In vitro-Versuche zeigen, dass geringe Konzentrationen von chemotaktischen Faktoren - hier crIL-8 (canines rekombinantes Interleukin-8) und hrC5a (humanes rekombinantes C5a) - eine verstärkte Aktivierung caniner neutrophiler Granulozyten zeigen, wenn die Zellen erneut mit dem gleichen Agens stimuliert werden. Dieses Priming wird auch durch eine Kreuzstimulation durch crIL-8 als erste (bzw. zweite) und hrC5a als zweite (bzw. erste) Stimulation verursacht. Das Phänomen könnte in vivo eine wichtige Funktion bei der Aktivierung und dem Rekruitment von neutrophilen Granulozyten durch geringe Konzentrationen von chemotaktischen Faktoren haben [BURGENER et al., 1998].
2.4 Antineutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCA)
Antineutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCA) sind Autoantikörper der Immunglobulinklasse IgG, die an Rezeptoren der körpereigenen neutrophilen Granulozyten binden. Zu den Hauptantigenen, die bei aktivierten Granulozyten auch auf der Zellmembran exprimiert bzw. degranuliert werden, zählen Proteinase 3 (PR3) und Myeloperoxidase (MPO).
ANCA können bei verschiedenen Immunvaskulitiden des Menschen nachgewiesen werden. Zu diesen ANCA-assoziierten Vaskulitiden zählen unter anderem die Wegeners Granulomatose und das Kawasaki-Syndrom. Bei zwei von drei an SRMA erkrankten Hunden wurden ANCA im Serum nachgewiesen [FELSBURG et al., 1992]. ANCA können aber auch bei verschiedenen anderen Erkrankungen des Menschen nachgewiesen werden, bei denen keine Vaskulitiden auftreten. Zu diesen Erkrankungen zählen unter anderem auch HIV-Infektionen und andere akute und chronische Infektionen [HAGEN et al., 1993]. Die Antigene, gegen die ANCA gerichtet sind, sind dabei zum Teil noch nicht identifiziert.
Auch bei 58 % der Patienten mit ulzerativer Colitis konnten mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz MPO-ANCA nachgewiesen werden [RUMP et al., 1993]. ANCA gegen MPO zeigten sich in verschiedenen Studien bei 20 - 40 % der Patienten mit Morbus Crohn [SNOOK, 1989; SAVIGE, 1999], bei 20 % der Patienten mit Lupus
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erythematosus [NASSBERGER, 1989], bei 80 % der Patienten mit chronisch aktiver Hepatitis und bei 25 - 30 % der Patienten mit rheumatoider Arthritis [SAVIGE, 1999].
Der Einfluss der ANCA auf die Pathogenese der Erkrankungen ist noch nicht geklärt. Vermutlich sind ANCA nicht die Ursache für die genannten Erkrankungen des Menschen, sondern eine Folge der inflammatorischen Prozesse [SALANT, 1999]. Zu den Hypothesen über die schädigende Wirkung der Autoantikörper zählen direkte Aktivierung von neutrophilen Granulozyten und Monozyten, die Bindung an Endothelzellen und die Immunkomplexbildung [FALK et al., 2000].
Tab. 2.1: Erkrankungen des Menschen mit möglichem ANCA-Nachweis.
[nach HAGEN et al., 1993]
Krankheiten Zielantigen Wegeners Granulomatose PR3, selten MPO Kawasaki-Syndrom PR3 und MPO Mikroskopische Polyarteriitis PR3 und MPO Churg-Strauss-Syndrom MPO
Polyarteriitis nodosa selten, sonst PR3 oder MPO systemische
Vaskulitiden
andere systemische
Vaskulitiden selten, nicht PR3 oder MPO Rheumatoide Arthritis unbekannt, Laktoferrin, ANA,
selten MPO Rheumatische
Erkrankungen Systemischer Lupus
erythematosus selten MPO oder Laktoferrin Ulzerative Colitis Kathepsin-G, Laktoferrin,
unbekannt Entzündliche
Darmerkrankungen
Morbus Crohn Kathepsin-G, Laktoferrin, unbekannt
chronische Lebererkrankungen Kathepsin-G, Laktoferrin, unbekannt
akute / chronische Infektionen unbekannt andere
Erkrankungen
Infektion mit humanem
Immundefizienz-Virus (HIV) unbekannt, PR3 und MPO
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Die Aktivierung von neutrophilen Granulozyten durch ANCA-IgG findet durch die Bindung des Fc-Anteil des Antikörpers an den FcγRIIa-Rezeptor (CD 32) und an den FcγRIIIb-Rezeptor (CD 16b) [PORGES et al., 1994; KOCHER et al., 1998] statt.
Die zytoplasmatische Domäne des FcγRIIa-Rezeptors enthält ein Tyrosin-Aktivierungsmotiv (ITAM), das rezeptorvermittelte Funktionen wie Degranulation, Phagozytose, Freisetzung von Sauerstoffradikalen [PORGES et al., 1994], antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität, Zytokinproduktion und -freisetzung aktiviert [KIMBERLY, 2000]. Der Rezeptor hat zudem eine besondere Affinität zu humanen IgG3-Subklassen [KALLENBERG, 1998].
Die Bindung an den FcγRIIIb-Rezeptor führt zur Aufregulierung von CD11b/CD18 Adhäsionsmolekülen. Sie verursachen das Rollen der neutrophilen Granulozyten auf der Endotheloberfläche und nachfolgend die Adhäsion an Endothelzellen, wo sie den Blutfluss stören und das Gewebe schädigen können [KOCHER et al., 1997].
Da ANCA die intakte Zellmembran von neutrophilen Granulozyten nicht durchdringen können, ist eine Bindung nur möglich, wenn die Antigene auf der Oberfläche der Zellen exprimiert werden. Die Exprimierung geschieht auf der Oberfläche von zytokin-aktivierten und nicht-apoptotischen neutrophilen Granulozyten [FALK et al., 1990; CSERNOK et al., 1994], aber auch auf der Zellmembran apoptotischer neutrophiler Granulozyten [GILLIGAN et al., 1996].
Die Bindung von ANCA an Neutrophile führt zur Degranulation mit der Freisetzung lytischer Enzyme, dazu zählen auch PR3 und MPO, zur Produktion freier Sauerstoffradikale [FALK et al., 1990] und zur Sekretion von Zytokinen wie IL-1-beta (Interleukin 1-beta) [BROOKS et al., 1996; KALLENBERG, 1998] und IL-8 [COCKWELL et al., 1999].
ANCA aktivieren zudem den Lipoxygenasestoffwechsel neutrophiler Granulozyten.
Dadurch wird die Produktion des Leukotriens B4 erhöht, welches die Produktion und Freisetzung von Sauerstoffmetaboliten stimuliert und bei Freisetzung auf neutrophile Granulozyten chemotaktisch wirkt [GRIMMINGER, 1996].
An TNF-aktivierte Neutrophile gebundene ANCA verursachen eine beschleunigte Apoptose der Zellen durch Erzeugung von reaktiven Sauerstoffradikalen. Bei der Apoptose ist normalerweise der Abbau des Zellkernes mit spezifischen
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Veränderungen an der Zellmembran verbunden. Durch die Membranveränderungen wird die Zelle von Makrophagen als apoptotisch erkannt. Die ANCA-induzierte Apoptose verursacht jedoch die Abkopplung der nukleären von den Membranveränderungen. Dadurch stirbt die Zelle ab, ohne dass sie von außen als tot erkannt wird. Die Erkennung und Phagozytose der apoptotischen Zellen durch Makrophagen ist somit vermindert bzw. verlangsamt [HARPER et al., 1998]. Die Ansammlung von apoptotischen Neutrophilen hat einen hohen phlogistischen Effekt und verursacht eine weitere Gewebeschädigung [SAVAGE, 2000].
Bei der Bindung an Monozyten verursachen ANCA die Produktion von Sauerstoffmetaboliten [EWERT et al., 1991] und von MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), von dem bekannt ist, dass es eine wichtige Rolle bei der Bildung von granulomatösen Veränderungen spielen kann [CASSELMANN et al., 1995].
ANCA binden zudem an das Enzym HLE (human leucocyte elastase), das neben neutrophilen Granulozyten auch Monozyten exprimieren [BROUWER et al., 1994].
Auch BPI (bactericidal / permeability increasing Protein) gilt als wichtiges Antigen für ANCA bei humanen Vaskulitiden [ZHAO et al., 1995]. Bei einigen ANCA-positiven Seren kann eine Bindung an Azurozidin nachgewiesen werden. Azurozidin gehört wie PR3 zu der Familie der neutralen Serinproteinasen, zeigt aber im Gegensatz zu PR3 keine proteolytische Aktivität [ZHAO u. LOCKWOOD, 1996].
Weitere zytoplasmatische Rezeptoren, für die ANCA-Bindungen nachgewiesen werden konnten, sind alpha-Enolase, Katalase, Aktin, Cathepsin G, Laktoferrin, Lysozym, HMG1, HMG2 (high-mobility-group nonhistone chromosomal proteins) und weitere, nicht identifizierte Strukturen [SAVIGE et al., 1999].
Die bisher durchgeführten in vivo Tiermodelle zeigen, dass die alleinige Anwesenheit von ANCA nicht pathogen wirkt, sondern zusätzliche Faktoren zum Priming oder zur Stimulation der neutrophilen Granulozyten und Monozyten nötig sind, um eine Bindung der ANCA an die Zellen und damit eine gewebeschädigende Wirkung zu ermöglichen [BROUWER et al., 1993; HEERINGA et al., 1998; SALANT, 1999].
28 2.4.1. Antikörper gegen Proteinase 3
Proteinase 3 (PR3) oder Myeloblastin ist eine 29 kD neutrale Serinproteinase in den azurophilen (alpha-) Granula [FOURET et al., 1989] und der Plasmamembran von sekretorischen Vesikeln polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten [WITKO-SARSAT et al., 1999]. PR3 wird auch auf der Zellmembran aktivierter [CSERNOK et al., 1994] oder apoptotischer neutrophiler Granulozyten [GILLIGAN, 1996] exprimiert. Außerdem ist PR3 in bestimmten Subpopulationen in monozytären Lysosomen nachweisbar [BROUWER et al., 1994].
PR3 wird synthetisiert als Präproenzym, das erst nach zwei weiteren intrazellulären proteolytischen Entwicklungsschritten enzymatische Wirkung besitzt. Nach Abspaltung des Signalpeptids und dem Verlassen des endoplasmatischen Retikulums trägt PR3 noch ein N-terminales Aktivierungs-Dipeptid, welches das Proenzym in einer inaktiven Form hält. Die Abspaltung dieses Peptids führt zu einer Einfaltung des freien N-Terminus. Dadurch wird die aktive Seitentasche zugänglich und das Enzym erreicht seine enzymatische Aktivität. In den azurophilen Granula liegt PR3 in N-terminaler Form vor [SPECKS, 2000].
Die Translokation von intragranulärem PR3 auf die Zelloberfläche findet nach der Aktivierung der neutrophilen Granulozyten durch TNF-alpha und IL-8 statt [CSERNOK et al., 1994].
Am Ort der Entzündung wird PR3 von aktivierten neutrophilen Granulozyten in großen Mengen freigesetzt und verursacht die Hydrolyse von Matrixproteinen und bioaktiven Polypeptiden [BANK et al., 2000]. PR3 ist beteiligt am Abbau von z.B.
Elastin, Proteoglykanen, Membranbestandteilen und den 4 Subklassen von humanem IgG [WIIK, 2000].
In vitro verursacht PR3 die Apoptose von bovinen Endothelzellen der Pulmonalarterien [TAEKEMA-ROELVINK, 1998] und die Trennung und Zytolyse von Endothelzellen der humanen Vena umbilicalis (HUVEC) [BALLIEUX et al., 1994].
Bei Endothelzellen ist in Anwesenheit von PR3 in vitro eine erhöhte Produktion von IL-8, das eine starke chemotaktische Wirkung auf neutrophile Granulozyten hat, und von MCP-1, das chemotaktisch auf Monozyten und T-Zellen wirkt, nachgewiesen.
Zudem verursacht PR3 die erhöhte Expression von verschiedenen
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Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen. Deshalb wird eine Bindung zwischen PR3 und Endothelzellen vermutet [TAEKEMA-ROELVINK, 2000].
Antikörper gegen Proteinase 3 zeigen bei der Immunfluoreszenzfärbung eine diffuse granuläre zytoplasmatische Färbung mit zentraler Akzentuierung und Aussparung des Zellkernes. Durch das typische Färbebild werden die Antikörper auch als cANCA (cytoplasmatic ANCA) bezeichnet [HOFFMANN u. SPECKS, 1998].
Frei zirkulierendes PR3 wird durch das Enzym alpha-1-Antitrypsin inaktiviert. Die Bindung von Anti-PR3 an freies PR3 verhindert jedoch die Inaktivierung. Die Komplexbildung verlangsamt vermutlich den Abbau des PR3 und verursacht eine Ansammlung der Anti-PR3-PR3-Komplexe im Gewebe. Die spätere Dissoziation der Verbindung führt zu einer weiteren Schädigung des Gewebes durch das noch aktive Enzym [DAOUK et al., 1995].
Bei Patienten mit Entzündungen des Respirationstraktes, die PR3-ANCA im Serum zeigten, wurden große Mengen PR3-alpha-1-Antitrypsin-Komplexe im purulenten Sputum nachgewiesen. Die Anwesenheit von PR3 kann zu einer Immunantwort mit Bildung von Autoantikörpern (ANCA) bei empfänglichen Individuen führen [BALLIEUX et al., 1992].
Anti-PR3-Antikörper verursachen bei Bindung an Endothelzellen die Expression von VCAM-1 und die Ausschüttung von IL-8 [MAYET et al., 1999].
In vitro ist unter dem Einfluss von PR3 und PR3-ANCA eine signifikante Proliferation von T-Lymphozyten, die von Patienten mit ANCA-assoziierten Immunvaskulitiden gewonnen wurden, nachgewiesen. Die T-Zellantwort dauert durch alle Krankheitsstadien auch während der Remission an [KING et al., 1998].
Antikörper gegen PR3 treten bei der humanen Wegeners Granulomatose, aber auch bei dem Kawasaki-Syndrom und in geringerem Umfang bei der mikroskopischen Polyangiitis auf.
30 2.4.2. Antikörper gegen Myeloperoxidase
Myeloperoxidase (MPO) ist ein Hämoprotein [SPECKS, 2000] und lässt sich sowohl in den azurophilen Granula polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten, als auch in der Plasmamembran stimulierter neutrophiler Granulozyten [FOURET et al., 1989]
und in den Lysosomen bestimmter Untergruppen von Monozyten nachweisen [BROUWER et al., 1994]. Auch apoptotische neutrophile Granulozyten exprimieren MPO auf der Zellmembran [GILLIGAN, 1996]. Als kationisches Protein mit einem isoelektrischen Punkt von 9,1 kann MPO nach der Degranulation von aktivierten neutrophilen Granulozyten an anionische Strukturen wie Basalmembranen oder die Oberfläche von Endothelzellen binden [HEERINGA et al., 1998].
MPO ist ein Tetramer, das aus zwei kleinen und zwei großen Untereinheiten besteht, die über Disulfid-Brücken miteinander verbunden sind. Das Präproenzym besteht aus dem Signalpeptid, einem großen Propeptid und einer kleinen und großen Untereinheit. Nach Abspaltung des Signalpeptids und einer Asparagin-gebundenen Glykosylierung entsteht das hämfreie Apoproenzym. Durch Bindung einer prosthetischen Hämgruppe wird das Proenzym katalytisch aktiv. Das amino-terminale Propeptid, ein kleines Peptid zwischen der leichten und schweren Kette und ein Serin-Rest am C-Terminus werden abgetrennt. Als letzter Schritt in der MPO-Synthese werden Oligosaccharidseitenketten zu komplexen Formen verändert [GULLBERG et al., 1999].
MPO verursacht die Produktion freier Sauerstoffradikale und ist in der Lage, autologe Proteine zu Autoantigenen zu verändern [WIIK, 2000]. Der wichtigste Mechanismus zur Abwehr von Bakterien oder Pilzen entsteht, wenn H2O2 und MPO in Anwesenheit von Halidionen (bevorzugt Chloridionen) auftreten. Der H2O2-MPO-Halid-Komplex verursacht die Peroxidation von Chloridionen zu Hypochlorid (HOCl), welches Zellwände halogeniert und in der Zellmembran vorhandene Aminosäuren in Aldehyde umsetzt [JOHNSON et al., 1987].
Antikörper gegen MPO zeigen ein perinukleäres Färbungsmuster mit oder ohne Fluoreszenz des Zellkernes und werden deshalb auch als pANCA (perinuclear ANCA) bezeichnet [HOFFMANN u. SPECKS, 1998; SAVIGE, 1999].
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In einem Tiermodell wurden Ratten (Brown Norway rats) mit humaner MPO immunisiert und bildeten daraufhin Anti-MPO-Antikörper. Nach der renalen Injektion von einem PMN-Lysosomal-Extrakt (PMN - polymorphkernige neutrophile Granulozyten), das die Produkte aktivierter neutrophiler Granulozyten enthielt (PR3, MPO und H2O2), entwickelten die Tiere eine nekrotisierende Glomerulonephritis (NCGN - necrotizing crescentic glomerulonephritis) mit interstitiellen Infiltraten und einer renalen Vaskulitis. Vierundzwanzig Stunden nach Beginn der Infusion mit dem PMN-Lysosomal-Extrakt waren Immunkomplexe im Bereich der glomerulären Basalmembran vorhanden, vier Tage nach Ende der Infusion waren sie nicht mehr nachweisbar. Wahrscheinlich entstanden die Läsionen bei dieser Erkrankung durch Immunkomplexe [BROUWER et al., 1993]. Die systemische Injektion des PMN-Lysosomal-Extraktes bei den MPO-immunisierten Ratten führte zu nekrotisierenden Vaskulitiden in Lunge und Darm [HEERINGA et al., 1998]. Bei Katzen ist das Lupus-ähnliche Syndrom bekannt, das durch die experimentelle Applikation von Propylthiouracil (PTU), einem Thyreostatikum, entsteht. In einer Studie wurden MPO-ANCA im Serum dieser Katzen nachgewiesen. Die Ursache für die Bildung der ANCA wird in der oxidativen Wirkung von MPO vermutet, das Propylthiouracil metabolisiert und seinerseits der PTU-Metabolit MPO so verändert, dass es als fremd erkannt wird und Auto-Antikörper entstehen. Es konnte nicht geklärt werden, ob die ANCA am Krankheitsgeschehen beteiligt oder ein Epiphänomen sind [WALDHAUSER et al., 1995].
MPO-Antikörper treten beim Menschen vor allem bei mikroskopischer Polyangiitis, der rasch progressiven Glomerulonephritis, dem Kawasaki-Syndrom und in geringerem Umfange bei dem Churg-Strauss-Syndrom auf.