Untersuchungen zum oxidativen Stress im Rahmen der Steroid responsiven Meningitis-Arteriitis (SRMA) beim Hund

Untersuchungen zum oxidativen Stress

im Rahmen der Steroid responsiven Meningitis-Arteriitis (SRMA) beim Hund

I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von Michael Beiner

aus Lemgo

Hannover 2006

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. A. Tipold

Univ.-Prof. Dr. Dr. hc. H.-P. Sallmann

1. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. A. Tipold 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. B. Ohnesorge

Tag der mündlichen Prüfung: 22. Mai 2006

Karin, Jan und Smilla

INHALTSVERZEICHNIS Seite

I. EINLEITUNG 17

II. LITERATURÜBERSICHT 18

1. SRMA 18

1.1 Allgemeiner Überblick 18

1.2 Ätiologie und Pathogenese 21

1.3 Therapie 24

1.4 Prognose 25

2. Oxidativer Stress 25

2.1 Reactive Oxygen Species (ROS),

Reaktive Sauerstoffmetabolite 28

2.1.1 Definition und Bedeutung von ROS 28 2.1.2 Schaubild zum Pathomechanismus von Zelldegeneration durch ROS 31

2.1.3 Übersicht ROS 32

2.1.4 Haber-Weiß-Reaktion 33

2.2 Reactive Nitrogen Species (RNS),

Reaktive Stickstoffmetabolite 34 2.2.1 Entstehung und Bedeutung der RNS 34

2.2.2 Übersicht RNS 35

2.3 Antioxidantien 35

2.3.1 Definition und Bedeutung 35

2.3.2 Übersicht antioxidativer Abwehrmechanismen 36 2.3.3 Allgemeine antioxidative Abwehrmechanismen in biologischen

Systemen 38

2.3.4 Funktionsmechanismen einzelner Antioxidantien 39

2.4.2 Biochemische Reaktion 43 2.4.3 Reaktionsmechanismus der Lipidperoxidation 46

2.5 Marker für Lipidperoxidation 47

2.6 Protein-Oxidation 47

2.7 DNA-Schäden durch ROS/RNS 48

2.8 Oxidativer Stress und Pathogenese verschiedener Erkrankungen 49 2.8.1 Zentrales Nervensystem und oxidativer Stress 50 2.8.2 Oxidativer Stress und neurodegenerative

Erkrankungen 51

3. Quantifizierung von oxidativem Stress 53

3.1 Übersicht 53

3.2 MDA-Messung mittels Fluoreszenzphotometrie nach High- Performance

Liquid Chromatographie (HPLC) 56

3.3 MDA-Messung mittels Photometrie 57

3.4 MDA-Messung mittels Photometrie nach Sandwich-Enzyme Linked

Immunosorbent Assay (Sandwich-ELISA) 58

III. MATERIAL UND METHODEN 59

1. Geräte und Materialien 59

1.1 MDA-Messung mittels Photometrie 59

1.2 MDA-Messung mittels Fluoreszenzphotometrie nach HPLC 59 1.3 MDA-Messung mittels Photometrie nach ELISA 60

2. Chemikalien und Reagenzien 60

2.1 Testkit „Bioxytech MDA-586“ 60

2.2 Testkit „OxyStat“ 60

2.3 Testkit „Bioxytech Nitrotyrosine-EIA“ 60 2.4 MDA-Messung mittels Photometrie: Methode nach BUEGE und AUST 60 2.5 MDA-Messung mittels Fluoreszenzphotometrie nach HPLC 61 2.6 MDA-Messung mittels Photometrie nach ELISA 62

3. Medien, Puffer, Lösungen 62

3.1 MDA-Messung mittels Fluoreszenzphotometrie nach HPLC 62 3.2 MDA-Messung mittels Photometrie nach ELISA 63

4. Untersuchungsmaterial 64

4.1 Proben für Vorversuche 63

4.2 Patientenmaterial für den Hauptversuch/ die klinische Studie

(HPLC-Messungen) 64

4.2.1 Hunde mit SRMA 64

4.2.2 Hunde mit weiteren Erkrankungen 65

5. Untersuchungsmethoden 67

5.1 Gewinnung des Serums 67

5.2 Gewinnung des Liquor cerebrospinalis 67

5.3 Übersicht zu den Vorversuchen 67

6. MDA-Messungen mittels Photometrie 70

6.1 Vorversuche zur Auswahl eines Testkits 70

6.2 Testkit „Bioxytech MDA-586“ 70

6.3 Testkit „OxyStat“ 71

6.4 Methode nach BUEGE und AUST (1978) 71

7. MDA-Messungen mittels Photometrie bzw. Fluoreszenzphotometrie

nach High-Performance-Liquid-Chromatographie (HPLC) 73 7.1 Durchführung der MDA-Messungen mittels Photometrie bzw.

Fluoreszenzphotometrie nach HPLC 73

7.2 Provokations-Vorversuche mittels Photometrie bzw.

Fluoreszenzphotometrie nach HPLC 74 7.3 Standard-Vorversuche mittels Fluoreszenzphotometrie nach

HPLC, Spectrophotometrie und Spectrofluorophotometrie 74 7.4 Methodenvergleich Spectrophotometrie und Spectrofluorophotometrie 75 7.5 Methodenvergleich: photometrische Messung mit und ohne HPLC 75 7.6 MDA-LDL(low-density lipoproteins)-Messungen mittels Photometrie

bzw. Fluoreszenzphotometrie nach HPLC 76

7.7 Messungen zur Reproduzierbarkeit der MDA-Konzentrationsbestimmung

mittels Fluoreszenzphotometrie nach HPLC 76 8. MDA-Messungen mittels Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 76 8.1 Vorversuch: Erprobung des Testkits „Bioxytech Nitrotyrosine-EIA“ 76 8.2 Entwicklung eines ELISAs zur photometrischen Messung von MDA 77 8.3 Übersichtsschema zur Durchführung des entwickelten Sandwich-

ELISAs mit photometrischer Messung von MDA 81 8.4 Vorversuch: Austesten eines für diese Studie entwickelten ELISAs

zur photometrischen Messung von MDA; Messungen zur Etablierung

eines Standards und zur Reproduzierbarkeit 83 8.5 Methodenvergleich zwischen Fluoreszenzphotometrie nach HPLC

und ELISA 84

8.6 Variation der verwendeten Puffer im ELISA-Messverfahren 84 8.7 Messungen zur Validität des ELISA-Messverfahrens 85

9. Hauptversuch/Klinische Studie: MDA-Messungen mittels Fluoreszenz- photometrie nach HPLC in Liquor cerebrospinalis und Serum von

Patienten mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen 85

10. Auswertung der Versuche 85

10.1 Auswertung der MDA-Messungen mittels Photometrie 85 10.2 Auswertung der MDA-Messungen mittels Fluoreszenzphotometrie

nach HPLC 85

10.3 Auswertung der MDA-Messungen mittels Photometrie nach ELISA 86

10.4 Statistische Auswertung 86

IV. ERGEBNISSE 88

1. MDA-Messungen mittels Photometrie 87 1.1 Vorversuche zur Auswahl eines Testkits 87 1.2 Methode nach BUEGE und AUST (1978) 89 1.3 Vorversuche zur Reproduzierbarkeit mittels Photometrie: Methode

nach BUEGE und AUST 89

2. MDA-Messungen mittels Photometrie bzw. Fluoreszenzphotometrie

nach High Performance Liquid Chromatographie (HPLC) 96 2.1 Provokations-Vorversuche mittels Photometrie bzw.

Fluoreszenzphotometrie nach HPLC 96

2.2 MDA-Konzentrationsbestimmung der Standard-Lösung mittels Fluoreszenzphotometrie nach HPLC, Spectrophotometrie und

Spectrofluorophotometrie 99

2.3 Methodenvergleich Spectrophotometrie und Spectrofluorophotometrie 99 2.4 Methodenvergleich: Messung mit und ohne HPLC 99

2.6 Messungen zur Reproduzierbarkeit der MDA-Konzentrations-

bestimmung mittels Fluoreszenzphotometrie nach HPLC 103 3. MDA-Messungen mittels Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 106 3.1 Vorversuch: Erprobung des Testkits „Bioxytech Nitrotyrosine-EIA“ 106 3.2 Vorversuch: Austesten eines für die Studie entwickelten ELISAs zur

photometrischen Messung von MDA; Messungen zur Etablierung

eines Standards und zur Reproduzierbarkeit 106 3.3 Methodenvergleich zwischen Fluoreszenzphotometrie nach HPLC und

Photometrie nach ELISA 108

3.4 Variation der verwendeten Puffer im ELISA-Messverfahren 108 3.5 Messungen zur Validität des ELISA-Testverfahrens 109

4. Hauptversuch/ Klinische Studie: MDA-Messungen mittels Fluoreszenz- photometrie nach HPLC in Liquor cerebrospinalis und Serum von

Patienten verschiedener neurologischer Erkrankungen 111 4.1 MDA-Messung im Serum der Hunde der klinischen Studie 111 4.2 MDA-Messung im Liquor cerebrospinalis der Hunde

der klinischen Studie 113

4.3 Messung des Gesamtproteins im Liquor cerebrospinalis

der Hunde der klinischen Studie 116

4.4 Bestimmung der Leukozytenzahlen im Blut 118 4.5 Bestimmung der Leukozytenzahlen im Liquor der Hunde

der klinischen Studie 119

4.6 Bestimmung der IgA-Konzentration im Serum der Hunde

der klinischen Studie 121

4.7 Bestimmung der IgA-Konzentration im Liquor der Hunde

der klinischen Studie 122

4.8 Korrelationen der im Rahmen der klinischen Studie in Serum und Liquor bestimmten Parameter statistisch ausgewertet im Test

nach SPEARMAN 125

V. DISKUSSION 128

1. Methoden zur Quantifizierung oxidativen Stresses 128 2. Resultate der klinischen Studie: MDA-Konzentrationsbestimmungen

mittels HPLC in Liquor cerebrospinalis und Serum von Hunden mit

verschiedenen neurologischen Erkrankungen 135

VI. ZUSAMMENFASSUNG 148

VII. SUMMARY 150

VIII. LITERATURVERZEICHNIS 152

IX. ANHANG 174

1. Tabellen 174

2. Tabellenverzeichnis 189

3. Abbildungsverzeichnis 191

X. DANKSAGUNG 194

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen:

µg Mikrogramm µl Mikroliter µmol Mikromol

°C Grad Celsius

AA Ascorbinsäure, Vitamin C

ABAP 2-Azobis (2-amidinopropan) dihydrochlorid;

2,2-Azobisdihydrochlorid Abb. Abbildung

ad zu

AD Alzheimer Disease, Morbus Alzheimer

AG Antigen

AK Antikörper

ALS Amyotrophe Lateralsklerose Aqua a. i. Aqua ad injectionem

Aqua dest. Aqua destillata ATP Adenosintriphosphat Best.Nr. Bestellnummer

BHA butyliertes Hydroxyanisol

BHT butyliertes Hydroxytoluen, butylierter Alkohol, Butylhydroxytoluol

BSA Bovines Serumalbumin bspw. beispielsweise

bzw. beziehungsweise

C Konzentration

Ca++ chemisches Symbol für Kalzium cat. Katalog (engl.)

CAT Katalase chem. Chemisch

cm³ Kubikzentimeter

CSF Cerebrospinal fluid, Liquor cerebrospinalis

CT Computertomographie

DHA Dehydroascorbinsäure

DNA desoxyribonucleid acid; oder DNS, Desoxyribonukleinsäure EIA Enzyme Immuno Assay

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay et al. et alii (und andere)

EtOH Ethanol

Fa. Firma

Fe²⁺/ Fe3+ zwei- und dreiwertiges Eisen-Kation

g Gramm

g/mol Gramm pro mol

geom. Geometrisch

GME Granulomatöse Meningoenzephalitis GR Glutathion-Reduktase

GSH Glutathion (reduziert) GSHPx Glutathion-Peroxidase

GSH-S-Transferase Glutathion-Transferase GSSG Glutathion (oxidiert)

HCl Salzsäure

HD Huntington Disease

4-HNE 4-Hydroxynonenal, englisch: 4-hydroxynonenale HPLC High-Performance-Liquid-Chromatography

HRPO horse-radish-Peroxidase, Meerrettich-Peroxidase HWS Halswirbelsäule

IgA Immunglobin A

IgM Immunglobulin M

IL-8 Interleukin 8

Kg Kilogramm

konj. konjugiert

l Liter

LDL low-density lipoproteins Leukos Leukozyten

LH Lipid; ungesättigte Fettsäure M molar

Max Maximum MDA Malondialdehyd

MDHA Monodehydroascorbinsäure

MeOH Methanol

mg Milligramm

mg/dl Milligramm pro Deziliter Min Minimum

min Minuten

mk männlich kastriert ml Milliliter

mM millimolar

mmol/l Millimol pro Liter

Mn-SOD Mangan-Superoxiddismutase

MRT Kernspintomographie

MS Mischserum

MW Mittelwert

n number, Anzahl, Menge (Anzahl der Messungen)

N normal

NaCl Natriumchlorid

NADH reduziertes Nicotinsäure-adenin-dinucleotid

NADPH reduzierte Form von NAD: Nicotinamidadenindinucleotid

NaOH Natronlauge

ng Nanogramm

nm Nanometer

NMPI N-methyl-2-phenylindole

NO Stickstoffoxid

NOS Stickstoffoxid-Synthetase Nr., No. Nummer

OD optische Dichte

OPD O-Phenylendiamin-Dihydrochlorid, Orthophenyldiamin

o-PPS o-Phosphorsäure

p Irrtumswahrscheinlichkeit PBS Phosphate Buffered Saline,

phosphatgepufferte Kochsalzlösung PD Parkinson Disease, Morbus Parkinson

Perz. Perzentil

pH Potentia hydrogenii

psi pound per square inch; Pfund pro Quadratinch

(in Großbritannien gebräuchliches Maß für den Druck, der auf eine Fläche ausgeübt wird. 1 psi entspricht

umgerechnet 70 g/cm² bzw. 0,068 atm)

RNS Reactive Nitrogen Species, Reaktive Stickstoff-Metabolite ROS Reactive Oxygen Species, Reaktive Sauerstoff-Metabolite S, sec. Kurzzeichen für Sekunde

SA standard derivation, Standardabweichung

SCC SPEARMAN-Correlation-Coefficient (SPEARMAN- Korrelations-Koeffizient)

SOD Superoxid-Dismutase

SRMA Steroid-responsive meningitis-arteriitis, Steroid responsive Meningitis Arteriitis, auch steril-eitrige Meningitis- Arteriitis

SRMA-K. SRMA-Kontrolle/ SRMA-Kontrollpatienten (in/nach Therapie)

Std. Standard

T ½ Halbwertszeit Tab. Tabelle

TBA thiobarbituric acid, Thiobarbitursäure

TBARS Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen TCA trichloric acid, Trichloressigsäure

TEP 1.1.3.3-Tetraethoxypropan TH2 α-Tocopherol

TMB Tetramethylbenzidin TMOP Tetramethoxypropan

TP Totalprotein

UA urinic acid, Harnsäure v.a. vor allem

Verd. Verdünnung

vgl. vergleiche

VK Variationskoeffizient

z.B. zum Beispiel

ZNS Zentrales Nervensystem

I. EINLEITUNG

Die steril-eitrige Meningitis-Arteriitis (englisch: steroid responsive meningitis-arteriitis, SRMA) ist eine weltweit beim Hund auftretende Hirnhautentzündung mit bislang weitgehend unklarer Ätiologie und Pathogenese (TIPOLD et al.1996). Sie tritt beim Hund in zwei Formen auf. Die weitaus häufiger vorkommende akute, klassische Form der Erkrankung geht klinisch mit Fieber, Apathie und einer hochgradigen Schmerzhaftigkeit im Halsbereich einher. Labordiagnostisch ist neben der neutrophilen Pleozytose vor allem der systemisch und intrathekal erhöhte IgA-Gehalt charakteristisch. Bei der chronischen Form der Erkrankung treten zusätzlich neurologische Ausfallerscheinungen auf und im Liquor cerebrospinalis werden vorwiegend mononukleäre Zellen gefunden. Pathohistologisch können neben der eitrigen Meningitis entzündliche Veränderungen der Meningealarterien im Bereich der spinalen Meningen, aber auch in Koronar- und Mediastinalarterien beobachtet werden. Ätiologie und Pathogenese der SRMA sind bis heute weitgehend unklar.

Bisher konnten weder bakterielle noch virale Erreger nachgewiesen werden. Der in Serum und Liquor deutlich erhöhte IgA-Spiegel und die im Verlauf der Therapie zu beobachtende deutliche Besserung der Patienten unter Glukokortikosteroid-Gabe lassen auf ätiologisch bedeutsame immunpathologische Mechanismen schließen (TIPOLD et al. 1996).

Die genaue Pathogenese ist jedoch noch nicht bekannt. Oxidativer Stress könnte Bestandteil eines Mechanismus sein, der die klinische Symptomatik besser erklären bzw. die akute Phase der Erkrankung in die chronische überleiten kann. Diese Hypothese stellt den Ansatzpunkt der vorliegenden klinischen Studie dar.

In vorliegender Arbeit sollte daher oxidativer Stress durch Bestimmung der MDA- Konzentration in Serum und Liquor cerebrospinalis des Hundes quantifiziert werden.

Ziele dieser Studie waren die Etablierung eines Testverfahrens zur Messung des oxidativen Stresses beim Hund und die Untersuchung der Bedeutung von oxidativem Stress bei an SRMA erkrankten Patienten. Dazu wurde die MDA-Konzentration in Liquor- und Serumproben mit verschiedenen Testverfahren bestimmt und Liquor und Serum von Hunden mit definierten neurologischen Erkrankungen untersucht.

II. LITERATURÜBERSICHT

1. SRMA

1.1 Allgemeiner Überblick

Die steril-eitrige Meningitis-Arteriitis (englisch: steroid responsive meningitis-arteriitis, SRMA) ist eine weltweit beim Hund auftretende Erkrankung der Meningen bzw. der Meningealarterien, deren Ätiologie und Pathogenese noch weitgehend unklar ist (TIPOLD et al.1996). Es handelt sich neben Staupe, Granulomatöser Meningoenzephalitis (GME) und einer Infektion mit Protozoen um die häufigste entzündliche Erkrankung im ZNS (TIPOLD 1995). Neben einer eitrigen Meningitis wird eine nekrotisierende Vaskulitis im Bereich der spinalen Meningen gesehen.

Beim Hund treten zwei Formen auf (TIPOLD und JAGGY 1994):

- akute/klassische Form:

Bei dieser vorwiegend beobachteten Form tritt klinisch Fieber (bis zu 42°C) und eine deutliche Steifheit und Schmerzhaftigkeit des Halsbereiches auf. Die neurologische Untersuchung bleibt in der Regel ohne besonderen Befund. Teilweise erscheinen Droh- und Stellreflexe herabgesetzt (TIPOLD 2000). Labordiagnostisch ist im Blut eine Leukozytose mit Neutrophilie und Kernlinksverschiebung, im Liquor cerebrospinalis eine hochgradige neutrophile Pleozytose (bis zu mehreren tausend polymorphkernigen Zellen pro Mikroliter Liquor) zu finden, im Liquor zudem ein gering bis mittelgradiger Anstieg des Proteingehaltes. Kennzeichnend ist der sowohl bei der akuten als auch bei der protrahiert-chronischen Form auftretende Anstieg des IgA-Gehaltes in Serum und Liquor und eine rasche Besserung der klinischen Symptome nach Applikation von Glukokortikoiden bis zur Beschwerdefreiheit.

Histopathologisch geht die akute Form der SRMA mit einer deutlichen Meningitis mit Infiltration von Entzündungszellen wie Makrophagen, Plasmazellen, Lymphozyten und polymorphkernigen Zellen einher. Alle Hirnhäute des ZNS sind betroffen, insbesondere jedoch die der cervikalen Region. Zusätzlich werden entzündlich stenotische Läsionen der Meningealarterien beobachtet (CIZINAUSKAS et al. 2000).

- chronische/protrahierte Form:

Infolge der hohen Rezidivneigung der SRMA kann sich im Verlauf mehrerer Rückfälle ein chronisch protrahiertes Krankheitsbild entwickeln. Charakteristisch für diese chronische Form der Erkrankung sind neurologische Ausfälle im Sinne einer Rückenmarksläsion oder einer multifokalen ZNS-Erkrankung. Es kommt zu Gangstörungen wie Hypermetrie, generalisierter Ataxie, Passgang, Tetra- oder Paraparese, zu verzögerten Haltungs- und Stellreaktionen und gegebenenfalls zu herabgesetzten spinalen Reflexen. In seltenen Fällen treten Strabismus und Myoklonus auf (TIPOLD und JAGGY 1994). Labordiagnostisch ist die Pleozytose im Liquor nicht so ausgeprägt wie bei der akuten Form; die beobachteten Zellen sind eher mononukleär (Lymphozyten, Makrophagen, Monozyten). Der Proteingehalt des Liquors ist normal bis geringgradig erhöht. Histopathologisch zeichnet sich die protrahierte Form durch eine weniger starke Infiltration der Meningen mit Entzündungszellen aus. Kennzeichnend sind fibröse Verdickungen und fokale Mineralisierungsherde der Leptomeninx. Zum Teil treten schwere stenotische Veränderungen der Blutgefäße infolge einer Intimaproliferation und einer Invasion von Entzündungszellen auf (TIPOLD et al. 1995).

Charakteristisch und von diagnostischem Nutzen ist die bei beiden Krankheitsformen auftretende intrathekale und systemische Erhöhung der IgA-Konzentration, die auch unter der Therapie zunächst unverändert hoch bleibt (TIPOLD und JAGGY 1994).

Obwohl das IgA eine zentrale Rolle in der Pathogenese der Erkrankung spielt, ist seine genaue Bedeutung noch unbekannt (TIPOLD et al. 1996). Die hohe IgA- Konzentration in Serum und Liquor cerebrospinalis ist sonst nur bei Tumoren des hämatopoetischen Systems (Lymphom, Myelom, Histiozytom) zu beobachten, so dass diese Tumore im Zweifelsfall differentialdiagnostisch mittels bildgebender Verfahren (zum Beispiel Computertomographie (CT) oder Kernspintomographie (MRT)) auszuschließen sind (TIPOLD 2000). Zum Ausschluß weiterer differentialdiagnostisch bedeutender Krankheiten (beispielsweise bakterielle Meningitiden infolge von Traumata, Bissverletzungen oder als Folge einer Diskospondylitis), die mit neurologischen Ausfällen einhergehen, wird neben bildgebenden Verfahren die bakterielle Untersuchung des Liquor cerebrospinalis als

zusätzliches diagnostisches Hilfsmittel hinzugezogen. Andere mit einer Neutrophilie einhergehende Enzephalitiden wie die protozoär bedingte Enzephalitis oder die granulomatöse Meningoenzephalomyelitis (GME) gehen zumeist mit stärker ausgeprägten neurologischen Ausfallerscheinungen einher und beschränken sich in der Regel nicht auf die Meningen.

Die mikrobiologische Untersuchung des Liquors bleibt in allen bisher bekannten Fällen negativ (TIPOLD 2000). Generell kommt die Erkrankung bei allen Hunderassen aller Alterstufen vor, jedoch besteht eine Prädisposition für Berner Sennenhunde (PRESTHUS 1991; TIPOLD und JAGGY 1994), Beagle (HAYES et al.1989; FELSBURG et al. 1992; SNYDER et al. 1995) und Boxer (PONCELET und BALLIGAND 1993; TIPOLD und JAGGY 1994). Betroffen sind zumeist junge Hunde bzw. junge adulte Hunde im Alter zwischen acht und achtzehn Monaten (TIPOLD 2000). Eine Geschlechtsdisposition besteht nicht (TIPOLD 2000). Neben der Bezeichnung SRMA bestehen synonyme Krankheitsbezeichnungen wie

- Beagle-Pain-Syndrome (HAYES et al. 1989) - Canine Pain Syndrome (BURNS et al. 1991)

- Canine Juvenile Polyarteriitis Syndrome (FELSBURG et al. 1992) - Necrotizing Vasculitis (SCOTT-MONCRIEFF et al.1992)

- Polyarteriitis (HARCOURT 1978 ; BROOKS 1984)

Der Terminus „steril-eitrig“ ist auf die negativen mikrobiologischen Befunde und auf die hochgradige Pleozytose im Liquor zurückzuführen, bei der es sich zumindest bei der akuten Form vorwiegend um neutrophile Granulozyten handelt. Patho- histologisch ist im akuten Fall der Erkrankung eine eitrige Meningitis vor allem im Halsbereich, aber auch in allen Regionen der Meningen zu beobachten. Eine Arteriitis betrifft mittelgroße bis große Arteriolen und kleine Arterien. Die Endothelzellen und die Nuklei der Tunica muscularis erscheinen angeschwollen. Es kommt zur hyalinen Degeneration, möglicherweise zur Ruptur geschädigter Gefäße und somit zu meningealen Hämorrhagien, zur Periarteriitis mit Invasion neutrophiler Granulozyten und monomorphkerniger Zellen. Die Ablagerung von Immunkomplexen

und Immunglobulinen ist erst im späten Stadium nachweisbar. Diese Veränderungen treten vornehmlich im Bereich der Meningealarterien auf, aber auch Koronar- und Mediastinalarterien sind häufig betroffen. Die zelluläre Proliferation der Gefäßwand und die Fibrosierung der Intima können zur Stenose führen (SNYDER et al.1995).

Die SRMA dient als Tiermodell für Vaskulitiden unbekannter Genese des Menschen.

Sie ist bezüglich ihrer Pathogenese mit den humanen Vaskulitiden „Wegeners Granulomatose“, „Kawasaki-Syndrom“ (BURNS et al. 1991; FELSBURG et al. 1992) und „Hennoch-Schönlein-Purpura“ vergleichbar, deren Ätiologie ebenfalls noch weitgehend ungeklärt ist (BURNS et al. 1991; FELSBURG et al.1992; TIPOLD et al.

1996).

1.2 Ätiologie und Pathogenese

Ätiologie und Pathogenese der SRMA sind weitgend unklar. Jedoch ergeben sich aus den Befunden der einzelnen klinischen, labordiagnostischen, histo- pathologischen und mikrobiologischen Untersuchungen verschiedene Ansätze zur Ätiologie dieser Erkrankung:

Abb.1: Schematische Übersicht zu möglichen Ursachen und pathogenetischen Mechanismen von SRMA:

Ätiologie und Pathogenese der SRMA

Bakterielle Ursachen chemotaktische Faktoren

Virale Ursachen Veränderungen der Blut-Hirn-Schranke Genetische Ursachen

Immunpathologische Mechanismen

In verschiedenen Studien konnten weder bakterielle noch virale Ursachen gefunden werden (PRESTHUS 1991; TIPOLD 2000), jedoch deuten die in Untersuchungen von FELSBURG et al. (1992) gefundenen vielkernigen Riesenzellen auf eine virale Beteiligung hin. Die mikrobiologische Untersuchung des Liquors erkrankter Hunde ist - wie oben beschrieben - negativ (TIPOLD 2000). Der Nachweis aktivierter T- Lymphozyten weist auf einen Antigenkontakt hin, jedoch konnten bisher weder Infektionserreger noch Immunkomplexablagerungen eindeutig nachgewiesen werden. Auch die erhöhte IgA-Konzentration in Serum und Liquor ist möglicherweise auf ein infektiöses Agens zurückzuführen, das bisher nicht zu isolieren war. Die genaue Funktion von IgA im ZNS ist noch unklar. Der Therapieerfolg mit Glukokortikoiden lässt sich als Indiz für einen immunpathologischen Mechanismus werten (BURNS et al. 1991; FELSBURG et al. 1992). Die in neuroimmunologischen Studien von TIPOLD et al. (1995) nachgewiesene intrathekale IgG-Synthese bei allen untersuchten und an SRMA erkrankten Hunden, kann auf eine speziell gegen das ZNS gerichtete Immunantwort gewertet werden. Obwohl bei sechs von dreizehn Tieren zirkulierende Immunkomplexe im Serum gefunden werden, geht man nicht von einer Schädigung der Meningen im Rahmen einer generalisierten Immunkomplex-Erkrankung aus, zumal die Immunkomplexe histologisch erst im protrahierten Erkrankungsstadium gefunden werden konnten. Es handelt sich eher um Primärläsionen, die mit der intrathekalen humoralen Immunantwort in Zusammenhang gebracht werden; die intrathekale und systemische IgA-Synthese scheint hierbei eine zentrale Rolle zu spielen (TIPOLD et al. 1995; CIZINAUSKAS et al. 2000; WEBB et al. 2000). Der hohe Serum IgA-Gehalt kann auch bei potentiell immunvermittelten Erkrankungen des Menschen wie dem „Kawasaki-Syndrom“

(FELSBURG et al. 1992) und der „Henoch-Schönlein Purpura“ (BLANKENSHIP 1985) beobachtet werden, der genaue pathogene Mechanismus ist jedoch auch hier noch nicht geklärt. Vorstellbar ist, dass durch einen unbekannten Umweltfaktor oder einen anderen Stimulus Mechanismen in Gang gesetzt werden, die zur Dysregulation des Immunsystems führen. Einen Hinweis auf eine solche Dysregulation lieferte beispielsweise eine Studie von FELSBURG et al. (1992), in der immunologische Abnormalitäten bei der akuten Form der SRMA in Form einer

erhöhten Zahl zirkulierender B-Zellen sowie einer erniedrigten Zahl peripherer T- Zellen insgesamt beobachtet werden konnte. Ähnliche Verschiebungen der T- Lymphozytensubpopulationen konnten beim „Kawasaki-Syndrom“ nachgewiesen werden. Die Mechanismen zur Aktivierung spezifischer Leukozyten und die bei der SRMA auftretende Prädilektion für die Meningealarterien sind noch nicht zu erklären.

Im peripheren Blut erkrankter Tiere und in den Meningealläsionen herrschen B- Lymphozyten vor, während in den betroffenen Arterien ausschließlich T–Zellen zu finden sind. Außerdem konnten neben aktivierten T-Lymphozyten Hinweise auf Gedächtniszellen gefunden werden, die eine schnelle Immunantwort im Falle einer Antigenpräsenz im ZNS ermöglichen können (TIPOLD et al. 1999). Möglicherweise spielen chemotaktische Faktoren (BURGENER et al. 1998), Veränderungen der Blut- Hirn-Schranke (LACY et al. 1995; SPRENGER et al. 1996) als auch eine atypische Expression von Selektinen und Integrinen eine Rolle (GRANGER und LEUBES 1994).

BURGENER et al. (1998) konnten eine positive Korrelation zwischen Interleukin 8 (IL-8) bzw. IgA-Gehalt im Liquor cerebrospinalis (CSF) und chemotaktischer Aktivität für neutrophile Granulozyten und zum Teil T-Lymphozyten bei der SRMA nachweisen. Vorstellbar ist eine Triggerfunktion des IgA hinsichtlich der Entzündungsmechanismen im ZNS, so aktiviert IgA auf alternativem Weg das Komplementsystem, interagiert mit Phagozyten (BLANKENSHIP 1985; WARREN et al. 1987) und verändert die Funktion polymorphkerniger Zellen, sofern sie einen speziellen IgA-Rezeptor besitzen (FANGER et al 1983; BOGERS et al. 1991). Die in vielen CSF-Proben der Hunde gesteigerte Chemotaxis für neutrophile Granulozyten ist dementsprechend womöglich auf die Anwesenheit von IgA zurückzuführen (TIPOLD et al. 1995).

Eine Studie von BAMMERT et al. (2001) ergab, dass der Einfluss des intrathekal produzierten Zytokins Transforming Growth Factor-ß1 (TGF-ß1), das den Isotypenwechsel zwischen IgM zu IgA bewirkt (TIZARD 2000), hinsichtlich der exzessiven IgA-Synthese bei SRMA-Erkrankungen auch bei Erkrankungen wie bakteriellen Enzephalitiden und GME beobachtet werden kann. Zudem scheinen

andere bisher unbekannte Mechanismen für den Erhalt des erhöhten IgA-Spiegels während späterer Krankheitsstadien verantwortlich zu sein (BAMMERT 2001).

TIZARD (2000) und TIPOLD (2000) gehen von autoimmunen Prozessen aus, die zur IgA-Synthese bei der steril-eitrigen Meningitis-Arteriitis führen.

Die vorliegende Studie soll dazu beitragen, die Rolle von oxidativem Stress in der unklaren Pathogenese der steroid responsiven Meningitis-Arteriitis zu klären.

Oxidativer Stress könnte für neurologische Ausfallerscheinungen verantwortlich sein und die chronische Phase der Erkrankung einleiten. Serum- und Liquorproben von an SRMA erkrankten Hunden und von Hunden mit anderen definierten neurologischen Erkrankungen wurden daraufhin vergleichend untersucht. Oxidativer Stress ist wesentlicher Bestandteil neurodegenerativer Prozesse verschiedener neurologischer Erkrankungen des Menschen. Der Verlust der Mitochondrienfunktion infolge oxidativen Stresses ist beispielsweise ein Baustein im pathophysiologischen Reaktionszyklus von Morbus Alzheimer (ANDERSON et al. 2001), Morbus Parkinson (JENNER 2003) und Morbus Huntington (BEAL 2004). Außerdem sind Astrozyten gegenüber oxidativem Stress sehr empfindlich (ROBB et al. 1999), so dass infolge eines Peroxid-induzierten Absterbens von Astrozyten deren schützender Effekt auf Neuronen und Oligodendrozyten verloren geht und auch ihre Funktion, Neurotransmitter und Ionen abzupuffern (ROBB et al. 1999). Generell wird oxidativer Stress mit Nekrose- und Apoptose-Mechanismen der Neurotoxizität in Zusammenhang gebracht (BUTTERFIELD et al. 1999). Ob bei an SRMA erkrankten Hunden oxidativer Stress im Pathomechanismus eine Rolle spielt und wie er am besten zu quantifizieren ist, ist Ansatzpunkt dieser Arbeit.

1.3 Therapie

Während eine antibiotische Therapie zumeist ohne therapeutischen Effekt bleibt, verbessert sich der Krankheitszustand unter Therapie mit Glukokortikoiden drastisch innerhalb mehrerer Stunden. Die initial hoch angesetzte Glukokortikoiddosis mit 4 mg/kg Prednisolon für ein bis zwei Tage wird auf 2 mg/kg täglich reduziert und im weiteren Verlauf mit Hilfe von Liquorkontrolluntersuchungen über sechs Monate reduziert und ausgeschlichen (TIPOLD und JAGGY 1994). Dabei gilt die intrathekale

Zellzahl als sensitiver Indikator für die Effektivität der Behandlung (CIZINAUSKAS et al. 2000), während der IgA-Spiegel unter der Therapie zunächst erhöht bleibt. Bei unzureichendem Therapieerfolg mit Prednisolon wird das Purinanalogon Azathioprin (1,5-2 mg/kg/Tag) eingesetzt (TIPOLD 2000). Während man sich bei dem Prednisolon-Einsatz den entzündungshemmenden Effekt zunutze macht und die Einwanderung von neutrophilen Granulozyten in den Meningealraum blockiert, verhindert das Azathioprin die Proliferation sich schnell teilender Zellen, vermindert die Anzahl der Makrophagen und Monozyten und wirkt durch Beeinflussung der Lymphozytenmembran ebenfalls entzündungshemmend.

Mögliche Nebenwirkungen der Langzeit-Glukokortikoidtherapie wie Ulzera des Gastrointestinaltraktes sollten in Form einer entsprechenden Magenschutztherapie bei der Behandlung bedacht werden (TIPOLD 2000).

1.4 Prognose

Die Prognose der Erkrankung ist bei frühzeitiger Diagnose und Therapie als gut bis vorsichtig einzuschätzen (TIPOLD 2000). Zumeist kann eine vollständige Ausheilung erreicht werden. Generell handelt es sich aber um eine tendentiell rezidivierende Erkrankung, deren Prognose bei älteren Tieren mit hohen IgA-Konzentrationen im Liquor und mit häufigen Rezidiven als weniger günstig zu beurteilen ist (CIZINAUSKAS et al. 2000).

2. Oxidativer Stress

Oxidativer Stress wird definiert als Störung des Gleichgewichtes zwischen Prooxidantien und Antioxidantien zugunsten der Prooxidantien (SIES 1985). Im Verlauf verschiedenster intrazellulärer Prozesse entstehen reaktive Sauerstoff- und reaktive Stickstoffmetaboliten, die Zellbestandteile schädigen können (HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999, KLEIN et al. 2003). Diese, den oxidativen Stress auslösenden reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffmetabolite wie auch die bei der Zellschädigung entstehenden radikalen Zwischenprodukte, stellen die Gruppe der Prooxidantien dar. Zumeist handelt es sich um freie Radikale, die sich durch ihre

hohe Reaktivität und ihre extrem kurze Halbwertszeit auszeichnen (YU et al. 1994).

Freie Radikale werden definiert als Moleküle mit einem oder mehreren ungepaarten Elektronen im äußersten Orbital (CLARKSON et al. 2000).

Molekularer Sauerstoff ist ein Diradikal, das zwei ungepaarte Elektronen mit parallelem Spin im äußersten Orbital trägt (YU 1994; CLARKSON et al. 2000). Diese Elektronenkonfiguration des Sauerstoffs bedingt physiologisch bedeutsame Oxidations- und Reduktionsprozesse, bei denen reaktive radikale Zwischenprodukte erzeugt werden (KERN 2003).

Reaktive Sauerstoffmetabolite entstehen beispielsweise während der mitochondrialen Atmung (MC CORD und FRIDOVICH 1970, HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999, YU 1994), bei der unter Aufnahme von Elektronen und Protonen Sauerstoff zu Wasser reduziert wird. Superoxid, Wasserstoffperoxid und das Hydroxylradikal stellen Reaktionszwischenprodukte dar und können teilweise im Verlauf der vierstufigen Reaktion entweichen (CHANCE et al. 1979). So werden 4- 5% der inspiratorisch aufgenommenen Sauerstoffmenge nicht komplett zu Wasser reduziert, sondern tragen zur Entstehung freier Radikale bei (CLARKSON et al.

2000).

Auch andere Reaktionen können als Quelle solcher reaktiver Metabolite angeführt werden. Beispielsweise entstehen freie Radikale bei der oxidativen Desaminierung von Katecholaminen im Gehirn (HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999, KERN 2003), wie auch bei der Phagozytenaktivierung (MOFFARTS et al. 2005), der Aktivierung des unspezifischen Immunsystems, bei Ischämie (HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999) und bei traumatischen Einflüssen (KULOGLU et al. 2002).

Metallionen, insbesondere Eisen und Kupfer, katalysieren die Entstehung reaktiver Sauerstoffmetabolite (HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999).

Physiologischerweise existiert ein Gleichgewicht zwischen der Bildung und dem Abbau freier Radikale. Ist dieses Gleichgewicht nicht ausgewogen, beispielsweise wenn infolge chemischer oder physikalischer Noxen vermehrt freie Radikale entstehen, so kann es zur Schädigung verschiedener Zellbestandteile wie Membranlipide, Proteine, Kohlenhydrate und (Desoxy-) Ribonukleinsäuren kommen (KLEIN et al. 2003; CLARKSON und THOMPSON 2000).

Oxidativer Stress beschreibt also einen Zustand, bei dem radikale und damit sehr reaktive Sauerstoffmetabolite, welche bei verschiedenen physiologischen Reaktionen im Körper entstehen, gegenüber körpereigenen Abwehrmechanismen (Antioxidantien) überwiegen und somit einen schädigenden Einfluss auf verschiedene Zellbestandteile nehmen können (MOFFARTS et al. 2005).

Endogene Antioxidantien, wie zum Beispiel die Enzyme Superoxid-Dismutase (SOD), Katalase (CAT), Glutathionperoxidase (GSHPx) und Glutathion-Reduktase (GR) können dem Schaden prooxidativer Moleküle nur ungenügend entgegenwirken.

Mit der Nahrung aufgenommene Vitamine, vor allem alpha-Tocopherol (Vitamin E), Ascorbinsäure (Vitamin C) und beta-Carotin, tragen wesentlich zum effektiven antioxidativen Schutz des Körpers bei (HALLIWELL et al. 1996).

Oxidativer Stress ist Bestandteil verschiedener Pathomechanismen und wird als Ursache oder auch Folgeerscheinung verschiedenster Erkrankungen diskutiert (DEATON und MARLIN 2005, JENNER et al. 2003).

So gilt er als wesentlicher Bestandteil neurodegenerativer Erkrankungen wie Morbus Parkinson (PD), Morbus Alzheimer (AD) und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS)(HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999; FACHERIS, BERETTA und FERRARESE 2004).

Es konnte nachgewiesen werden, dass Patienten, die an oben genannten Erkrankungen leiden, in den betroffenen Hirnarealen erhöhte Konzentrationen reaktiver Sauerstoffmetabolite aufweisen (ANDERSEN 2004). So wurden zum Beispiel im Cortex und in der Region des Hippocampus von an Alzheimer erkrankten Patienten erhöhte Konzentrationen von Lipidperoxidationsprodukten gemessen (4- Hydroxynonenal (4-HNE) und Malondialdehyd (MDA)) (ANDERSEN 2004). Ähnlich erhöhte Konzentrationen dieser Produkte fand man in der Substantia nigra von Parkinson-Patienten (JENNER 2004) und im Liquor cerebrospinalis von ALS- Patienten (BEAL 2004).

Die Konzentration antioxidativer Enzyme wie Superoxid-Dismutase (SOD), Katalase (CAT), Glutathion-Peroxidase (GSHPx) und Glutathion-Reduktase (GR) scheint in veränderten Hirnarealen von Alzheimer-Patienten verringert zu sein. Somit ist der

körpereigene Abwehrmechanismus gegenüber reaktiven Sauerstoffmetaboliten (ROS) reduziert (ZEMLAN et al. 1989).

Zur Diskussion steht, ob oxidativer Stress eng mit der exzitatorischen Neurotoxizität verknüpft ist (FACHERIS, BERETTA und FERRARESE 2004).

2.1 Reactive Oxygen Species (ROS), Reaktive Sauerstoffmetabolite

2.1.1 Definition und Bedeutung von ROS

Als “Reactive Oxygen Species” (ROS) bezeichnetet man eine Gruppe radikaler und nicht radikaler hochreaktiver Sauerstoffmetabolite.

Zu den radikalen Metaboliten zählt man das Superoxid, das Hydroxylradikal, das Perhydroxylradikal, das Alkoxylradikal und das Peroxylradikal und zu deren nicht radikalischen Derivaten Singulett-Sauerstoff, Hydroperoxid und Wasserstoff- superoxid.

Hochreaktiv sind diese Moleküle aufgrund ihrer Elektronenkonfiguration. So ist der Singulett-Sauerstoff (¹O2) als starkes Oxidationsmittel wesentlich reaktiver als der respiratorisch aufgenommene atmosphärische Triplett-Sauerstoff (SIES 1985).

Sauerstoff im Grundzustand hat zwei ungepaarte Elektronen in einem Orbital, die einen parallelen Spin aufweisen, und befindet sich in einer Triplett-Anordnung.

Singulett-Sauerstoff hingegen trägt eines der ungepaarten Elektronen auf einem Orbital höherer Energie in umgekehrtem Spin. Man unterscheidet zwei Formen von Singulett-Sauerstoff, delta und sigma, je nachdem, ob sich beide Elektronen auf einem oder auf zwei unterschiedlichen Orbitalen befinden (SIES 1985).

Beide Singulett-Sauerstoff-Formen sind wesentlich reaktiver als die Triplett-Form und können Kettenreaktionen auslösen, in deren Verlauf einzelne Elektronen aus anderen Molekülen extrahiert werden, so dass diese Moleküle selbst zu freien hochreaktiven Radikalen werden.

Ein Beispiel hierfür ist die durch Singulett-Sauerstoff ausgelöste Lipidperoxidation, bei der durch Abspaltung eines Wasserstoffatoms (H•) von einer ungesättigten

Fettsäure ein Lipidradikal entsteht, welches eine Kettenreaktion initiiert, bei der Lipidhydroperoxide frei werden, die wiederum zu messbaren Endprodukten wie

Ethan (CH3-CH3), n-Pentan (CH3-CH2-CH3) und Malondialdehyd (O=CH-CH2-CH=O) weiterreagieren. Die Radikalkettenreaktion wird gestoppt, sobald

zwei Radikale miteinander in Reaktion treten (GUTTERIDGE 1982).

Die ROS zeichnen sich durch ihre extrem kurze Halbwertszeit aus (YU 1994) und entstehen selbst während des Elektronentransports aus Sauerstoff in der mitochondrialen Atmungskette (MC CORD und FRIDOVICH 1970, HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999, YU 1994) und bei verschiedenen Hydroxylierungs- und Oxigenierungsreaktionen.

Die Reduktion des Sauerstoffs in der mitochondrialen Atmungskette erfolgt über Ein-, Zwei-, Drei- oder Vierelektronenschritte. Wird ein Elektron übertragen, entsteht das Superoxidradikal (O2-•), bei zwei Elektronen das Peroxid (O22-), im zweistufigen Dreielektronenschritt das Hydroxylradikal (HO•) und während der „klassischen“

mitochondrialen Atmung über einen Vierelektronenschritt Wasser und Energie als Adenosintriphosphat (ATP) (DROEGE 2002).

Desweiteren spielen reaktive Sauerstoffmetabolite eine Schlüsselrolle in der Protein- Oxidation und der Schädigung von Desoxyribonukleinsäuren. Beide Prozesse, wie auch die Lipidperoxidation lösen eine Reaktionskaskade aus, die zur Zelldegeneration und somit zur Gewebsschädigung führt (vgl. Abb. 2).

Nekrose und Apoptose, beides Formen der Zelldegeneration, werden mit reaktiven Sauerstoffmetaboliten in Verbindung gebracht (BUTTERFIELD et al. 1999;

HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999).

Die Nekrose ist charakterisiert durch frühes Anschwellen einzelner Zellorganellen wie auch der gesamten Zelle. Der Verlust der Integrität verschiedener zellulärer Membranen (Plasmamembranen, Mitochondrienmembranen, peroxisomale Membranen und lysosomale Membranen) kann zum Zusammenbruch der Zelle und zur Ausschüttung des Zellinhalts in das umgebende Gewebe führen.

Dementsprechend beeinträchtigt der nekrotische Zelluntergang benachbarte Zellen durch Freisetzung lysosomaler Enzyme, Prooxidantien wie Eisen- und Kupferionen,

aber auch Antioxidantien wie zum Beispiel Katalase, Superoxid-Dismutase (SOD) und Glutathion (GSH) (HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999).

Der Apoptose-Mechanismus wiederum beginnt mit der Schrumpfung der Zelle und schreitet fort mit der Kondensation und Fragmentation von Chromatin. Weitere Charakteristika der Apoptose sind der Zusammenbruch der Zytoskelett-Struktur, Zellkern-Fragmentierung und eventuell der Zerfall der Zelle in apoptotische Zellfragmente ohne Desintegrierung mitochondrialer oder lysosomaler Membranen.

Apoptopische Zelldegeneration beeinträchtigt benachbarte Zellen nicht (HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999).

ROS werden in direkten Zusammenhang mit Nekrose- und Apoptose- Zelldegenerations-Mechanismen gebracht. So geht man davon aus, dass erhöhte ROS-Konzentrationen und erhöhte Konzentrationen an reaktiven Stickstoffmetaboliten (RNS) auf Cystein-Proteasen einwirken können, indem sie deren funktionstragende Schwefel-Gruppen oxidieren und die Proteasen somit modifizieren (HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999).

Neben der Zelldegeneration nehmen ROS und RNS auch eine schädigende Position im Verlauf der Zellproliferation ein, indem sie direkt die Rezeptoren verschiedener Wachstumsfaktoren verändern, bzw. Proteinkinasen und Transkriptionsfaktoren in ihrer Funktion beeinträchtigen oder dies indirekt über Veränderungen im Redoxsystem von Glutathion oder von Thiol-Proteinen wie beispielsweise Thioredoxin veranlassen. Findet erst eine Beeinträchtigung verschiedener Transkriptionsfaktoren statt, sind die Genexpression und die Zellproliferation gestört (HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999).

2.1.2 Schaubild zum Pathomechanismus von Zelldegeneration durch ROS

Reaktive Sauerstoffmetabolite (ROS)

LIPID-PEROXIDATION PROTEIN-OXIDATION DNA-SCHÄDIGUNG

Membranschädigung Beeinträchtigung des DNA-Synthetase – Ca⁺⁺-Transportsystems Aktivierung

erhöhte intrazelluläre ATP- und NADPH-

Ca⁺⁺-Konzentration Depletion

Aktivierung Ca⁺⁺-abhängiger

Proteasen

ZELLDEGENERATION

Abb. 2 Schaubild zum Pathomechanismus von Zelldegeneration durch ROS (SPATZ und BLOOM 1992)

- ATP=Adenosintriphosphat

- Ca⁺⁺ =chemisches Symbol für Calzium

- DNA=desoxyribonucleid acid; oder DNS, Desoxyribonukleinsäure - NADPH=reduzierte Form von NAD: Nicotinamidadenindinucleotid

2.1.3 Übersicht ROS

In Tabelle 1 werden einige typische Beispiele für ROS aufgeführt.

ROS Chem.

Formel

Eigenschaften T1/2

[s]

Superoxidradikal O2-• Entstehung bei vielen Autoxidationsreaktionen; in hydrophoben Umgebungen reaktiver

Protonenakzeptor; generiert H2O2

1 x 10^-6 Hydroxylradikal HO• Entstehung metallkatalysiert (Fenton-Reaktion,

Haber-Weiß-Reaktion), hochreaktiv (Addition;

Abstraktion, Elektronen-Transfer-Reaktionen)

1 x 10^-9

Perhydroxyl- radikal

HO2• fettlöslicher als Superoxid, kann Lipidperoxidation initiieren Alkokxylradikal RO• Entstehung bei Lipidperoxidation,

in der Reaktivität mit Lipiden Mittelstellung zwischen HO• und ROO•

1 x 10^-6

Peroxylradikal ROO• Entstehung bei Lipidperoxidation, im Vergleich mit HO• niedrige Oxidationsfähigkeit, aber große Diffusionsfähigkeit

1 x 10^-2

Hydroperoxid ROOH Entstehung bei Lipidperoxidation n.b.

Wasserstoff- superoxid,

Hydrogenperoxid

H2 O2 besitzt kein ungepaartes Elektron; ist nicht radikal; hydrophil; Entstehung enzymatisch, Reaktionen mit organischen Substraten sind träge, hohe Diffusionsfähigkeit bspw. durch Lipidmembranen, die für SOD nur über Anionenkanäle passierbar sind; reagiert in Gegenwart von zweiwertigem Eisenion zum reaktiven Hydroxyl-Radikal (HO•)

n.b.

Singulett- Sauerstoff

1O2 Starkes Oxidationsmittel 1 x 10^-6 - bspw.=beispielsweise

- chem.=chemisch

- n.b.=nicht bekannt

- ROS=Reaktive Sauerstoffspezies - s=Kurzzeichen für Sekunde - SOD=Superoxid-Dismutase - T ½=Halbwertszeit

Tab. 1: Übersicht ROS (YU 1994; FLORENCE 1990, ROSS und MOLDEUS 1991;

SPATZ und BLOOM 1992)

2.1.4 Haber-Weiß-Reaktion

Eisenionen katalysieren die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies. Ein klassisches Beispiel hierfür ist die sogenannte Haber-Weiß-Reaktion.

Hierbei wird Fe³⁺ durch das Superoxidradikal (O2-•) zu Fe²⁺ reduziert. Das reduzierte Ion reagiert dann mit Wasserstoffsuperoxid (H2O2) zu dem extrem reaktiven Hydroxylradikal (HO•) (LEEUWENBURGH und HEINECKE 2001). Dieses Molekül gilt als wichtigste Form reaktiver Sauerstoffspezies und bedeutendste Quelle zellulärer oxidativer Schädigung von Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten und DNA, während das für Peroxidationsketten instabile O2-• -Radikal dazu nicht in der Lage ist. Diskutiert wird diese Reaktion bei neurologischen Erkrankungen vor dem Hintergrund, dass die Eisenionen-Konzentration in der Substantia nigra vergleichsweise hoch ist (JENNER 2003).

Fe²⁺ + H2 O2

→

(GUTTERIDGE 1982)

2.2 Reactive Nitrogen Species (RNS), Reaktive Stickstoffmetabolite

2.2.1 Entstehung und Bedeutung der RNS

Neben reaktiven Sauerstoffmetaboliten spielen auch reaktive Stickstoffmetabolite in der Entstehung von oxidativem Stress eine bedeutende Rolle (DROEGE 2002).

Stickstoffoxid fungiert vor allem im peripheren Nervensystem als interzellulärer Botenstoff, übernimmt diese Funktion aber auch bei Neuronen des Gehirns. Nitrit und Nitrat können im Liquor cerebrospinalis nachgewiesen werden (AYOMA et al.

2000). Stickstoffoxid ist eine Quelle reaktiver Stickstoffmetabolite und wird in der Humanmedizin mit neurodegenerativen Erkrankungen in Zusammenhang gebracht.

Im Pathomechanismus von Morbus Parkinson zum Beispiel nimmt die Aktivierung von Gliazellen, insbesondere der Mikroglia, eine Schlüsselposition ein. Hierbei werden nicht nur vermehrt Zytokine und Glutamat produziert, sondern auch reaktive Stickstoff- und reaktive Sauerstoff-Metabolite, die toxisch auf dopaminerge Zellen einwirken (JENNER 2003).

Das Stickoxid-Radikal (NO•) entsteht durch Oxidation eines der terminalen Guanido- Nitrogen-Atome von der Aminosäure L-Arginin. Katalysiert wird diese Reaktion durch die Stickstoffoxid-Synthetase (NOS) (DROEGE 2002).

Stickstoffoxid (NO) kann enzymatisch und nicht enzymatisch aus Nitrit beispielsweise bei Ischämie gebildet werden. NO und ROS verbinden sich zum Oxidationsmittel Peroxynitrit (ONOO^-). Peroxynitrit ist ein hochreaktives Oxidationsmittel mit ausgeprägter zytotoxischer Wirkung, das besonders zu Endothelschädigung führt, die Thrombozytenaggregation steigert und die Ansprechbarkeit der Koronargefäße auf Vasodilatatoren vermindert (FOELSCH und KOCHSIEK 2000).

NO kann aber auch in das reaktive Nitrosonium-Kation (NO⁺) oder in das Nitroxyl- Anion (NO^-) umgewandelt werden (FOELSCH und KOCHSIEK 2000). Zwischen- produkte können auch S-Nitrosocysteine oder S-Nitroso-Glutathione sein (DROEGE et al. 2000).

2.2.2 Übersicht RNS

Nichtradikale Chem.

Formel

Stickstoffsäure HNO2

Dinitrogen Tetroxid N2O4

Dinitrogen Trioxid N2O3

Peroxynitrit ONOO^-

Peroxynitro-Säure ONOOH

Nitronium Kation NO2+

Alkyl Peroxynitrat ROONO

Tab. 2: Übersicht über RNS-Radikale, Nichtradikale und ihre chemischen Formeln

chem.=chemisch

2.3 Antioxidantien

2.3.1 Definition und Bedeutung

Antioxidantien verzögern oder verhindern die Oxidation von oxidierbaren Substraten (Proteine, Lipide, Kohlenhydrate und DNA) (HALLIWELL and GUTTERIDGE 1999).

Physiologischerweise besteht ein Gleichgewicht zwischen der Entstehung freier Radikale und deren Elimination durch antioxidative Abwehrmechanismen. Man kann enzymatische von nicht enzymatischen Mechanismen unterscheiden.

Radikale Chem.

Formel

Stickstoffoxid NO HO•

Stickstoffdioxid NO2•

Zu den enzymatischen Antioxidantien zählt beispielsweise die Familie der Superoxid- Dismutasen (SODs), die die Reaktion zweier Superoxidionen (O2-) zu Wasserstoffperoxid (H2O2) und Sauerstoff katalysieren. Das reaktive Sauerstoff- metabolit Wasserstoffperoxid wird dann enzymatisch durch Katalase (CAT) in den Peroxisomen und durch zytosolische Glutathionperoxidase (GSHPx) zu Wasser und Sauerstoff reduziert.

Neben enzymatischen Antioxidantien dienen zahlreiche nicht enzymatische Stoffe als Radikalfänger wie beispielsweise Glutathion, Coeruloplasmin, Ubiquinon und Melatonin, aber auch Vitamin E und C (DROEGE 2002). Das fettlösliche Vitamin E entfaltet seine antioxidative Wirkung gegenüber freien Radikalen in der Zellmembran, in die es integriert ist, während das wasserlösliche Vitamin C auch im Plasma Schutz gegenüber Oxidationsreaktionen bietet.

Molekulare Reparaturmechanismen, die veränderte Moleküle entfernen, setzen ein, bevor der Zellstoffwechsel beeinträchtigt ist (GUTTERIDGE et al. 2000).

2.3.2 Übersicht antioxidativer Abwehrmechanisme Antioxidatives

System

a) nicht enzymatisch:

Eigenschaften

Alpha-Tocopherol (Vitamin E)

membrangebunden, lipophil, reagiert mit zahlreichen

Radikalen zum freien Chromanoxyl-Radikal (Vit-E-O•), das stabil ist und mit sich selbst oder mit Ascorbinsäure natives Vitamin-E generiert (Vit-E-OH);

unterbricht Lipidperoxidations-Kettenreaktionen Ascorbinsäure

(Vitamin C)

hydrophil; unspezifischer Radikalfänger; reagiert mit Oxidantien (Hydroxyl-Radikal, Peroxyl-Radikal, Singulett- Sauerstoff) zum freien und stabilen Semiquinon-Radikal Beta-Karotin,

Vitamin A

Singulett-Sauerstoff- Radikalfänger

Harnsäure Singulett-Sauerstoff- Radikalfänger Flavinenzyme pflanzliche Antioxidantien Synthetische

Antioxidantien

BHT (butyliertes Hydroxytoluoen), BHA (butyliertes Hydroxyanisol)

Plasma-Proteine bspw. Coeruloplasmin (Akut-Phase-Plasmaprotein;

Eisenionen-Carrier)

b) enzymatisch Eigenschaften

Superoxid-Dismutase (SOD)

involviert in die Reduktion von Superoxidradikal (O2-•) zu Wasserstoffsuperoxid (H2 O2);

SOD1: v.a. zytoplasmatisch, Kupfer und Zink enthaltend SOD2: mitochondrial, Mangan enthaltend

SOD3: extrazellulär

Glutathion (GSH) häufigstes zelluläres Thiol-reduzierendes Agens; ein Tripeptid bestehend aus Glutamat, Cystein und Glycin Glutathion-

Peroxidasen

Selenoprotein; in Zytoplasma und Mitochondrien vorkommend;

Reduktion von Wasserstoffsuperoxid (H2O2)

zu Sauerstoff (O2) und Wasser (H2O) Glutathion-Reduktase

(GR)

in Zytoplasma und Mitochondrien vorkommend;

NADPH-abhängiges Enzym, das oxidiertes Glutathion zu Glutathion (GSH) reduziert

Katalase (CAT) hauptsächlich in Peroxisomen, aber auch in Mitochondrien vorkommend; Reduktion von Wasserstoffsuperoxid (H2O2) zu Sauerstoff (O2) und Wasser (H2O)

c) sekundär

enzymatisch Eigenschaften

NADPH-Quinon Oxireduktase

Zwei-Elektronen-Reduktion; Dicumarol-empfindlich Konjugationsenzyme UDP-Glucoronyltransferase

Sulfotransferase GSH-S-Transferase

NADPH-Lieferant Glukose-6-Phosphat Dehydrogenase;

6-Phosphogluconat Dehydrogenase;

Isocitrat-Dehydrogenase;

Transportsysteme GSSG-Transport, Konjugat-Export

Tab. 3: Übersicht antioxidativer Abwehrmechanismen (SIES 1985; SPATZ und BLOOM 1992)

2.3.3 Allgemeine antioxidative Abwehrmechanismen in biologischen Systemen

Antioxidative Mechanismen:

• Entfernung des Sauerstoffs

• Abfangen reaktiver Sauerstoff-/ Stickstoff-Substrate

• Hemmung der Bildung von ROS/ RNS

• Bindung der Metallionen, die als Katalysatoren der ROS benötigt werden

• Aufregulierung endogener antioxidativer Abwehrmechanismen

• Reparaturmechanismen

• Radikal-Radikal-Reaktionen

• Oxidation und Reduktion von Radikalen

• Nichtradikalische Reduktion von Hydroperoxiden

• Induktion von detoxifizierenden Enzymen (HALLIWELL 1996)

2.3.4 Funktionsmechanismen einzelner Antioxidantien

Antioxidative Mechanismen lassen sich in ein primäres und ein sekundäres System gliedern. Während primär wirkende Mechanismen die Bildung reaktiver Sauerstoffmetabolite unterdrücken, reduzieren bzw. neutralisieren sekundär wirkende Mechanismen vorhandene Radikale (BURTON et al. 1985).

a) Primäres antioxidatives System:

Die mitochondriale Atmung gilt als bedeutendste Quelle reaktiver Sauerstoff- metabolite. Infolge der engen elektrochemischen Kopplung der Atmungskette wird ein Entweichen der ROS weitestgehend verhindert. Transferrin und Ferritin binden Eisenionen, so dass diese nicht als Katalysatoren der Produktion von ROS verfügbar sind. Außerdem oxidiert Coeruloplasmin Eisen zum dreiwertigen Eisenion, das die Lipidperoxidation nicht katalysieren kann.

b) Sekundäres antioxidatives System:

Bestehende ROS werden mit Hilfe folgender Mechanismen reduziert bzw.

neutralisiert:

Superoxid-Dismutase (SOD):

Als zytoplasmatisches, mitochondriales oder extrazelluläres Enzym katalysiert die Superoxid-Dismutase das sehr reaktive Superoxidradikal (O2-•) zum weniger reaktiven Wasserstoffsuperoxid (H2O2) (KLEIN und ACKERMANN 2003). Das Superoxidradikal und Wasserstoffsuperoxid können Zellbestandteile schädigen.

Wasserstoffsuperoxid durchdringt mit Leichtigkeit Zellmembranen (HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999).

2O2- + 2H^{+ SOD}

→

(YU 1994; HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999)

Katalase (CAT):

Katalase kommt vor allem in den Peroxisomen vor und reduziert Wasserstoffsuperoxid zu Sauerstoff und Wasser (KAPPUS und SIES 1981).

2 H2O2

→

→

(HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999)

Glutathion-Peroxidase (GSHPx):

Die Glutathion-Peroxidase kommt im Zytoplasma, aber auch in den Mitochondrien vor. Sie katalysiert die Reduktion von H2O2 und Lipidhydroperoxiden zu Sauerstoff und Wasser (KAPPUS et al. 1981). Da Selen als Kofaktor fungiert, kann ein Selenmangel zu gesteigerter Lipidperoxidation führen (TAKEDA et al. 1984).

H2O2 + 2 GSH

→

→

Lipid-OOH + 2 GSH

→

→

Die Entgiftung von Hydroperoxiden durch Glutathion-Peroxidase ist direkt abhängig von einer ausreichenden Konzentration von oxidiertem Glutathion (GSSG). GSSG wiederum wird durch die NADH-abhängige Glutathion-Reduktase (GR) regeneriert (HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999).

Glutathion-Peroxidase, Glutathion-Reduktase, Glutathion (GSH) und NAD(P)H+H⁺ bilden ein gekoppeltes antioxidatives System (BIESALSKI et al. 2000), indem das

oxidierte Glutathion (GSSG) in Gegenwart von Glutathion-Reduktase (GR) und NAD(P)H zu Glutathion (GSH) reduziert wird.

GSSG + NAD(P)H + H^{+ GR}

→

LOH GSSG + H2O NAD(P)H + H⁺ LOOH 2 GSH NAD(P)⁺ Glutathion-Peroxidase Glutathion-Reduktase

(HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999) Harnsäure (UA):

Harnsäure bildet den wesentlichen Bestandteil des antioxidativen Potentials des Zytoplasmas (MIKAMI et al. 2000). Hydroxylradikale, Superoxid und Singulett- Sauerstoff oxidieren Harnsäure zu Allantoin (STRYER 1996).

HALLIWELL und GUTTERIDGE beschrieben 1990, dass Harnsäure in Reaktion mit freien Radikalen Harnsäureradikale (UA•) bilden kann, die wiederum durch Ascorbinsäure reduziert werden können.

(HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999)

Tocopherol, Vitamin E:

Das lipophile Vitamin E ist das bedeutendste Antioxidans in Lipidmembranen (TAKEDA et al. 1984, FRANK et al. 1985).

Mit seiner Affinität zu Lipidradikalen (Lipid•) und Lipidperoxylradikalen (Lipid-OO•) fängt es diese ab und unterbricht die Kettenreaktion der Lipidoxidation. Bei der resultierenden Kettenabbruchreaktion wird das Wasserstoffatom der phenolischen Hydroxylgruppe des Tocopherol auf Lipidperoxylradikale übertragen, so dass ein Tocopheroloxylradikal (TH•) entsteht (BIESALSKI et al. 2000).

Es wird durch Reduktionsmittel wie Ascorbinsäure und Glutathion wieder zu Tocopherol regeneriert.

Lipid• + TH2

→

Lipid- OO• + TH2

→

(HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999)

Ascorbinsäure (AA), Vitamin C:

Ascorbinsäure ist ein starkes Reduktionsmittel. Die Oxidation von Ascorbinsäure zu Dehydroascorbinsäure (DHA) verläuft über die intermediär entstehende radikale Monodehydroascorbinsäure (MDHA).

Diese drei chemischen Formen von Vitamin C stellen ein reversibles Redoxsystem dar (HENSCHLER und RUMMEL 1987).

(HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999)

Im Gegensatz zu alpha-Tocopherol (TH2) ist Ascorbinsäure hydrophil und erreicht deshalb in Lipidmembranen eine geringe Wirkkonzentration.

Sie reduziert das Tocopheroloxylradikal und regeneriert somit alpha-Tocopherol (BIESALSKI et al. 2000).

Lipid-OOH TH• AA NAD(P)⁺ Lipid- OO• TH2 AA• NAD(P)H + H⁺

(FRANKEL 1998)

Bilirubin:

Bilirubin reduziert zwei Hydroperoxidradikale und wird dabei zu Biliverdin oxidiert (STRAYER 1996).

2.4 Lipidperoxidation

2.4.1 Allgemeines zur Lipidperoxidation

Die Lipidperoxidation ist ein autokatalytischer, durch freie Radikale induzierter destruktiver Prozess, bei dem ungesättigte Fettsäuren, die vor allem in Zellmembranen vorkommen, peroxidiert werden (KNIGHT et al. 1988).

Entstehende Lipidhydroperoxide zerfallen zu Lipidalkoxylradikalen, Aldehyden (z.B.

Malondialdehyd), Alkanen, Lipidepoxiden und Alkoholen (HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999). Peroxidierte Membranen beeinträchtigen die Zellfunktion in vielerlei Hinsicht.

Die Zellmembranen verlieren ihre selektive Permeabilität (KERN 2003; CLARKSON et al. 2000). Eine Deaktivierung membrangebundener Rezeptoren und Enzyme (CLARKSON et al. 2000) ist ebenso eine Konsequenz der Lipidperoxidationsreaktion wie auch die Beeinträchtigung der Expression der DNA. Fehlerhafte Genexpression und Mutationen folgen. Somit stellt die Lipidperoxidation einen aussagekräftigen Indikator für Zellzerstörung dar (HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999).

2.4.2 Biochemische Reaktion

Im Verlauf der nicht enzymatischen Lipidperoxidation bringt ein freies Radikal (R•) genügend Energie auf, ein Wasserstoffatom vom Kohlenstoffatom einer ungesättigten Fettsäure (LH) abzulösen.

Initiation

Lipid- H + R•

→

Bei dieser sogenannten Initiation der folgenden Kettenreaktion entsteht ein Lipidradikal (L•), das mit molekularem Sauerstoff zu einem Peroxyradikal weiterreagiert (LOO•). Diesen Reaktionsschritt nennt man Peroxidation oder auch Propagation.

Propagation

Lipid1• + O2

→

(SPATZ und BLOOM 1992)

Das Peroxyradikal löst selbst ein Wasserstoffatom einer ungesättigten Fettsäure ab, so dass ein zweites Lipidradikal (L•) entsteht und das Peroxyradikal zum Lipidhydroperoxid wird (LOOH).

Lipidhydroperoxide können spontan unter Erwärmung oder unter dem Einfluß von Metallkatalysatoren weitere Radikalkettenreaktionen initiieren (KAPPUS et al. 1981).

Lipid2-H + Lipid1-OO•

→

Lipid2• + O2

→

(SPATZ und BLOOM 1992)

Beendet wird diese Kettenreaktion, sobald zwei Radikale miteinander reagieren.

Termination L• + L•

→

LO2• + LO2•

→

LO2• + L•

→

Messbare Endprodukte der Lipidperoxidation sind Ethan, n-Pentan und Malondialdehyd (WENDEL und DUMELIN 1981).

Welches der Endprodukte entsteht, hängt davon ab, wieviele ungesättigte Doppelbindungen die reagierenden Fettsäuren besitzen. So entsteht bei der Peroxidation von omega-3 ungesättigten Fettsäuren Ethan und bei der Peroxidation von omega-6 ungesättigten Fettsäuren n-Pentan (KAPPUS et al. 1981).

Mindestens zwei Doppelbindungen sind notwendig, um Alkane zu bilden, und mindestens drei Doppelbindungen zur Entstehung von Malondialdehyd (MDA) (KAPPUS et al. 1981).

Bei der enzymatischen Lipidperoxidation findet die Reaktion im aktiven Zentrum verschiedener Enzyme wie der Cyclooxygenase und der Lipoxygenase statt.

Freie Radikale spielen auch hier eine maßgebliche Rolle, doch befinden auch sie sich im aktiven Zentrum der Proteine (GUTTERIDGE 1982).

2.4.3 Reaktionsmechanismus der Lipidperoxidation

Abb. 3: Bildung von MDA durch Lipidperoxidation nach KAPPUS und SIES (1981)

2.5 Marker für Lipidperoxidation

Die Lipidperoxidation als Folge des oxidativen Stresses und Bestandteil von Pathomechanismen einer Vielzahl von Erkrankungen gilt als aussagekräftiger Indikator der Zelldegeneration (HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999).

Malondialdehyd (MDA) und 4-Hydroxynonenal (4-HNE) sind zwei der Endprodukte der Lipidperoxidation und üben schädigenden Einfluß auf Zellen aus, indem sie Makrophagen inhibieren, Proteine verknüpfen, Enzyme inaktivieren und als chemotaktisches Agens für Phagozyten fungieren (SPATZ und BLOOM 1992).

2.6 Protein-Oxidation

Die Protein-Oxidation ist ein wesentlicher Bestandteil des oxidativen Stresses und beeinträchtigt direkt die Funktion verschiedener Rezeptoren, Enzyme, Antikörper, von Transport-Proteinen und Signal-Übertragungsmechanismen.

Indirekt wirkt die Protein-Oxidation durch Schädigung von DNA-Reparatur-Enzymen oder der DNA-Polymerase und führt zu neuen, eine Immunantwort provozierenden Antigenen (HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999).

Verschiedenste Faktoren induzieren einen unphysiologischen Anstieg der Protein- Oxidation im Körper (BERLETT und STADTMAN 1997).

• erhöhter Sauerstoffpartialdruck

• Überanstrengung

• Ischämie und Reperfusion

• zu schnelle Korrektur einer Hypernatriämie

• eine Paraquat (Kontaktherbizid)-Intoxikation

• ein Magnesium-Mangel

• Ozon-Belastung

• die Aktivierung neutrophiler Granulozyten

• passive und aktive Nikotininhalation

• Röntgenstrahlung

• chronischer Alkohol-Abusus

• eine Störung oxidativer Prozesse des Körpers

2.7 DNA-Schäden durch ROS/RNS

DNA-Schäden infolge oxidativen Stresses können, wie oben erwähnt, indirekt durch oxidative Schädigung von Polymerasen und Reparatur-Enzymen entstehen oder durch Zellkernsegmentierung infolge eines intrazellulären Kalzium-Ionen-Anstiegs.

Struktur-Veränderungen der DNA

Nuklease-Aktivierung Effektivitätsverlust der DNA-Polymerase und Lipidperoxidation DNA-Reparaturenzyme Anstieg der intrazellulären durch Protein-Oxidation Kalzium-Konzentration und Strukturänderungen

der DNA

ROS / RNS aktivierte zytoplasmatische

and nukleäre Signaltransduktion;

stimulierte Zellproliferation Redox-Regulation; moduliert Stress-induziert Proteine und DNA

reguliert Zellwachstum und Zelldifferenzierung;

Zelltot durch Apotose- und Nekrose-Mechanismen;

moduliert interzelluläre Kommunikation

Abb. 4: Übersicht über Veränderungen der Zelle durch ROS/RNS (HALLIWELL und GUTTERIDGE 1999)

2.8 Oxidativer Stress und Pathogenese verschiedener Erkrankungen

Oxidativer Stress wird als pathogenetische Komponente mit einer Vielzahl von Erkrankungen in Verbindung gebracht.

Beispielsweise scheint oxidativer Stress eine Schlüsselfunktion in der Gewebsschädigung infolge Ischämie einzunehmen (SPATZ und BLOOM 1992). Die Gewebeschäden sind dabei nicht allein durch den Mangel an Sauerstoff während der Ischämiephase, sondern auch durch die Reperfusion und Sauerstoffzufuhr der ischämischen Organe bedingt (SPATZ und BLOOM 1992). Eine frühe Restitution des Blutflusses im ischämischen Gewebe wirkt der Progression der Sauerstoffmetabolit- assoziierten Zellschädigung und Ansammlung schädigender Stoffwechselprodukte entgegen. Paradoxerweise scheint die Gewebsreperfusion mit gewebsschädigenden Prozessen assoziiert zu sein, bspw. mit der Bildung reaktiver Sauerstoffmetabolite.

Die in der Ischämiephase akkumulierten ATP-Abbauprodukte Hypoxanthin und Xanthin reagieren dabei mit dem einströmenden Sauerstoff zu reaktiven Sauerstoffverbindungen (SPATZ und BLOOM 1992). Katalysiert wird diese Radikalproduktion durch die Xanthinoxidase (SIES 1991).

Oxidativer Stress infolge eines Traumas stellt ebenfalls einen Themenkomplex dar, der sowohl in der Humanmedizin als auch in der Tiermedizin Beachtung findet.

So gehen HALL und BRAUCHLER (1988) davon aus, dass der größere Anteil einer posttraumatischen Neuronen-Nekrose eines Hirn- oder Rückenmarktraumas nicht auf die diffuse Schädigung infolge der Krafteinwirkung zurückzuführen ist, sondern vielmehr auf progressive sekundäre pathophysiologische Prozesse, wie oxidativer Stress.

Zahlreiche Beispiele veranschaulichen die Gewichtigkeit oxidativen Stresses in der Pathophysiologie von Erkrankungen bei Mensch und Tier. So ist er von zentraler Bedeutung im Pathomechanismus der Arteriosklerose des Menschen (SIES 1991;

ONG und HALLIWELL 2004), beeinflußt die Karzinogenese maßgeblich, den Bluthochdruck, ist beteiligt am Pathomechanismus des Diabetes mellitus (DROEGE 2002), in chronischen entzündlichen Prozessen, der zystischen Fibrose (MADARASI et al. 2000), beim chronischen Nierenversagen (DURAK et al. 2001; RUSTOM et al.