3. MATERIAL UND METHODEN
3.3 Medien, Puffer und Lösungen
PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) pH 7,4
NaCl 8,0 g KCl 0,2 g
Na2HPO4 1,15 g
KH2PO4 0,2 g Aqua dest. ad 1000 ml
PBS, doppelt konzentriert
NaCl 16,0 g KCl 0,4 g
Na2HPO4 2,3 g KH2PO4 0,4 g
Aqua dest. ad 1000 ml
MIF-Puffer (Membranimmunfluoreszenz-Puffer)
bovines Serum-Albumin 5 g Natrium-Azid, 10 %ig 500 µl PBS 500 ml
40 RPMI-Puffer; pH 8,3
bovines Serumalbumin 1 g Tris-HCl-Puffer (1M) 2,5 ml
RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamin, mit 2g/l NaHCO3) 500 ml
Kulturmedium
Penicillin-Streptomycin-Lösung 1 ml CPSR-1 2,5 ml RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamin, mit 2g/l NaHCO3) 500 ml
Paraformaldehyd-Lösung (4 %)
Paraformaldehyd 4 g PBS ad 100 ml
3.4 Untersuchungsmaterial
Für die vorliegende Arbeit wurden 158 Hunde untersucht, von denen insgesamt 219 Serumproben und 158 Proben des Liquors cerebrospinalis entnommen wurden.
Nachfolgend wird "Liquor cerebrospinalis" kurz als "Liquor" oder "CSF"
(cerebrospinal fluid) bezeichnet.
3.4.1 Hunde mit SRMA
46 der untersuchten Hunde waren an SRMA erkrankt. Diese Erkrankung wurde diagnostiziert auf Grund der folgenden klinischen und labordiagnostischen Untersuchungen. Die Patienten zeigten eine steife Kopf-Halshaltung, hochgradige Schmerzhaftigkeit und Fieber. Im Liquor cerebrospinalis bestand eine neutrophile Pleozytose. Die IgA-Werte waren sowohl im Serum als auch im Liquor cerebrospinalis erhöht. Krankheitserreger konnten nicht nachgewiesen werden. Eine
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Therapie mit Glukokortikosteroiden zeigte eine deutliche Besserung der Krankheitssymptome.
Bei 14 der Patienten wurden während des Krankheitsverlaufes mehrere Serum- und Liquorproben untersucht. Es wurden dafür je nach Patient 2 bis 10 Proben in einem Zeitraum von 20 Tagen bis 2,5 Jahren entnommen.
3.4.2 Hunde mit weiteren Erkrankungen
Von 73 Patienten, die wegen verschiedener Erkrankungen in der Klinik vorgestellt wurden, wurden insgesamt 73 Serum- und 57 Liquorproben entnommen.
Davon waren 14 Serum- und 11 Liquorproben von Hunden mit bakteriellen Enzephalitiden, 8 Serum- und 7 Liquorproben von Patienten mit viralen Enzephalitiden wie z.B. Staupe und 8 Serum- und Liquorproben von Patienten mit granulomatöser Meningoenzephalomyelitis (GME).
Von 30 Hunden mit Tumorerkrankungen des ZNS (z.B. Gliome, Meningiome, maligne Lymphome) wurden 30 Serum- und 23 Liquorproben entnommen. Von einem an meningealer Histiozytose erkrankten Patienten wurden im Laufe der Erkrankung insgesamt 5 Serum- und Liquorproben entnommen.
5 Serum- und 4 Liquorproben stammten von Hunden mit idiopathischer Epilepsie und 8 Serum- und 4 Liquorproben von Hunden mit verschiedenen immunologischen Erkrankungen (z.B. autoimmunhämolytische Anämie (AIHA) oder Myositiden).
3.4.3 Kontrollgruppe
Untersucht wurden insgesamt 39 Hunde ohne Allgemeinerkrankungen.
10 Serumproben stammten von klinikeigenen, klinisch gesunden Beaglen, die im Rahmen einer routinemäßigen Blutuntersuchung entnommen wurden.
19 Serum- und 10 Liquorproben stammten von Klinikpatienten. Diese waren bei der Allgemeinuntersuchung und labordiagnostischen Untersuchung unauffällig und wurden in der Klinik behandelt wegen akut aufgetretener, nichtinfektiöser und lokaler Erkrankungen (z.B. Lahmheiten, Frakturen, Biss- oder Unfallverletzungen, Lipome, Cauda equina oder Diskusprolapse). 10 Serumproben wurden klinisch und labordiagnostisch gesunden Blutspenderhunden entnommen.
42 Tab. 3.1: Übersicht über das Patientenmaterial
Art der Erkrankung Anzahl der untersuchten Patienten
SRMA 46
bakterielle Enzephalitiden 14
virale Enzephalitiden 8
GME 8
tumoröse Erkrankungen 30
idiopathische Epilepsie 5
immunologische Erkrankungen 8
Kontrollgruppe 39
3.5 Untersuchungsmethoden
3.5.1 Gewinnung des Serums
Blutproben wurden aus der Vena cephalica antebrachii bzw. der Vena saphena lateralis entnommen, bei 1500 x g für 10 min zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Das Serum wurde aliquotiert und bei - 20 °C gelagert.
3.5.2 Gewinnung des Liquor cerebrospinalis
Der Liquor cerebrospinalis wurde unter Vollnarkose aus der Cisterna magna in der atlanto-okzipitalen Region entnommen. Nach der Eiweißbestimmung, Zellzählung und Zelldifferenzierung wurde der Liquor cerebrospinalis abzentrifugiert, aliquotiert und bei - 20 °C tiefgefroren.
3.6 ELISA
Für die vorliegende Studie wurden die ELISA Varelisa MPO-ANCA und Varelisa PR3-ANCA verwendet. Diese Testverfahren sind indirekte nicht kompetitive Enzymimmunoassays der Firma Pharmacia und Upjohn zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von antineutrophilen zytoplasmatischen Antikörpern im humanen Serum oder Plasma.
43 3.6.1 Vorversuche
Die nötige Serum- und Liquorverdünnung wurde anhand von Verdünnungsreihen in Anlehnung an die humane Methode ermittelt.
In einer Reihe von Vorversuchen wurden die OD der Serumproben in einer Verdünnung von 1:10 bis 1:4000, die OD der Liquorproben in einer Verdünnung von 1:5 bis 1:200 bestimmt. Die optimale Verdünnung der Proben wurde im Hinblick auf eine gute photometrische Erfassbarkeit beurteilt.
Laut Hersteller werden humane Serum- und Plasmaproben 1:100 mit dem Probenpuffer verdünnt. Diese Verdünnung zeigte sich in den Vorversuchen auch für Hundeseren als sinnvoll, um gut messbare Ergebnisse zu erhalten. Die Liquorproben wurden nach der Durchführung entsprechender Verdünnungsreihen 1:10 verdünnt.
3.6.2 Durchführung
Die Mikrotiterplatten sind mit humaner gereinigter Myeloperoxidase bzw. Proteinase 3 beschichtet, an die im ersten Schritt die im Patientenserum vorhandenen spezifischen Antikörper binden.
Die Versuchsdurchführung fand bei Raumtemperatur (18 - 25 °C) statt, die verwendeten Lösungen, Serum- und Liquorproben wurden im Wasserbad auf 20 °C erwärmt. Die im Test enthaltenen Pufferlösungen wurden nach Anleitung verdünnt.
50 ml Waschpuffer (20x PBS-Konzentrat (mit 0,1 % (w/v) Natriumazid)) wurde mit 950 ml destilliertem Wasser versetzt. 20 ml Probenpuffer (5x PBS Konzentrat (mit BSA und 0,1 % (w/v) Natriumazid)) wurde mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt.
Die Mikrotiterplatte wurde einmal mit dem PBS-Waschpuffer gewaschen und auf Zellstoff ausgeklopft. Die Serumproben wurden mit dem Probenpuffer 1:100, die Liquorproben 1:10 verdünnt. Jeweils 100 µl wurde in die Kavitäten pipettiert, für ca.
30 sec auf dem Plattenrüttler vermischt und danach 30 min in einer feuchten Kammer bei 20 °C inkubiert. Die Reagenzien wurden ausgeklopft, die Platten 3 mal mit Waschpuffer ausgewaschen und nach jedem Waschgang gründlich auf Zellstoff ausgeklopft. Als enzymmarkierter Antikörper wurde Peroxidase gebundenes polyklonales anti-Hund-IgG genutzt. Das gefriergetrocknete Konjugat wurde in 1 ml
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destilliertem Wasser in Lösung gebracht und für den Versuch mit dem Probenpuffer 1:100 verdünnt. 100 µl Konjugat wurde jeweils in die Mikrotiterplattenvertiefungen pipettiert, 30 sec auf dem Rüttler vermischt und 30 min in einer feuchten Kammer bei 20 °C inkubiert. Nach dem Waschen der Platten wurde 100 µl des Enzymsubstrates (TMB (3,3',5,5' Tetramethylbenzidin)) in die Kavitäten pipettiert und 10 min in einer feuchten Kammer bei 20 °C im Dunkeln inkubiert. Danach wurden 50 µl Stoplösung (0,5 M H2SO4) in die Vertiefung gefüllt und nach 10 - 30 min weiterer Inkubation in einer feuchten Kammer im Dunkeln bei 20 °C die optischen Dichten bei 450 nm mit einem Mikrotiterplattenphotometer (MR 5000) mit Hilfe des Programms MicroWin bestimmt.
3.6.3 Auswertung
Als Referenzserum galt das positive Kontrollserum. Dieses wurde von einem Hund (s. Tab. 9.2.4, Patient 47) gewonnen, bei dem aufgrund der klinischen Symptome (Fieber, steife Kopf-Halshaltung und Hyperästhesien) und der Laborwerte (hochgradige neutrophile Pleozytose im Liquor cerebrospinalis, erhöhte systemische und intrathekale IgA-Werte und kein Nachweis von Krankheitserregern) SRMA diagnostiziert wurde. Dieser Patient war zum Zeitpunkt der Blut- und Liquorentnahme nicht medikamentös vorbehandelt. In Vorversuchen in der indirekten Immunfluoreszenz und im ELISA zeigte der Hund deutlich ANCA-positive Ergebnisse. Die optische Dichte (OD) der ELISA-Ergebnisse dieses Patienten entsprach der OD der humanen Positivkontrolle des ELISA. Das Serum des Hundes wurde aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
Der OD-Wert dieses Serums wurde gleichgesetzt mit einem fiktiven OD-Wert von 100. Anhand dieses Wertes wurden die OD-Werte der übrigen Probenextinktionen als prozentuale Relationswerte berechnet. Damit konnte die intertestale Streuung der OD-Werte, die aufgrund des äußerst sensibel auf schon geringe Abweichungen in Umgebungstemperatur, Lichteinfall oder Luftfeuchtigkeit reagierende Enzym Peroxidase entstehen, vermieden werden.
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Jede Serum- und Liquorprobe wurde im doppelten Ansatz getestet. Aus den zwei Ergebnissen erfolgte die Berechnung des arithmetischen Mittelwertes der OD der Probe.
Laut Hersteller sollen nur Ergebnisse von Serumduplikaten mit einem Variationskoeffizienten unter 10 zur Bewertung herangezogen werden. Deshalb wurden Serumwerte des gleichen Patienten, deren intratestaler Variationskoeffizient über 10 war, nicht in die Studie einbezogen.
Zur Beurteilung der ELISA-Ergebnisse wurden sowohl die Bewertungsvorschläge des Testkits für humane Proben herangezogen, als auch die Ergebnisse der eigenen Vorversuche, indirekten Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie.
Laut Anleitung wird zur qualitativen Bewertung der humanen Proben der Cut-off bestimmt: OD Cut-off = OD Positiv-Kontrolle x Faktor
Dieser Faktor ist vorgegeben und beträgt 0,15 bei dem MPO-ELISA und 0,25 bei dem PR3-ELISA. Mit Hilfe des Cut-offs wird das Verhältnis (Ratio) berechnet, um das Ergebnis graduell bewerten zu können: Ratio = OD Probe / OD Cut-off
Eine Ratio von < 1,0 gilt als negativ, von 1,0 bis 1,4 als fraglich und eine Ratio > 1,4 gilt als positiv.
Bei einer in eigenen Messungen durchschnittlichen OD der Positivkontrolle von 2,5 ergibt diese Berechnung in der Umkehr folgende Bewertungen:
Tab. 3.2: Bewertung der OD humaner Serumproben
PR3-ELISA MPO-ELISA
OD < 0,725 negativ OD < 0,435 negativ OD 0,725 - 1,015 fraglich OD 0,435 - 0,609 fraglich
OD > 1,015 positiv OD > 0,609 positiv
In Anlehnung an diese Berechnung wurde eine Bewertung der OD versucht. Die Beurteilungswerte sind jedoch im Vergleich zu den OD der caninen Serum- und Liquorproben zu niedrig, da hier auch in der indirekten Immunfluoreszenz (IIF) negative Seren eine OD von bis zu 1,9 zeigen.
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Daher wurden für diese Arbeit im Hinblick auf die Ergebnisse der IIF und der Durchflusszytometrie die ELISA-Ergebnisse der Hunde mit SRMA mit den gesunden Hunden verglichen und eine Beurteilung vorgenommen.
Die Bewertung erfolgte anhand der prozentualen Relationswerte (s.o.), die sich wie folgt berechneten: OD Probe / OD Positivkontrolle x 100 = prozentualer Relationswert.
Tab. 3.3: Bewertung der caninen Serumproben
Tab. 3.4: Bewertung der caninen Liquorproben
3.7 Durchflusszytometrie
Das Durchflusszytometer FACSCalibur (Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) besteht aus einem Sensormodul zur Erfassung optischer Parameter großer Zellzahlen. Mit Hilfe eines Computers zur Datenerfassung und Datenanalyse werden im Anschluss an die Messung die gewonnenen Ergebnisse ausgewertet.
Die zu untersuchenden Zellen liegen in Einzelzellsuspension vor. Durch einen Überdruckaufbau im Probenröhrchen gelangen die Zellen in einem Flüssigkeitsstrom in die Messküvette. Dort werden die Zellen einzeln von einem fokussierten Argon-Ionen-Laserstrahl erfasst und das entstehende Streulicht wird von zwei Lichtdetektoren registriert. Die Größe der Zelle beeinflusst die Lichtstreuung in Richtung des einfallenden Lichtstrahls (Vorwärtsstreulicht, forward light scatter,
positiv fraglich negativ prozentualer
Relationswert > 80 > 70 < 70
positiv fraglich negativ prozentualer
Relationswert > 30 > 28 < 28
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FSC). Das Seitwärtsstreulicht (side scatter, SSC), das im rechten Winkel zum Lichtstrahl entsteht, gibt Aufschluss über die Granularität der Zelle. Diese Granularität wird durch die Struktur der Zellmembran und intrazelluläre Bestandteile gebildet. Fluorochrom-gebundene Zellen oder Partikel emittieren im Laserstrahl Lichtquanten einer charakteristischen Wellenlänge (Fluoreszenz). Das FACS unterscheidet bei Messung mit dem Argon-Ionen-Laser drei verschiedene Fluoreszenzen (FL): Grünfluoreszenz entsteht bei einer Wellenlänge von 515-545 nm (FL1), Orangefluoreszenz bei 564-606 nm (FL2), Rotfluoreszenz wird durch Lichtquanten mit einer Wellenlänge über 650 nm (FL3) gebildet. Die verschiedenen Parameter können innerhalb eines Diagramms dargestellt werden. Bei der Zweiparameterdarstellung oder Punktgrafik (Dot-Plot) werden jeweils zwei verschiedene Parameter graphisch in einer Korrelation dargestellt. Auch verschiedene Zellpopulationen in einem Probenansatz können separat erfasst werden.
3.7.1 Testdurchführung
3.7.1.1 Isolierung der neutrophilen Granulozyten
Die benötigten Reagenzien wurden auf 20 °C erwärmt. 10 ml Blut (EDTA-verdünnt) wurde von einem gesunden Hund im Rahmen einer routinemäßigen Blutuntersuchung entnommen. Das Blut wurde 1:1 mit PBS verdünnt. In ein 15 ml Röhrchen mit konischem Boden und Schraubverschluss wurden 2 ml Histopaque (Histopaque H-1119, Fa. Sigma Diagnostics) pipettiert und dieses mit 2 ml Pancoll (Pancoll, Dichte 1,077 g/ml, Fa. Cytogen) überschichtet. Auf diese Lösung wurde 10 ml PBS-verdünntes Blut pipettiert, so dass sich 3 Phasen bildeten. Das Röhrchen wurde 30 min bei 400 x g bei 20 °C zentrifugiert. Die Bremse der Zentrifuge war dabei ausgestellt. Im Röhrchen befanden sich nach Ende der Zentrifugation sechs Schichten: oben eine durchsichtige Schicht aus Plasma, darunter ein weißer Ring, den die monomorphkernigen Zellen und Thrombozyten bildeten, ein Ring aus Ficoll, eine Schicht mit Granulozyten, eine Schicht aus Histopaque und am Boden das Erythrozyten-Pellet. Die Granulozytenschicht wurde abpipettiert und 3 mal mit 10 ml
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PBS gewaschen, indem die Lösung nacheinander jeweils 8 Minuten bei 200 x g und 100 x g zentrifugiert wurde. Der Flüssigkeitsüberstand wurde jeweils abgegossen und das am Boden haftende Zellpellet in der Restflüssigkeit resuspendiert.
Im Pellet enthaltene Erythrozyten wurden lysiert, indem das Zellpellet nach der Resuspendierung mit 5 ml destilliertem Wasser (Aqua dest.) 20 sec geschwenkt, danach 5 ml doppelt konzentrierte PBS zugegeben, vorsichtig vermischt und abzentrifugiert wurde. Der Überstand wurde abgegossen, das Zellpellet resuspendiert und auf 10 % der ursprünglichen Blutmenge mit PBS aufgefüllt. Von dieser Suspension wurden 10 µl mit 90 µl Trypanblau (10 %ig) vermischt und in der Zählkammer nach Türck gezählt. Die Zellen wurden auf 2 x 106 Zellen pro 1 ml PBS eingestellt.
3.7.1.2 Ansatz 1: Permeabilisierung der neutrophilen Granulozyten
Da eine Antikörperbindung an zytoplasmatische Rezeptoren bei frisch isolierten neutrophilen Granulozyten nur möglich ist, wenn die Zelle permeabilisiert ist, wird in den folgenden Versuchsansätzen durch die Zugabe von Saponin, Tween 20 oder FACS Permeabilizing Solution eine Permeabilisierung der Zellmembran erreicht.
3.7.1.2.1 Permeabilisierung mit Saponin Puffer
Als Puffer wurde je nach Ansatz PBS, 0,03 %iges PBS-Saponin, 0,5 %iges PBS-Saponin, MIF-Puffer, 0,03 %iges MIF-Saponin, 0,1 %iges MIF-Saponin oder 0,5 %iges MIF-Saponin (siehe Tab. 3.5 bis 3.7) eingesetzt.
Fixierung der Zellen
Zur Fixierung der Zellen erfolgte die 20 minütige Inkubation bei 4 °C mit 4 %igem Paraformaldehyd (1:1), so dass eine Endkonzentration von 2 % entstand. Die Lösung wurde bei 800 x g für 2 min abzentrifugiert und das Zellpellet resuspendiert.
Es folgten zwei Waschgänge mit der Zugabe von jeweils 500 µl des entsprechenden Puffers, bei dem die Zellen 2 min bei 800 x g bei 4 °C abzentrifugiert und der
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Überstand abgegossen wurde. Das Zellpellet wurde in dem jeweiligen Puffer resuspendiert und auf eine Zellzahl von 2 x 106 Zellen pro ml eingestellt.
Blockierung unspezifischer Antikörperbindungen
Nach der Aufteilung der Zellen auf die entsprechende Anzahl FACS-Röhrchen wurde eine mögliche unspezifische Bindung an die Fc-Rezeptoren der neutrophilen Granulozyten durch die Zugabe von Rinder-, Ziegen- oder Hundeserum oder humanem Normalglobulinin den angegebenen Konzentrationen (s. Tab. 3.5 bis 3.7) blockiert und damit die Enstehung von falsch-positiven Ergebnissen verhindert.
Färbung der Zellen
1. Zugabe des Patientenserums
Das Patientenserum wurde in den Konzentrationen von 1:2 bis 1:100 zugegeben.
Der Ansatz wurde 30 min bei 4 °C inkubiert, bei 800 x g für 2 min abzentrifugiert und der Überstand abgegossen. Das Zellpellet wurde in der Restflüssigkeit resuspendiert. Dem folgten zwei Waschgänge mit der Zugabe von je 500 µl des entsprechenden Puffers (s. Tab. 3.5 bis 3.7), bei dem die Zellen 2 min bei 800 x g bei 4 °C abzentrifugiert wurden und das Zellpellet resuspendiert wurde.
2. Sekundärer Antikörper
Eine Versuchsreihe wurde mit Fluoreszeinisothiocyanat-markiertem (FITC-markiertem) Schaf-anti-Hund IgGdurchgeführt.
Ein zweiter Ansatz bestand aus der Zugabe von 2 sekundären Antikörpern: Als erster Antikörper wurde ein monoklonaler Maus-anti-Hund Antikörpergenutzt.
Das im zweiten Schritt an den ersten Antikörper bindende Konjugat war ein goat-anti-mouse IgG, das mit R-Phycoerythrin (R-PE) konjugiert war.
a) Beim ersten Ansatz wurde FITC-markiertes IgG in Konzentrationen von 1:50 oder 1:100 zupipettiert, 30 min bei 4 °C inkubiert, 2 min bei 800 x g abzentrifugiert und der Überstand abgegossen. Die Zellen wurden zwei weitere Male gewaschen, indem je 500 µl des entsprechenden Puffers zugegeben und 2 min bei 800 x g bei 4 °C
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abzentrifugiert wurde. Der Flüssigkeitsüberstand wurde jeweils abgegossen und das Zellpellet resuspendiert. Die nicht gebundenen Antikörper wurden durch die oben beschriebenen Waschvorgänge entfernt.
b) Bei der Verwendung von zwei sekundären Antikörpern folgte nach der Zugabe des mouse-anti-canine Ig in einer Verdünnung von 1:50 oder 1:100 die 30 minütige Inkubation bei 4 °C. Die Zellen wurden dreimal gewaschen (500 µl Puffer, 800 x g, 2 min, 4 °C), um freie Antikörper aus der Zellsuspension zu lösen. R-PE-konjugiertes goat-anti-mouse IgG wurde in der Konzentration 1:50 oder 1:100 zupipettiert. Dieser Ansatz wurde ebenfalls 30 min bei 4 °C inkubiert und dreimal gewaschen.
Zusätzliches Waschen der Zellen
Bei zwei Versuchsansätzen (s. Tabelle 3.5 und 3.6) wurden statt den oben beschriebenen drei Waschgängen nach der Fixierung der Zellen, der Inkubation mit dem Patientenserum und nach der Bindung des sekundären Antikörpers vier Waschgänge mit der Zugabe von je 1000 µl Puffer pro FACS-Röhrchen und der Zentrifugation bei 800 x g für 2 min bei 4 °C durchgeführt. So konnte ausgeschlossen werden, dass durch ungenügendes Waschen der Zellsuspension falsche Ergebnisse bei der Messung im Durchflusszytometer auftraten.
Negativkontrollen
1. Zellen mit Patientenserum und ohne FITC-markierten Ak 2. Zellen ohne Patientenserum und ohne FITC-markierten Ak 3. Zellen ohne Patientenserum und mit FITC-markiertem Ak
Messung im Durchflusszytometer
Zu dem im letzten Schritt resuspendierten Zellpellet wurden 300 µl FACS-Flow zupipettiert und die Zellen während der Messung auf Eis gelagert. Die Messung erfolgte im FACSCalibur.
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Tab. 3.5: Verwendung des Antikörpers "Sheep anti canine IgG:FITC"
Versuch
Dargestellt sind 6 verschiedene Versuchsansätze, bei denen die Zellen jeweils mit dem FITC-markierten Antikörper Schaf-anti-Hund IgG gefärbt wurden.
1 Zur Verdünnung der Serumproben und des sekundären Antikörpers und zum Waschen der Zellen wurden drei verschiedene Pufferlösungen (PBS, 0,03 %ige PBS-Saponin-Lösung und 0,5 %ige PBS-Saponin-Lösung) verwendet.
2 Bei Versuch 2 bis 6 wurden vor der Zugabe von Saponin die Zellen mit 4%igem Paraformaldehyd fixiert.
3 Zu der Blockierung unspezifischer Bindungen wurde den Zellen entweder Rinder-, Ziegen- oder Hundeserum oder humanes Ig in den jeweils beschriebenen Konzentrationen zugegeben.
4,5 Das Patientenserum und das Konjugat wurde in den angegebenen Verdünnungen verwendet.
6 Bei dem Versuch 3 wurden die Zellen vier statt drei mal nach jedem Schritt gewaschen.
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Tab. 3.6: Verwendung des Antikörpers "Sheep anti canine IgG:FITC "
Die Versuche 1 bis 8 wurden auf der Basis von MIF-Lösung bzw. MIF-Saponin-Lösungen durchgeführt.
1 Verwendet wurden vier verschiedene Pufferlösungen (MIF, 0,03 %ige MIF-Saponin-Lösung, 0,1 %ige MIF-Saponin-Lösung und 0,5 %ige PBS-Saponin-Lösung) zum Verdünnen der Serumproben und des sekundären Antikörpers und zum Waschen der Zellen.
2 Unspezifische Bindungen wurden durch die Zugabe von Rinder-, Ziegen-, Hundeserum oder humanem Ig in den jeweils beschriebenen Konzentrationen blockiert.
3,4 Das Patientenserum und das Konjugat wurde in den angegebenen Verdünnungen
verwendet.
5 Bei dem Versuch 1 wurden vier statt drei Waschvorgänge nach jedem Schritt durchgeführt.
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Tab. 3.7: Verwendung der Antikörper "mouse anti canine Ig" (Antikörper 1) und "R-PE-goat-anti-mouse IgG" (Antikörper 2)
Verdünnungspuffer 1 MIF MIF
0,5 % Bei diesen 7 verschiedenen Versuchsansätzen wurden die Zellen jeweils mit dem Antikörper Maus-anti-Hund Ig (Antikörper 1) und Ziege-anti-Maus IgG (Antikörper 2) gefärbt.
1 Verwendet wurden zwei verschiedene Pufferlösungen (MIF-Lösung und 0,03 %ige PBS-Saponin-Lösung) zum Verdünnen der Serumproben und der Antikörper 1 und 2 und zum Waschen der Zellen.
2 Versuche 3 bis 6: Vor der Zugabe von Saponin wurden die Zellen in 4%igem Paraformaldehyd fixiert.
3 Die Blockierung unspezifischer Bindungen wurde durch die Zugabe von Ziegen- oder Hundeserum oder humanem Ig in den beschriebenen Konzentrationen erreicht.
4,5 Patientenserum und Antikörper 1 und 2 wurden in den angegebenen Verdünnungen verwendet.
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3.7.1.2.2 Permeabilisierung mit FACS Permeabilizing Solution
Ein weiterer Versuchsansatz bestand in der Permeabilisierung der Zellmembran durch FACS Permeabilizing Solution. Diese gepufferte Lösung ist 10fach konzentriert und enthält weniger als 50 % Diethylenglykol und weniger als 15 % Formaldehyd.
Die neutrophilen Granulozyten wurden isoliert (s. Kap. 3.7.1.1), mit 4 %igem Paraformaldehyd bei einer Endkonzentration von 2 % bei 4 °C für 20 min inkubiert und dreimal mit je 500 µl PBS durch Zentrifugation gewaschen (800 x g für 2 min bei 4 °C). Die FACS Permeabilizing Solution wurde nach Anleitung 1:10 mit Aqua dest.
verdünnt und davon 500 µl zu den Zellen pipettiert. Nach der Inkubation bei 4 °C für 10 min wurden die Zellen dreimal unter der Zugabe von 500 µl PBS zentrifugiert (800 x g für 2 min bei 4 °C). Ziegenserum in der Konzentration 1:30 wurde zugegeben. Es folgte eine Inkubation für 30 min bei 4 °C mit Patientenserum, das 1:10, 1:50 und 1:100 zupipettiert wurde. Die Zellen wurden erneut dreimal gewaschen (800 x g für 2 min bei 4 °C). Danach wurde der FITC-markierte Antikörper (Schaf-anti-Hund IgG, Fa. Serotec) zugegeben und der Ansatz für 30 min bei 4 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Zellen (800 x g für 2 min bei 4 °C) wurden diese mit 300 µl FACS-Flow gemessen.
3.7.1.2.3 Permeabilisierung durch Tween 20
Die neutrophilen Granulozyten (s. Kap. 3.7.1.1) wurden in 4 %igem Paraformaldehyd bei einer Endkonzentration von 2 % für 20 min bei 4 °C fixiert. Danach wurden die Zellen bei 350 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugiert und der Flüssigkeitsüberstand abgeschüttet. Das Zellpellet wurde in 0,2 % Tween 20-PBS-Lösung resuspendiert und für 15 min bei 37 °C inkubiert. Danach wurde die Suspension bei 350 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugiert, das Zellpellet resuspendiert und auf eine Konzentration von 2 x 106 Zellen in 100 µl MIF-Puffer pro Ansatz verdünnt. Das Patientenserum wurde 1:5 in 0,01 %iger Saponin-PBS-Lösung verdünnt und pro Ansatz 20 µl dieser Lösung zupipettiert. Nach der Inkubation (20 min bei 4 °C) wurden die Zellen zweimal gewaschen, indem sie mit je 300 µl MIF-Puffer bei 350 x g zentrifugiert
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wurden. Das Zellpellet wurde nach dem zweiten Waschgang in 100 µl MIF-Puffer resuspendiert. Pro Zellansatz wurde 20 µl von 1:50 in 0,01 %iger Saponin-PBS-Lösung verdünntem FITC-markiertem Konjugat (Schaf-anti-Hund IgG, Fa. Serotec) zugegeben. Die Inkubationszeit betrug 20 min bei 4 °C. Die Zellen wurden zweimal mit jeweils 300 µl MIF-Puffer zentrifugiert (350 x g, 20 °C). Die Resuspendierung nach dem zweiten Waschen fand in 300 µl FACS-Flow statt. Die Zellen wurden daraufhin im Durchflusszytometer gemessen.
3.7.1.3 Ansatz 2: Apoptose der neutrophilen Granulozyten
Bei diesem Versuchsaufbau wurde die Tatsache genutzt, dass apoptotische neutrophile Granulozyten PR3 und MPO auf der Zellmembran exprimieren
Bei diesem Versuchsaufbau wurde die Tatsache genutzt, dass apoptotische neutrophile Granulozyten PR3 und MPO auf der Zellmembran exprimieren