IgA-Synthese zu finden (WOO et al. 1993; TIPOLD et al. 1994). WOO et al. (1993) schließen die Möglichkeiten eines passiven Influxes oder eines Rezeptor-vermittelten Transportes des Immunglobulins durch die Blut-Hirnschranke aus. Bisher weiß man jedoch noch nicht, ob die IgA-produzierenden Zellen im ZNS von migrierenden Vorläuferzellen des Intestinaltraktes abstammen (TIPOLD et al. 1994), wie es in peripheren Geweben beobachtet wurde

(TIZARD 2000, S. 225/226). WOO et al. (1993) vermuten, daß ein im ZNS enthaltenes Antigen zu den zervikalen Lymphknoten und der Milz abfließt, dort anwesende B- und T-Zellen aktiviert (HARLING-BERG et al. 1989), und daß die aktivierten Lymphozyten - nach Passage der intakten Blut-Hirnschranke - im ZNS anschließend IgA synthetisieren. Nach Meinung dieser Autoren wandern die aktivierten B-Zellen wahrscheinlich als Lymphoblasten ins ZNS, das sie beim Antreffen eines spezifischen Antigens nicht wieder verlassen, und differenzieren unter Einfluß von Lymphokinen zu IgA-sezernierenden Plasmazellen. Nach TYOR et al. (1989) werden die migrierten B-Zellen erst intrathekal durch von T-Zellen produzierten Faktoren zum Klassensprung angeregt. Der transendotheliale Transport der Lymphozyten an der Blut-Hirnschranke erfolgt vermutlich durch Adhäsionsmoleküle der Endothelzellen (YEDNOCK et al. 1992)

KOBATAKE et al. (1980) entdeckten eine signifikante Korrelation der IgA-Konzentration im Serum mit der im Liquor cerebrospinalis. Des weiteren fanden diese Autoren eine signifikante Korrelation der IgA-Liquorwerte mit dem Alter und vermuten eine altersabhängige Änderung der Permeabilität der Blut-Hirnschranke für Plasmaproteine. Ein Influx von IgA durch die Blut-Hirnschranke ist jedoch äußerst unwahrscheinlich (TIPOLD et al. 1994).

Über die Rolle des Immunglobulin A im ZNS ist bisher nicht viel bekannt (BUDKA et al.

1985; TIPOLD et al. 1994). WOO et al. (1991) vermuten, daß IgA im Gehirn Antigen neutralisiert. Das nicht von Schleimhäuten stammende intrathekale IgA dient einer schwachen Opsonierung und einer schwachen Aktivierung des alternativen Weges der Komplementreaktion. Wahrscheinlich beeinflußt es auch die ADCC, die neutrophile Chemotaxe sowie die Aktivität der Natürlichen Killer-Zellen. Nach Meinung dieser Autoren könnte das intrathekale IgA möglicherweise auch zum Schutz des Zentralen Nervensystems und zum Erhalt der kritischen neuralen Funktionen beitragen.

3. Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1)

3.1 Allgemeiner Überblick

Der vor 15 Jahren erstmals beschriebene Transforming Growth Factor-β₁ (MOSES et al.

1981; ROBERTS et al. 1981) gilt als Prototyp einer Gruppe von über 20 Peptiden, die als TGF-β-Superfamilie bezeichnet wird. Dazu gehören neben TGF-β₁ und seinen Isoformen unter anderem die BMPs (bone morphogenetic proteins), das Anti-Müller Hormon (Müllerian inhibiting substance), die Aktivine und die Inhibine. Die Peptide der TGF-β-Superfamilie regulieren Zellwachstum, Zelldifferenzierung, Zelladhäsion, Zellmigration und schließlich auch den Zelltod (MASSAGUÉ et al. 1994).

TGF-β kommt in fünf Isoformen vor. Die Isoformen TGF-β_1-3 konnten in Säugetieren identifiziert werden, während die Isoformen TGF-β₄ im Huhn und TGF-β₅ in Xenopus (Krallenfrosch) exprimiert werden (LAWRENCE 1996).

Die drei Isoformen der Säugetiere sind wichtige endogene Mediatoren für Wachstums-, Erhaltungs- und Reparationsprozesse in der embryonalen, neonatalen und adulten Entwicklung (COX u. MAURER 1997). Ihre drei Haupteffekte sind: Proliferationshemmung der meisten Zellen, aber auch Wachstumsstimulierung von mesenchymalen Zellen;

immunsuppressive Effekte; Verbesserung der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix (LAWRENCE 1996).

An der Synthese der TGF-βs sind grundsätzlich fast alle Zelltypen des Körpers (ROBERTS u. SPORN 1990), in erster Linie jedoch Thrombozyten, aktivierte T- und B-Zellen, aktivierte Makrophagen, Monozyten, neutrophile Granulozyten und Fibroblasten beteiligt. TGF-β benötigt jedoch zur Ausübung seiner biologischen Wirkung eine Aktivierung, wie z.B. durch Interaktionen mit spezifischen Membranrezeptoren von T- und B-Zellen, Makrophagen und Fibroblasten (OSSEGE et al. 1996; COX u. MAURER 1997; TIZARD 2000, S. 136).

3.2 Gensequenz, Struktur und Aktivierung

Die voneinander verschiedenen Genloci der drei Isoformen des TGF-β befinden sich auf unterschiedlichen Chromosomen (LAWRENCE 1996). Die Gensequenz des caninen TGF-β₁ ist in der Genbank unter der Nummer L 34956 zu finden (MANNING et al. 1995).

Das biologisch aktive TGF-β1 besitzt eine hohe Sequenzhomologie mit den aktiven Isoformen TGF-β₂ (74 %) und TGF-β₃ (78 %) (LAWRENCE 1996). Die Expression der beiden Homodimere TGF-β₁ und TGF-β₂ wird trotz der hohen Sequenzhomologie

unabhängig voneinander reguliert (DANIELPOUR et al. 1989a), und ihre Sekretion erfolgt nur zum Teil durch gleiche Zellen (TIZARD 2000, S. 136).

Die aktive Form des TGF-β₁ ist ein 25 kDa Homodimer, dessen identische, je 12,5 kDa schwere Untereinheiten aus jeweils 112 Aminosäuren bestehen und über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Diese Untereinheiten werden als C-terminales Ende eines 390 Aminosäuren enthaltenden Vorläufermoleküls (Precursor) synthetisiert, dessen N-terminal liegende Pro-Domäne sich aus einer Signalsequenz und einem β1-LAP (latency-

associated protein) zusammensetzt. Nach Sekretion des 55 kDa Precursors in den Interzellularspalt kommt es zur Dimerisierung von zwei Untereinheiten und deren proteolytischer Spaltung vom β₁-LAB, wodurch das biologisch aktive Molekül entsteht (MASSAGUÉ 1990; MASSAGUÉ et al. 1994; DUBOIS et al. 1995; LAWRENCE 1996; COX u. MAURER 1997).

Das Enzym, das für dieses sogenannte TGF-β₁-Processing verantwortlich ist, ist vermutlich die Endoprotease Furin Convertase. Die endoproteolytische Spaltung des TGF-β₁- Vorläufermoleküls stellt möglicherweise eine Voraussetzung für die volle Aktivitätsentwicklung des Zytokins dar. Dabei ist ein fein eingestelltes Gleichgewicht des Furin-abhängigen enzymatischen Processing wahrscheinlich für ein normales physiologisches Zellwachstum bzw. eine Zelldifferenzierung erforderlich. Eine Störung des Gleichgewichtes würde dagegen zu pathologischen Abweichungen führen (DUBOIS et al.

1995).

Mit dem entstandenen Homodimer bleiben die nicht biologisch aktiven N-terminalen Reste des Vorläufermoleküls zunächst nicht-kovalent verbunden. Dieser als latentes TGF-β₁ oder Pro-TGF-β1 bezeichneter Komplex kann jedoch nicht an die spezifischen Membranrezeptoren binden. Die Abspaltung der nicht-kovalent gebundenen N-terminalen Enden vom biologisch aktiven Homodimer wird in vivo vermutlich durch verschiedene Mechanismen, wie ein saures Milieu, die Protease Plasmin, Retinoid oder Thrombospondin- 1 erreicht (MASSAGUÉ 1990; MASSAGUÉ et al. 1994; DUBOIS et al. 1995; LAWRENCE 1996; COX u. MAURER 1997). Als gängige Methoden einer Aktivierung des latenten Zytokins in vitro gelten die Einwirkung einer Säure mit einem pH-Wert von 3,0 (Azidifikation) oder die proteolytische Spaltung, z.B. durch Plasmin (siehe Abb. II.4); eine Aktivierung kann aber auch durch Alkalisieren, Erhitzung auf 100°C oder Behandlung mit Harnstoff erreicht werden (MASSAGUÉ 1990; MASSAGUÉ et al. 1994; LAWRENCE 1996).

Aufgrund der Anzahl an Aktivierungsmöglichkeiten liegt die Vermutung nahe, daß die Aktivierung der latenten Form von TGF-β₁ eine wichtige Rolle bei der Regulierung der

biologischen Aktivität des Zytokins spielt (PIRCHER et al. 1986).

Humanes rekombinantes latentes TGF-β₁ besitzt in vivo eine Halbwertszeit von 90 Tagen, wohingegen das aktivierte TGF-β₁ innerhalb von zwei bis drei Minuten durch die Leber aus der Zirkulation entfernt wird (WAKEFIELD et al. 1995). In einer Studie von COFFREY et al.

(1990) wurde auch bei Ratten für biologisch aktives TGF-β₁ eine Halbwertszeit von zwei Minuten gemessen. Die Funktion der Latenz ist vermutlich, einen stabilen TGF-β₁-Spiegel als auch eine gleichzeitig stets lokal aktivierbare Quelle an TGF-β1 zu schaffen (WAKEFIELD et al. 1995).

Der von Thrombozyten sezernierte, latente Komplex ist zudem mit einem Glykoprotein, dem 235 kDa LTBP (latent TGF-β binding protein), assoziiert, dessen Funktion bisher unbekannt ist. Möglicherweise reguliert es die Aktivität von Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie (MASSAGUÉ 1990; MASSAGUÉ et al. 1994; LAWRENCE 1996), erleichtert die Sekretion von TGF-β₁ und ist an der auf die extrazelluläre Matrix gerichteten TGF-β₁-Aktivität beteiligt (MIYAZONO et al. 1993).

Abb. II.4: Aktivierung des latenten TGF-β₁ (modifiziert nach BARNARD et al. (1990)).

Glykoprotein (LTBP)

Pro-TGF-β₁

Säure Protease

aktives TGF-β₁ aktives

TGF-β₁

β₁-LAB β₁-LAB

3.3 Signaltransduktion

Die biologische Wirkung von TGF-β1 und anderen Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie entsteht erst durch die Bindung des Zytokins an spezifische Membranrezeptoren, in deren Folge eine Signalkaskade ausgelöst wird. Dieses extrazelluläre Signal wird durch die Zellmembran ins Zytoplasma und schließlich in den Zellkern weitergeleitet. Im Zellkern wird dann die Aktivität bestimmter Transkriptionsfaktoren reguliert und die Expression spezifischer Gene beeinflußt (DERYNCK u. FENG 1997; PADGETT et al. 1998).

Für TGF-β₁ wurden drei Haupttypen von Rezeptoren (TβR) identifiziert. Die Typ-I und Typ-II Rezeptoren gehören zu der Familie der transmembranen Serin/Threonin Kinase Rezeptoren und sind an der Signaltransduktion von TGF-β1 beteiligt. Die Typ-III Rezeptoren Betaglycan und Endoglin scheinen für die Signalbildung nicht direkt notwendig zu sein (DERYNCK u.

FENG 1997; PADGETT et al. 1998). In ihrer Anwesenheit steigt jedoch die Affinität des Typ-II Rezeptors (DERYNCK u. FENG 1997), und Betaglycan spielt eventuell für die Komplexstabilisierung der TβRI und TβRII eine Rolle (MITTL et al. 1996).

TGF-β₁ bindet zunächst an den TβRII, der sich stets in einem aktiven, phosphorylierenden Zustand befindet. Infolge der Ligandenbindung kommt es zu Interaktionen mit dem TβRI, der zu einem heteromeren Komplex herangezogen und durch den TβRII phosphoryliert wird (DERYNCK u. FENG 1997). Dieser Rezeptorkomplex hat eine tetramere Konfiguration und besteht aus je zwei Typ-I und Typ-II Rezeptoren (WRANA et al. 1992) (siehe Abb. II.5). Die Bindung des Zytokins erfolgt hauptsächlich durch den TβRII. Der TβRI kann TGF-β₁ erst durch die heteromere Assoziation mit dem TβRII binden. Aus der Phosphorylierung des TβRI resultiert die Aktivierung der zugehörigen Kinase, und auch der Typ-I Rezeptor erhält einen autophosphorylierenden Zustand (DERYNCK u. FENG 1997; HELDIN et al. 1997).

An der Weiterleitung des Signals vom tetrameren Rezeptorkomplex zum Zellkern ist wahrscheinlich eine kürzlich identifizierte Gruppe von Proteinen beteiligt. Diese Proteine waren bereits in Drosophila bekannt und wurden als Mad (mother against dpp) bezeichnet.

Aufgrund weiterer Homologien zu Sma-Proteinen (small body size) aus Caenorhabditis elegans, einem Nematoden, wurden die in Säugetieren identifizierten zytoplasmatischen Proteine als „Smad“ bezeichnet (DERYNCK u. FENG 1997; PADGETT et al. 1998). Diese Smads besitzen unter anderem eine zentrale Rolle im Immunsystem (MIYAZANO et al.

2000).

Abb. II.5: Schematisches Modell der homomeren (nur TβRII) und heteromeren (TβRI und TβRII) Interaktionen des Typ-II Rezeptors bei Anwesenheit von TGF-β1

sowie homomere Interaktion der Typ-I Rezeptoren (modifiziert nach DERYNCK und FENG (1997)).

DERYNCK und FENG (1997) als auch HELDIN et al. (1997) beschreiben folgendes Modell der Signaltransduktion bei TGF-β₁ (siehe Abb. II.6): Rezeptor-regulierte Smads, vermutlich Smad-2 und Smad-3, binden an den Typ-I Rezeptor und werden durch die Kinase des Rezeptors phosphoryliert. Sie werden daraufhin von dem Rezeptorkomplex freigesetzt und kooperieren im Zytoplasma mit dem nicht Komplex-assoziierten Smad-4. Infolge einer Phosphorylierung entsteht so ein aktiver, heteromerer Smad-Komplex, der durch Translokation in den Zellkern gelangt und direkt an spezifische DNS-Domänen bindet. Auf diese Weise führen die Smads mit weiteren regulatorischen Transkriptionsfaktoren zur Aktivierung spezifischer Gene für die Transkription. PARDALI et al. (2000) beobachteten, daß der TGF-β₁ vermittelte Klassensprung zu IgA auf diese Weise durch intrazelluläre Smad-Proteine der Signaltransduktion induziert wird.

Neben aktivierenden Smads konnte aber auch die Existenz inhibierender Smad-Proteine gesichert werden (MIYAZANO et al. 2000). Eine Modulierung der Effekte des TGF-β₁ kann durch diese hemmenden Smads als auch durch Mutationen in den Smad-Proteinen (MOREN et al. 2000) oder den Rezeptoren (MASSAGUÉ et al. 1997), durch das antagonierende Interferon-γ (ULLOA et al. 1999) oder durch Rezeptor-interagierende Proteine und andere parallel existierende Signaltransduktionswege (HELDIN et al. 1997)

intrazellulär extrazellulär

TβRII homo-oligomer

TβRI - TβRII hetero-oligomer

TβRI homo-oligomer

TGF-β¹

erfolgen. Diese Beeinflussung der Signaltransduktion des Zytokins könnte vielleicht erklären, warum sowohl positive als auch negative Effekte auf die gleiche Zelle durch TGF-β₁ hervorgerufen werden (HELDIN et al. 1997). Eine Unterbrechung der Signaltransduktion, wie sie z.B. durch Mutationen entsteht, kann nach MASSAGUÉ et al. (1997) zu einer Prädisposition oder sogar zur Entstehung von Krebs führen.

Abb. II.6: Modell der Rezeptoraktivierung durch TGF-β₁ und der daraus resultierenden Smad-Aktivität (modifiziert nach DERYNCK und FENG (1997)).

3.4 Effekte im Körper

TGF-β₁ ist ein Wachstumsfaktor, der die Proliferation von Zellen sowohl inhibieren als auch stimulieren kann. So werden epitheliale und endotheliale sowie hämatopoetische Zellen durch TGF-β₁ in ihrer Proliferation gehemmt, Zellen mesenchymalen Ursprungs dagegen stimuliert (LAWRENCE 1996; ALEVIZOPOULOS u. MERMOD 1997). Die Mechanismen, die

dieser bifunktionellen Aktivität zugrunde liegen, sind bisher nicht bekannt. Der proliferative Effekt scheint jedoch indirekt durch TGF-β₁ induziert zu sein und von der verstärkten Expression autokrin wirkender Wachstumsfaktoren, wie z.B. Platelet-derived growth factor (PDGF) und Epidermal growth factor (EGF), oder auch von Komponenten der extrazellulären Matrix abzuhängen (MASSAGUÉ 1990; MASSAGUÉ u. POLYAK 1995;

ALEVIZOPOULOS u. MERMOD 1997).

TGF-β1 ist ein wichtiger Wachstumsfaktor während der Wundheilung und der Organogenese (ROBERTS u. SPORN 1990). Das Zytokin beeinflußt das Wachstum und die Differenzierung von Epithelzellen, ist vielseitig an der Regulation des Immunsystems beteiligt und scheint zudem Einfluß auf die Karzinogenese zu haben (HELDIN et al. 1997; MASSAGUÉ et al.

1997; TIZARD 2000, S. 136). Als Zielorgane gelten unter anderen insbesondere das Immunsystem, die Leber, das hämatopoetische System, die Nieren sowie die Nebennieren (COX u. MAURER 1997).

Als wahrscheinlich stärkster physiologischer Inhibitor der Zellproliferation (MOSES et al.

1985) führt TGF-β1 zu einem reversiblen Arrest in der G1-Phase des Zellzyklus (DERYNCK u. FENG 1997). In einigen Zelltypen induziert TGF-β₁ auch den programmierten Zelltod durch Apoptose (ALEVIZOPOULOS u. MERMOD 1997).

TGF-β₁ ist als Zytokin wahrscheinlich deshalb so wichtig, weil es auf eine Reihe von Reaktionen der Lymphozyten antagonistisch wirkt (ABBAS et al. 1996, S. 308). So reguliert es direkt oder indirekt durch andere Zytokine die Entwicklung, Differenzierung und Funktionen der B- und T-Zellen. Der Faktor hemmt die B-Zellen in ihrer Proliferation und induziert teilweise sogar Apoptose. Die Produktion von IgG und IgM wird unterdrückt, wohingegen eine Induktion des Klassensprungs von IgM zu IgA zu einer vermehrten IgA- Synthese führt. Neben einer Hemmung von Proliferation und Aktivierung der T-Zellen supprimiert TGF-β₁ die Antwort der T-Zellen auf Zytokine, die T-Zell-vermittelte Zytotoxizität als auch die T_H1-Zell-Aktivität. Das Zytokin sorgt des weiteren für eine allgemein reduzierte Expression von Oberflächenrezeptoren für verschiedene Wachstumsfaktoren (DUBOIS et al. 1995; ABBAS et al. 1996, S. 308; TIZARD 2000, S. 136).

TGF-β₁ kontrolliert und reguliert die Funktion und Aktivität von Makrophagen und besitzt je nach Anwesenheit anderer Zytokine eine hemmende oder stimulierende Wirkung. Neben der Hemmung von Gewebemakrophagen kommt es zur Deaktivierung/Unterdrückung des durch Makrophagen produzierten Wasserstoffperoxids (ROBERTS u. SPORN 1990;

DUBOIS et al. 1995; TIZARD 2000, S. 136). Die Bildung von Stickstoffmonoxid wird durch TGF-β₁ nicht nur in Makrophagen sondern auch in Zellen des Knochenmarks, des