CSF IgA (µg/ml)
4.1.10 Sensitivität und Spezifität
Die Sensitivität des PR3-ANCA-ELISA ist für Liquorproben 13,2 %, für Serumproben 42,5 %. Die Spezifität im Liquor ist 74,6 %, im Serum 67,9 %. Der positive prädiktive Wert (positiver Vorhersagewert) ist die Wahrscheinlichkeit, mit der das im Test positive Tier auch tatsächlich krank ist. Dieser Wert beträgt für Liquorproben 25 %, für Serumproben 33,3 %. Der negative prädiktive Wert drückt die Wahrscheinlichkeit aus, mit der das Tier nicht krank ist, wenn das Testergebnis negativ ist. Für Liquorproben liegt diese Wahrscheinlichkeit bei 57,1 %, für Serumproben bei 75,8 %.
Der MPO-ELISA besitzt eine höhere Sensitivität als der PR3-ELISA. Bei dem MPO-ELISA beträgt die Sensitivität für Liquorproben 32,4 %, für Serumproben 50 %.
Die Spezifität ist für Liquorproben 71,2 %, für Serumproben 60,8 %. Die Spezifität ist
95
damit geringer als bei dem PR3-ELISA. Der positive Vorhersagewert erreicht bei dem MPO-ELISA 41,4 % bei Liquorproben und 33,3 % bei der Untersuchung des Serums. Der negative Vorhersagewert beträgt 62,7 % für Liquorproben und 75,6 % für Serumproben.
Damit erzielten die ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen Proteinase 3 und Myeloperoxidase sowohl bei der Untersuchung des Liquor cerebrospinalis als auch des Serums keine zuverlässigen Ergebnisse zur Unterstützung der Diagnostik der SRMA bzw. zur Vorhersage eines möglichen Rezidivs.
4.2 Indirekte Immunfluoreszenz
Untersucht wurden sechs Serum- und Liquorproben unter Verwendung eines entsprechenden Anregungsfilters unter dem Fluoreszenzmikroskop .
Dabei wurden zur Bewertung jeweils 10 Gesichtsfelder mit 400facher Vergrößerung betrachtet. Beurteilt wurde stark zytoplasmatische, schollige Fluoreszenz.
Tab. 4.47: Anzahl fluoreszierender Zellen pro 10 ausgezählter Gesichtsfelder bei Färbung der Zellen durch IIF
SRMA-erkrankte Hunde Kontrollgruppe
Nr. Serum CSF Nr. Serum CSF Negativkontrolle1
1 24 18 48 5 3 2
3 25 12 53 5 - 2
13 27 19 54 4 4 3
14 24 12 56 4 -
18 24 13 57 5 3
19 22 10 58 - 2
20 27 20 60 4 -
23 23 20 62 6 3
32 25 12 64 4 2
34 19 17 66 4 -
36 25 16 67 3 3
42 26 17 68 - 3
76 - 3
1Negativkontrolle: Zellen ohne Patientenserum oder Liquor, fluoreszenzgefärbt, Nr.:
Patientennummer (s. Anhang, Tab. 9.2).
96 24,00
15,50
4,40 2,89 2,33
Serum CSF Serum CSF
SRMA-erkrankte Hunde Kontrollgruppe Negativkontrolle Anzahl positiver Zellen (n) (1)
(1): Zellen ohne Patientenserum oder Liquor, fluoreszenzgefärbt
Abb. 4.15: Arithmetischer Mittelwert der Anzahl fluoreszenzgefärbter Zellen bei Untersuchung von Serum- und Liquorproben durch IIF. Untersucht wurden pro Probe je 10 Gesichtsfelder (s. Tab. 4.47).
Sowohl die untersuchten Serum- als auch die Liquorproben weisen im Vergleich von Hunden mit SRMA zu den gesunden Kontrolltieren in der Anzahl positiver Zellen einen signifikanten Unterschied im Chi-Quadrat-Test auf (p < 0,05). Die Serum- und Liquorproben der SRMA-erkrankten Hunde zeigten auch im ELISA Antikörper gegen PR3 und MPO, die Proben der gesunden Hunde waren im ELISA ANCA-negativ.
Abb. 4.16: Nachweis von antineutrophilen zytoplasmatischen Antikörpern im Serum eines an SRMA erkrankten Hundes durch indirekte Immunfluoreszenz (400fache Vergrößerung).
Die dargestellten Zellen sind neutrophile Granulozyten eines gesunden Hundes. Die Färbung der Zellen erfolgte mit Serum eines an SRMA erkrankten Hundes (Patient Nr. 18) und FITC-konjugiertem Schaf-anti-Hund-IgG (Fa. Serotec). Zu erkennen ist eine zytoplasmatische Fluoreszenz mit Aussparung des Zellkernes.
97
4.3 Durchflusszytometrie
Im Rahmen der Durchflusszytometrie kann keine Unterscheidung von Antikörpern gegen Proteinase 3 und Myeloperoxidase vorgenommen werden, sondern die Fluoreszenz-Färbung betrifft beide Formen der ANCA.
Im ELISA konnte jedoch gezeigt werden, dass eine deutlich positive Korrelation zwischen dem Auftreten und der Titerhöhe von PR3 und MPO besteht.
Deshalb findet bei den gewonnenen Ergebnissen in der durchflusszytometrischen Messung ein Nachweis von antineutrophilen zytoplasmatischen Antikörpern (ANCA) ohne Differenzierung zwischen PR3 und MPO statt.
4.3.1 Vorversuche
Die in Kapitel 3.7.1.2.1-3.7.1.2.2 beschriebenen Ansätze (Permeabilisierung mit Saponin bzw. FACS Permeabilizing Solution) ergaben unspezifische Ergebnisse, die keine deutliche Unterscheidung von ANCA-positiven und ANCA-negativen Serum- oder Liquorproben ermöglichte. Die gemessene Anzahl der fluoreszierenden Zellen und die Fluoreszenz-Intensität unterschied sich bei den ungefärbten Zellen (Negativkontrollen), ANCA-negativen und ANCA-positiven Proben nur gering. Zum Teil war bei den Zellen mit ANCA-positivem Serum eine geringere Fluoreszenzintensität als bei unbehandelten Zellen (Negativkontrollen) zu erkennen (Abb. 4.17 und 4. 18). Die Ursachen dafür konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht hinreichend geklärt werden. Da die genannten Methoden der Durchflusszytometrie auf der Grundlage von humanen neutrophilen Granulozyten und humanen Serumproben entwickelt wurden, ist die Ursache für die unzureichende Zellfärbung evtl. in den caninen Zellen bzw. in den Serumproben zu finden.
98
Abb. 4.17:
FACS-Darstellung der Fluoreszenzintensität neutrophiler Granulozyten bei Permeabilisierung durch 0,5 %iges PBS-Saponin.
Die Zellen wurden mit ANCA-positivem Serum (Patient Nr. 18) und FITC-markiertem Schaf-anti-Hund IgG inkubiert. (Schwarze Kurve:
Negativkontrolle (Zellen ohne Patientenserum, mit sekundärem Antikörper); rote Kurve: Zellen mit Serumkonzentration 1:2; grüne Kurve: Zellen mit Serumkonzentration 1:8; blaue Kurve: Zellen mit Serumkonzentration 1:100; lila Kurve: Zellen mit Serumkonzentration 1:200; FL1-H: Fluoreszenz 1.)
Abb. 4.18:
FACS-Darstellung der Fluoreszenzintensität neutrophiler Granulozyten bei Permeabilisierung durch 0,03 %iges PBS-Saponin.
Die Zellen wurden mit ANCA-positivem Serum (Patient Nr. 14) und Maus-anti-Hund Ig (A) und R-PE markiertem Ziege-anti-Maus IgG (B) inkubiert. (Schwarze Kurve:
Negativkontrolle, Zellen ohne Zugabe von Serum, Antikörper A oder B; grüne Kurve:
Zellen ohne Zugabe von Serum oder Antikörper B, aber mit Antikörper A; rote Kurve:
Zellen ohne Zugabe von Serum oder Antikörper A, aber mit Antikörper B; lila Kurve:
Zellen mit Serumverdünnung 1:10 und Antikörper A und B; blaue Kurve: Zellen mit Serumverdünnung 1:50 und Antikörper A und B; FL2-H: Fluoreszenz 2.)
99
Die Abbildungen (Abb. 4.17 und 4.18) zeigen, dass mit Saponin permeabilisierte neutrophile Granulozyten vom Hund eine starke Eigenfluoreszenz aufweisen, die durch Zugabe verschiedener Antikörper bzw. von Patientenserum abnimmt. Eine Auswertung auf das Vorhandensein von ANCA im Patientenserum ist daher mit diesen Methoden nicht möglich.
4.3.2 Permeabilisierte neutrophile Granulozyten
Die Granulozyten wurden nach der in Kap. 3.7.1.2.3 beschriebenen Methode mit Tween 20 und Saponin permeabilisiert und mit Patientenseren und FITC-konjugiertem Ig inkubiert.
Während der durchflusszytometrischen Messung fand eine Differenzierung der Zellen nach Größe (FSC) und Granularität (SSC) statt.
Abb. 4.19: FACS-Darstellung permeabilisierter Granulozyten (Auswertefenster R1).
Das Auswertefenster R1 wurde aufgrund der Größe und Granularität der Zellen gesetzt. (FL1-H: Fluoreszenz 1; FSC-H: Vorwärtsstreulicht; SSC-H:
Seitwärtsstreulicht.)
100
(A) (B)
Abb. 4.20: FACS-Darstellung: Mit ANCA-negativem Serum inkubierte Zellen (A) (Abb. links) im Vergleich zu Zellen, die mit ANCA-positivem Serum (B) inkubiert wurden (Abb. rechts).
Beide Ansätze wurden mit FITC-Ig gefärbt. Serum A (Patient Nr. 67) zeigte auch im ELISA ein negatives Ergebnis, Serum B (Patient Nr. 14) war sowohl PR3-Ak als auch MPO-Ak positiv. (FL1-H: Fluoreszenz 1.)
Abb. 4.21: Anteil der FITC-gefärbten und ANCA-positiven Zellen bei sechs verschiedenen Patientenseren.
(1 - 3: Inkubation der Zellen mit dem Serum drei verschiedener, gesunder Hunde und FITC-Ig; 4 - 6: Inkubation der Zellen mit dem Serum von drei SRMA-erkrankten Hunden und FITC-Ig.)
Der Anstieg positiver Zellen durch die Inkubation mit dem Serum SRMA-erkrankter Hunde ist nicht statistisch signifikant (p > 0,05), aber im Vergleich lassen sich ANCA-positive Seren von ANCA-negativen Seren anhand der Fluoreszenz-Intensität (s.
Abb. 4.20) differenzieren. Die Seren 1 bis 3 (Patienten Nr. 62 - 64) waren im ELISA PR3-Ak-negativ und MPO-Ak-negativ. Die Seren 4 bis 6 (Patienten Nr. 14, 18 und 42) zeigten deutlich PR3-Ak- und MPO-Ak-positive Ergebnisse im ELISA.
0 5 10 15 20 25 30 35 40
1 2 3 4 5 6
% positiver Zellen
101 4.3.3 Apoptotische neutrophile Granulozyten
Es kann vermutet werden, dass nach 18 Stunden Inkubation eine große Anzahl apoptotischer Zellen vorhanden sind [GILLIGAN et al., 1996]. Es wurde versucht, diese anhand der Größe (FSC) und Granularität (SSC) und durch eine Färbung mit Propidiumjodid (PJ) von den übrigen Zellen zu differenzieren. Dabei wurde ein Auswertefenster gesetzt, das nur Granulozyten berücksichtigt, die sowohl FITC-markiert waren als auch den PJ-Farbstoff aufnahmen.
(A) (B)
PJ- gefärbte Zellen
Fluoreszenz-gefärbte Zellen PJ-ungefärbte Zellen (C) (D)
PJ-gefärbte Zellen PJ- und Fluoreszenz-
(Auswertefenster) gefärbte Zielzellen (Auswertefenster)
Abb. 4.22: Darstellung der apoptotischen Zielzellen durch FACS-Messung.
(A: neutrophile Granulozyten, mit FITC-markiertem Schaf-anti-Hund IgG gefärbt;
B: neutrophile Granulozyten, mit FITC-markiertem Schaf-anti-Hund IgG und PJ-Färbung, dargestellt in der FSC zur Differenzierung von PJ-ungefärbten und PJ-gefärbten Zellen;
C: neutrophile Granulozyten, mit FITC-markiertem Schaf-anti-Hund IgG und PJ-Färbung, in der FL3 sind nur PJ-gefärbte Zellen dargestellt; D: neutrophile Granulozyten, mit FITC-markiertem Schaf-anti-Hund IgG und PJ-Färbung, dargestellt in der FL1, um für die Bewertung der Proben nur sowohl PJ- als auch FITC-gefärbte Zellen heranzuziehen.)
102
Abb. A Abb. B
Abb. 4.23: Darstellung von PMN nach Inkubation mit ANCA-positivem Serum im Vergleich zu Zellen ohne Inkubation mit Serum; Zellanzahl: 2x 106 Zellen.
(Abb. A: Negativkontrolle, PMN ohne Patientenserum, mit FITC-markiertem Schaf-anti-Hund IgG gefärbt; Abb. B: mit FITC-markiertem Schaf-anti-Hund IgG gefärbte PMN, mit ANCA-positivem Serum eines SRMA-erkrankten Hundes (Patient Nr. 14) inkubiert; FL1-H: Fluoreszenz 1.)
Bei den mit Serum inkubierten Zellen fand eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität und ein Anstieg der Anzahl FITC-markierter Granulozyten im Vergleich zu ungefärbten Zellen statt. Das verwendete Patientenserum ergab bei der Untersuchung auf PR3-Antikörper und MPO-Antikörper im ELISA positive Ergebnisse.
103 0
2 4 6 8 10 12
N NF 1 2 3 4 5 6
% positiver Zellen
Abb. 4.24: Anteil der FITC-markierten Zellen nach der Inkubation mit sechs verschiedenen Patientenseren.
(N: Negativkontrolle (Zellen ohne Patientenserum und ohne FITC-Ig); NF:
Negativkontrolle (Zellen ohne Patientenserum und mit FITC-Ig); 1 - 3: Inkubation der Zellen mit dem Serum von drei gesunden Hunden (Patienten Nr. 53, 54 und 56) und FITC-Ig; 4 - 6: Inkubation der Zellen mit dem Serum von drei Hunden mit SRMA (Patienten Nr. 14, 18 und 19) und FITC-Ig.)
Die Anzahl Fluoreszenz-gefärbter Zellen erhöht sich bei Inkubation mit positivem Serum. Die Differenz zwischen positiven und ANCA-negativen Ansätzen ist dabei etwas deutlicher als bei der Verwendung permeabilisierter Granulozyten (s. Kap. 4.3.2). Bei den drei verwendeten Seren der gesunden Hunde ließen sich auch im ELISA keine Antikörper gegen PR3 oder MPO nachweisen. Die Seren der drei an SRMA erkrankten Hunde wiesen auch im ELISA Antikörper gegen PR3 und MPO auf.
104
5. DISKUSSION
Ursache und Pathogenese der steril-eitrigen Meningitis-Arteriitis des Hundes sind bisher nicht geklärt. Im pathologisch-histologischen Bild gleicht die SRMA teilweise den ANCA-assoziierten Immunvaskulitiden des Menschen, wie zum Beispiel dem Kawasaki-Syndrom. Auch hier ist die Pathogenese noch weitgehend ungeklärt. Eine Beteiligung von antineutrophilen zytoplasmatischen Antikörpern an der Entstehung oder Aufrechterhaltung des Krankheitsgeschehens scheint aber wahrscheinlich.
In vorliegender Studie wurde daher eine Methode zum Nachweis von ANCA bei Hunden entwickelt und die Relevanz der ANCA bei der Pathogenese der SRMA untersucht.
5.1 Methode und Resultate der Durchflusszytometrie
In der Humanmedizin ist der Nachweis von ANCA mittels Durchflusszytometrie eine anerkannte Methode [WORMSLEY et al., 1988; YANG et al., 1994;
SUZUKI et al., 1995; GILLIGAN et al., 1996]. Drei verschiedene Versuchsansätze für den Nachweis von ANCA wurden etabliert. Die neutrophilen Granulozyten werden entweder permeabilisiert, zur Apoptose gebracht oder unter Zugabe von TNF-alpha aktiviert. In der vorliegenden Studie wurde das Verfahren der Aktivierung der Zellen durch TNF-alpha nicht zur Bestätigung der ELISA-Ergebnisse genutzt, da für diese aufwendige und kostenintensive Methode kein canines TNF-alpha zur Verfügung stand.
Um die Methode der Durchflusszytometrie zu testen, wurden Serumproben zur Untersuchung herangezogen, da im Liquor cerebrospinalis im Vergleich zum Serum geringere ANCA-Werte zu erwarten waren und damit die Untersuchung von Liquorproben nicht zur Etablierung einer Methode geeignet war.
Bei diesem Verfahren wurde - wie bei der indirekten Immunfluoreszenz (IIF) und den beiden ELISA - ein sekundärer Antikörper genutzt, der nur ANCA der Klasse IgG (IgG-ANCA) erfasst. ANCA der Klasse IgM wurden nicht ausgewertet, da diese nur