Molekulare Charakterisierung von Staphylococcus aureus, ESBL-/AmpC-bildenden Escherichia coli und Salmonella enterica aus legal und illegal aus Drittländern eingeführten Lebensmitteln

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Molekulare Charakterisierung von Staphylococcus aureus, ESBL-/AmpC- bildenden Escherichia coli und Salmonella enterica aus

legal und illegal aus Drittländern eingeführten Lebensmitteln

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Anja Müller

Krefeld

Hannover 2018

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1. Gutachterin: Prof. Dr. Corinna Kehrenberg, PhD

2. Gutachterin: Prof. Dr. Nicole Kemper

Tag der mündlichen Prüfung: 02.11.2018

Teile dieser Arbeit wurden durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung finanziell gefördert (FKZ 13N12697).

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Meiner Familie

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in our possession that kings in the 17th Century would have gone to war to possess.

- Kary Mullis

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Publikationsverzeichnis I

Publikationsverzeichnis

Diese Dissertation basiert in wesentlichen Teilen auf den folgenden Publikationen:

MÜLLER A., SEINIGE D., JANSEN W., KLEIN G., EHRICHT R., MONECKE S., KEHRENBERG C. (2016):

Variety of antimicrobial resistances and virulence factors in Staphylococcus aureus isolates from meat products legally and illegally introduced to Germany.

PloS ONE 11(12): e0167864. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0167864

MÜLLER A., JANSEN W., GRABOWSKI N. T., MONECKE S., EHRICHT R., KEHRENBERG C. (2018):

ESBL- and AmpC-producing Escherichia coli from legally and illegally imported meat: Characterization of isolates brought into the EU from third countries.

Int. J. Food Microbiol. 283:52-58.https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2018.06.009

JANSEN W., WOUDSTRA S., MÜLLER A., GRABOWSKI N., SCHOO G., GERULAT B., KLEIN G., KEHRENBERG C. (2018):

The safety and quality of pork and poultry meat imports for the common European market received at border inspection post Hamburg Harbour between 2014 and 2015.

PloS ONE 13(2): e0192550. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0192550

MÜLLER A., JANSEN W., GRABOWSKI N. T., KEHRENBERG C. (2018):

Characterization of Salmonella enterica serovars recovered from meat products legally and illegally imported into the EU reveals the presence of multiresistant and AmpC- producing isolates.

Gut Pathogens, 10, 40. https://doi.org/10.1186/s13099-018-0268-3

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Des Weiteren wurden Teile der Dissertation in folgenden Vorträgen und Posterbeiträgen präsentiert:

Vorträge:

Characterization of Staphylococcus aureus isolates recovered from meat and meat products introduced to Germany.

Vortrag im Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit anlässlich des Besuchs einer Delegation der Osaka-Universität am 23.02.2016.

Staphylococcus aureus-Isolate von aus Drittländern nach Deutschland eingeführten Fleischprodukten beherbergen eine Vielfalt an Virulenzfaktoren und Resistenzgenen.

Vortrag anlässlich der Tagung der DVG Fachgruppe Bakteriologie und Mykologie, 31.08. – 02.09.2016, Jena.

Vielfältige Resistenz- und Virulenzfaktoren bei Staphylococcus aureus-Isolaten aus legal und illegal eingeführtem Fleisch außereuropäischer Herkunft.

Vortrag anlässlich der 57. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, 27. – 30.09.2016, Garmisch-Partenkirchen.

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Publikationsverzeichnis III

FOHLER S., JANSEN, W., GRABOWSKI, N., KLEIN, G (2016):

Vortrag erstellt und präsentiert von MÜLLER, A.

Zoonosen entlang globaler Warenketten: Mikrobiologische Beschaffenheit illegal und legal eingeführter Lebensmittel tierischen Ursprungs.

MÜLLER A., JANSEN W., GRABOWSKI N.T., KLEIN G., KEHRENBERG C.

(2016):

Molekulare Charakterisierung von Staphylococcus aureus-Isolaten und ESBL/AmpC- bildenden Escherichia coli.

Vortrag im Rahmen des Verbundtreffens des Projektes ZooGloW am 10.10.2016 im Bundesinstitut für Risikobewertung, Berlin.

Charakterisierung ESBL- und AmpC-produzierender Escherichia coli-Isolate aus legal und illegal importierten Fleischprodukten.

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Poster:

Staphylococcus aureus isolates from meat products legally and illegally introduced to Germany from non-EU countries harbor a variety of antimicrobial resistances and virulence factors.

68. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie e. V, 11. – 14.09.1026, Ulm.

Characterization of extended-spectrum β-lactamase- and AmpC-producing Escherichia coli from legally and illegally imported meat.

7th Symposium in Antimicrobial Resistance in Animals and the Environment (ARAE), 26. – 28.06.2017, Braunschweig.

ESBL- und AmpC-produzierende Escherichia coli in legal und illegal importierten Fleischprodukten: Charakterisierung der aus Drittländern stammenden Isolate.

Tagung der DVG Fachgruppe Bakteriologie und Mykologie, 30.05. – 01.06.2018, Hannover.

KEHRENBERG C., JANSEN W., GRABOWSKI N. T., MÜLLER A. (2018):

Blinde Passagiere: Multiresistente Salmonella enterica-Isolate auf legal und illegal importierten Fleischprodukten.

59. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene, 25.09. – 28.09.2018 Garmisch-Partenkirchen.

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Inhaltsverzeichnis V

Inhaltsverzeichnis

Publikationsverzeichnis ... I Inhaltsverzeichnis ... V Abkürzungsverzeichnis ... VII

Einleitung ... 1

1. Publikationen ... 5

2. 2.1 Publikation 1: ... 5

2.2 Publikation 2: ... 8

Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion ... 17

3. 3.1 Importierte Fleischprodukte als mögliche Vektoren für Zoonoseerreger ... 17

3.1.1 Gesetzliche Grundlagen für die legale Einfuhr von Fleischprodukten ... 17

3.1.2 Mikrobiologische Beschaffenheit legaler Importe ... 19

3.1.3 Illegal eingeführte Fleischprodukte ... 21

3.2 Untersuchte Isolate und ihre Herkünfte ... 23

3.3 Typisierung der untersuchten Isolate ... 25

3.3.1 Staphylococcus aureus ... 26

3.3.2 ESBL-/AmpC-produzierende Escherichia coli ... 30

3.3.3 Salmonella enterica ... 33

3.4 Antimikrobielle Resistenzen und Nachweis von Resistenzgenen ... 36

3.5 Virulenzeigenschaften und Nachweis Virulenz-assoziierter Gene ... 48

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3.6 Schlussfolgerung ... 53 Zusammenfassung ... 55 4.

Summary ... 59 5.

Literaturverzeichnis ... 63 6.

6.1 EU-Verordnungen ... 84 Danksagung ... 86

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Abkürzungsverzeichnis VII

Abkürzungsverzeichnis

APEC geflügelpathogener Escherichia coli (engl.: avian pathogenic E. coli) BORSA engl.: borderline oxacillin-resistant Staphylococcus aureus

bzw. beziehungsweise

CC Klonaler Komplex (engl.: clonal complex) CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

DGHM Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie ECDC European Centre for Disease Prevention and Control EFSA European Food and Safety Authority

EMA European Medicines Agency

ESBL β-Laktamase mit erweitertem Wirkspektrum (engl.: extended-spectrum β-lactamase) EPEC enteropathogener Escherichia coli

ExPEC extraintestinal-pathogener Escherichia coli EU Europäische Union

IATA International Air Transport Association IEC engl.: immune evasion cluster

kb Kilobasenpaare

µg/ml Mikrogramm pro Milliliter

MHK minimale Hemmstoffkonzentration

MLST Multilocus-Sequenztypisierung (engl.: multilocus sequence typing) MRSA Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus

MSSA Methicillin-sensibler Staphylococcus aureus

PCR Polymerase-Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction) PFGE Pulsfeld-Gelelektrophorese

PVL Panton-Valentin Leukozidin SPI Salmonella-Pathogenitätsinsel

ST Sequenztyp

STEC Shiga-Toxin-produzierender Escherichia coli

USA Vereinigte Staaten von Amerika (engl.: United States of America)

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Einleitung 1

Einleitung 1.

Fleisch und Fleischprodukte spielen eine wichtige Rolle als Vektoren für die Übertragung von Zoonoseerregern. Kontaminationsmöglichkeiten bestehen dabei auf allen Ebenen der Produktion: von einer Besiedlung der Tiere während der Aufzucht oder Mast, über ihre Schlachtung und die weitere Verarbeitung des Fleisches, bis hin zur Ebene des Endverbrauchers (GUPTA 2016). Über den Verzehr von unzureichend durchgegartem Fleisch oder Kreuzkontaminationen infolge unzureichender Küchenhygiene kann es in der Folge zu Lebensmittelinfektionen bzw. –intoxikationen des Verbrauchers kommen (GONÇALVES- TENÓRIO et al. 2018). Trotz strikter gesetzlicher Vorgaben und großer Anstrengungen seitens der Industrie und der Überwachsungsbehörden führen Lebensmittelinfektionserreger die Statistiken der meldepflichtigen Infektionskrankheiten des Robert-Koch-Instituts an (RKI 2017). Neben der Eigenproduktion der EU trägt die Einfuhr von Fleisch- und Fleischprodukten aus Drittländern entscheidend dazu bei, die große Nachfrage der EU-Bürger zu decken. Mit über 800.000 Tonnen jährlich wird besonders Geflügelfleisch in großen Mengen in die EU importiert (EC 2018). Durch den stetig wachsenden Umfang des internationalen Handels mit Lebensmitteln tierischen Ursprungs ist jedoch auch die Gefahr der Verbreitung Lebensmittel-assoziierter Erreger über weite Strecken größer als je zuvor.

Handelsgüter aus Drittländern, die zur Ein- oder Durchfuhr bestimmt sind, werden an ihrem jeweiligen Eintrittspunkt an den Außengrenzen der EU bzw. an See- und Flughäfen einer amtlichen Kontrolle unterzogen. Diese Kontrollen beschränken sich jedoch im Allgemeinen auf eine Prüfung der Begleitzertifikate, sowie eine visuelle Inspektion der Fracht, und ein unerkannter Eintrag von Zoonoseerregern durch kontaminierte Fleischimporte entlang globaler Handelsrouten kann trotz aller Anstrengungen derzeit nicht ausgeschlossen werden.

Neben dem legalen Import von Fleischprodukten werden solche Produkte zusätzlich auch in nicht unerheblichem Umfang illegal eingeführt, unter anderem im Gepäck von Flugreisenden.

Produkte, die auf diesem Wege in die EU gelangen, sind aus lebensmittelhygienischer Sicht besonders problematisch, da sie häufig unter Bedingungen hergestellt und transportiert wurden, die nicht den europäischen Standards entsprechen (FALK et al. 2013; JANSEN et al.

2016b). Erste Studien zeigten bereits, dass illegal eingeführte Fleischprodukte verschiedene Zoonoseerreger beherbergen können und einzelne Studien berichten auch von Isolaten mit

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multiplen antimikrobiellen Resistenzen (RODRÍGUEZ-LÁZARO et al. 2014, 2015a, 2015b, 2017; BEUTLICH et al. 2015; NAGY et al. 2015; SCHODER et al. 2015).

Zoonoseerreger mit Resistenzen gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen stellen eine besondere Gefahr für die Verbrauchergesundheit dar. So sind beispielsweise durch resistente Stämme hervorgerufene Salmonellosen mit schwerwiegenderen Erkrankungsverläufen, einer gesteigerten Hospitalisierungsrate und erhöhter Mortalität verbunden (VARMA et al. 2005;

VERRAES et al. 2013; KRUEGER et al. 2014). Nach Schätzung des European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC), der European Food Safety Authority (EFSA) und der European Medicines Agency (EMA), führen resistente Bakterien allein in der EU jährlich zu etwa 25.000 Todesfällen und verursachen finanzielle Verluste von über 1,5 Milliarden Euro (ECDC et al. 2017). Besonders Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) und Enterobacteriaceae mit Produktion von β-Laktamasen mit erweitertem Wirkspektrum (ESBL) spielen dabei eine wichtige Rolle als Erreger nosokomialer Infektionen. Diese, auch als „Krankenhauskeime“ bekannten Erreger, sind häufig resistent gegen eine Vielzahl verschiedener antimikrobieller Wirkstoffklassen. Dadurch werden die Behandlungsmöglichkeiten von Infektionen entscheidend eingeschränkt (LEISTNER et al.

2015; VENTOLA 2015; CHOO u. CHAMBERS 2016). Zunehmend werden jedoch auch durch MRSA oder ESBL-Bildner hervorgerufene Erkrankungen ohne Zusammenhang mit Krankenhausaufenthalten beobachtet (VENTOLA 2015; RAY et al. 2018). Die epidemiologischen Hintergründe der Verbreitung in der Bevölkerung sind komplex und bisher nicht endgültig geklärt. Nutztiere gelten jedoch als wichtiges Reservoir für resistente Bakterien und der Kontakt mit kontaminiertem Fleisch wurde als ein möglicher Übertragungsweg dieser Bakterien und ihrer Resistenzdeterminanten in der Bevölkerung diskutiert (DOI et al. 2010; OGATA et al. 2012; ARGUDÍN et al. 2017). Da resistenzvermittelnde Gene in vielen Fällen auf mobilen genetischen Elementen lokalisiert sind, können sie zudem durch horizontalen Gentransfer auf zuvor empfindliche Stämme derselben oder einer anderen bakteriellen Spezies übertragen werden (HOLMES et al. 2016).

Eine Übertragung kann auch auf kommensale Bakterien erfolgen, beispielsweise innerhalb des Darmmikrobioms, welche als Reservoir für Resistenzgene fungieren können (VERRAES et al. 2013). In der Folge kann es wiederum zu einer Übertragung auf pathogene Bakterien

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Einleitung 3

kommen. Neben einem direkten Gesundheitsrisiko durch die Ingestion resistenter Lebensmittelinfektionserreger besteht somit auch ein erhebliches indirektes Gesundheitsrisiko durch die effiziente Verbreitung von Resistenzdeterminanten (VERRAES et al. 2013).

Entsprechend können der internationale Handel mit Fleisch und Fleischprodukten sowie ihre illegale Verbringung die Ausbreitung antimikrobieller Resistenzen über weite Strecken fördern.

Derzeit gibt es kaum Daten zu den Charakteristika von Isolaten, die über Fleischwaren aus Drittländern in die EU gelangen. Insbesondere über jene aus illegal eingeführten Fleischprodukten ist nur sehr wenig bekannt. Da es jedoch innerhalb einer Bakterienspezies zum Teil erhebliche Unterschiede im Hinblick auf die Virulenz und die antimikrobielle Empfindlichkeit verschiedener Stämme gibt, sind dies wichtige Informationen, um mögliche Risiken für die Gesundheit der Verbraucher zu erkennen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher Zoonoseerreger aus legal und illegal importierten Fleischprodukten umfassend hinsichtlich ihrer phänotypischen und genotypischen Eigenschaften untersucht. Ein besonderer Fokus lag dabei auf der Ermittlung der antimikrobiellen Empfindlichkeit der Isolate und dem Nachweis von Resistenz-vermittelnden sowie Virulenz-assoziierten Genen.

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Publikationen 5

Publikationen 2.

2.1 Publikation 1:

Anja Müller, Diana Seinige, Wiebke Jansen, Günter Klein, Ralf Ehricht, Stefan Monecke, Corinna Kehrenberg (2016):

Variety of Antimicrobial Resistances and Virulence Factors in Staphylococcus aureus Isolates from Meat Products Legally and Illegally Introduced to Germany

PLoS ONE 11(12): e0167864. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0167864

Autorenbeteiligung:

Idee und Konzeption: CK, WJ, GK

Durchführung der Experimente: AM, DS

Auswertung der Daten: AM, CK, DS, RE, SM Erstellung des Manuskripts oder

kritische Durchsicht: AM, CK, DS, WJ, GK, RE, SM

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Variety of Antimicrobial Resistances and Virulence Factors in Staphylococcus aureus Isolates from Meat Products Legally and Illegally

Introduced to Germany

Anja Müller¹, Diana Seinige¹, Wiebke Jansen^1,2, Günter Klein¹, Ralf Ehricht^3,4, Stefan Monecke^3,4,5and Corinna Kehrenberg¹*

1Institute of Food Quality and Food Safety, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Hannover, Germany

2Integrated Veterinary Research Unit, University of Namur, Namur, Belgium

3Alere Technologies GmbH, Jena, Germany,

4InfectoGnostics research campus, Jena, Germany

5Institute for Medical Microbiology and Hygiene, Technische Universität Dresden, Dresden, Germany

Keywords: illegal import, non-EU countries, Staphylococcus aureus, MRSA, resistance genes, virulence genes

*Corresponding author

E-Mail: corinna.kehrenberg@tiho-hannover.de (CK)

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Publikationen 7

Abstract

Food products of animal origin can serve as a vehicle for Staphylococcus (S.) aureus, a facultative pathogen involved in a variety of diseases. As a result, international trade and illegal transportation of foodstuffs can facilitate the distribution of S. aureus over long distances. In this study, we investigated S. aureus isolates recovered from meat products confiscated from passengers returning from non-EU countries at two German airports and from samples of legally imported meats from non-EU countries. The aim was to characterize isolates in regard to their genetic relatedness as well as their antimicrobial resistance profiles and major virulence factors in order to assess potential risks associated with these products.

The isolates were characterized by spa typing, MLST, macrorestriction analysis, microarray analysis and antimicrobial susceptibility testing. MRSA isolates were further characterized by dru typing. The characteristics of the majority of the isolates indicated a human origin, rather than an association with livestock. The results further revealed a considerable heterogeneity among the MRSA isolates, despite their common origin. Overall, a plenitude of major virulence factors and antimicrobial resistances was detected among the isolates, highlighting the potential risks associated with contaminated meat products and the transportation of such products among different countries.

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Anja Müller, Wiebke Jansen, Nils Th. Grabowski, Stefan Monecke, Ralf Ehricht, Corinna Kehrenberg (2018):

ESBL- and AmpC-producing Escherichia coli from legally and illegally imported meat:

Characterization of isolates brought into the EU from third countries International Journal of Food Microbiology, 283, 52-58.

https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2018.06.009

Idee und Konzeption: CK, AM, WJ, NG

Durchführung der Experimente: AM

Auswertung der Daten: AM, CK, SM, RE

Erstellung des Manuskripts oder

kritische Durchsicht: AM, CK, WJ, NG, SM, RE

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Publikationen 9

ESBL- and AmpC-producing Escherichia coli from legally and illegally imported meat: Characterization of isolates brought into the EU

from third countries

Anja Müller¹, Wiebke Jansen², Nils Th. Grabowski¹, Stefan Monecke^3,4, Ralf Ehricht^3,4, Corinna Kehrenberg¹*

1Institute for Food Quality and Food Safety, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Bischofsholer Damm 15, 30173 Hannover, Germany

2Integrated Veterinary Research Unit, University of Namur, rue de Bruxelles 61, B-5000 Namur, Belgium

3Abbott Rapid Diagnostics, Löbstedter Str. 103-105, 07749 Jena, Germany;

4InfectoGnostics research campus, Philosophenweg 7, 07743 Jena, Germany

Keywords: ESBL, Escherichia coli, illegal import, legal import, antimicrobial resistance, virulence

E-Mail: corinna.kehrenberg@tiho-hannover.de

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Abstract

Multiresistant Enterobacteriaceae producing extended-spectrum β-lactamases (ESBL) constitute a serious healthcare concern. Contaminated meat and meat products have been suggested as a major transmission route for these strains in the population. In this study, 36 ESBL-/AmpC-producing Escherichia (E.) coli isolates recovered from meat products imported into the EU from third countries (non-EU countries), both legally and illegally, were examined with regard to their antibiotic resistance profiles, virulence-associated genes and their genetic relatedness. The isolates were characterized by antibiotic susceptibility testing, multilocus sequence typing, macrorestriction analysis, microarray analyses and additional PCR assays. The most prevalent ESBL gene among the isolates was blaCTX-M-2 (n=15), followed by the AmpC β-lactamasegene blaCMY-2 (n=8). The remaining isolates carried genes belonging to CTX-M groups 8, 1 or 9, or blaSHV-12. This distribution differs from the genotypes typically detected in meat-associated isolates of European origin. Most isolates showed additional phenotypic resistances and genes conferring resistance to further antimicrobial agents were detected through microarray analysis. Most commonly observed were resistances to tetracycline, sulfamethoxazole/trimethoprim, and gentamicin. A genotype conferring multidrug resistance to 3 or more classes of antimicrobials could be observed in 33 isolates (91.7%). Most isolates carried at least one virulence associated gene and one isolate could be identified as an enteropathogenic E. coli, indicating a potential risk to consumers' health. Molecular typing results revealed a genetic variety among the isolates. The most common multilocus sequence types were ST101 and ST117, represented by three isolates each. One isolate belonged to ST131 and three novel sequence types could be identified among three isolates (ST7509, ST7602, ST7845). Group D was the most prevalent phylogenetic group, which was represented by 18 isolates. Overall, the results of this study show that imported meat products can constitute a source for locally uncommon lineages of multidrug resistant and virulent ESBL-producing E. coli and can thereby facilitate their dissemination in Europe.

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Publikationen 11

Wiebke Jansen, Svenja Woudstra, Anja Müller, Nils Th. Grabowski, Gundela Schoo, Bettina Gerulat, Günter Klein, Corinna Kehrenberg (2018):

The safety and quality of pork and poultry meat imports for the common European market received at border inspection post Hamburg Harbour between 2014 and 2015.

PLoS ONE 13(2): e0192550. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0192550

Idee und Konzeption: WJ, NG, GK, CK

Durchführung der Experimente: WJ, SW, AM, GS, BG Auswertung der Daten: WJ, SW, AM, NG, GS, BG Erstellung des Manuskripts oder

kritische Durchsicht: WJ, AM, NG, CK

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The safety and quality of pork and poultry meat imports for the common European market received at border inspection post Hamburg Harbour

between 2014 and 2015

Wiebke Jansen^1¤a, Svenja Woudstra^1¤b, Anja Müller¹, Nils Grabowski¹, Gundela Schoo², Bettina Gerulat², Günter Klein^1†, Corinna Kehrenberg¹*

1Institute for Food Quality and Food Safety and Research Center for Emerging Infections and Zoonoses (RIZ), University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Hannover,

Germany

2Border Inspection Post Hamburg Harbour, Civil Authority for Health and Consumer Protection, Hamburg, Germany

†Deceased

¤aCurrent address: Integrated Veterinary Research Unit, Narilis, University of Namur, Namur, Belgium

¤bCurrent address: Clinic for Cattle, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Hannover, Germany

Keywords: Foodborne zoonoses, microbiological criteria, AMR, Staphylococcus aureus, DGHM

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Publikationen 13

Abstract

Though imports of products of animal origin into the European Union (EU) have to comply with legal requirements and quality standards of the community, food consignment rejections at external EU borders have been increasing in recent years. This study explored microbiological metrics according to national target and critical values valid for samples at consumer level of 498 fresh poultry meat and 136 fresh pork filets from consignments subjected to physical checks during clearing at the border inspection post Hamburg harbour between January 2014 and December 2015 with ISO standard methods. Quantitative results indicated that critical thresholds for aerobic counts, Enterobacteriaceae, and E. coli were never surpassed. Merely for staphylococci, one poultry sample (0.2%) and 10 pork samples (9.3%) exceeded the critical limit (3.7 log cfu/g). However, qualitative analyses revealed that, Staphylococcus aureus was present in 16% and 10% of all poultry and pork samples, respectively, though no methicillin-resistant Staphylococcus aureus could be confirmed.

Moreover, E. coli was present in 50% and 67% of all pork and poultry samples, respectively, and thereof 33 isolates were confirmed as extended-spectrum β-lactamase-producing E. coli.

Only 1.2% of the poultry samples were unacceptable due to the presence of Salmonella spp., whereas they were not detected in any pork sample. Campylobacter spp. were not detected in any sample. Though imported pork and poultry meat complies mostly with national market requirements, it might pose a potential risk to public health, especially for a direct or indirect foodborne transmission of imported, uncommon strains of zoonotic bacteria.

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Anja Müller, Wiebke Jansen, Nils Th. Grabowski, Corinna Kehrenberg (2018):

Characterization of Salmonella enterica serovars recovered from meat products legally and illegally imported into the EU reveals the presence of multiresistant and AmpC-producing isolates.

Gut Pathogens, 10, 40. https://doi.org/10.1186/s13099-018-0268-3

Idee und Konzeption: CK, AM, WJ, NG

Durchführung der Experimente: AM

Auswertung der Daten: AM, CK

Erstellung des Manuskripts oder

kritische Durchsicht: AM, CK, WJ, NG

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Publikationen 15

Characterization of Salmonella enterica serovars recovered from meat products legally and illegally imported into the EU reveals the presence of

multiresistant and AmpC-producing isolates

Anja Müller¹, Wiebke Jansen^1,2, Nils Th. Grabowski¹ and Corinna Kehrenberg¹*

1Institute of Food Quality and Food Safety, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Bischofsholer Damm 15, 30173 Hannover, Germany

2Integrated Veterinary Research Unit, University of Namur, rue de Bruxelles 61, B-5000 Namur, Belgium

Keywords: AmpC-β-lactamase, antimicrobial resistance, legal import, illegal import, meat products, Salmonella enterica

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Abstract

Background

Food products of animal origin brought into the EU from third countries, both legally and illegally, can harbor foodborne pathogens such as Salmonella enterica. In this study, we examined five S. enterica isolates recovered either from legally imported chicken meat (n = 3) or from meat products confiscated from air travel passengers arriving in Germany (n = 2). The isolates were serotyped and further characterized by antimicrobial susceptibility testing, PCR- detection and sequencing of genes associated with antimicrobial resistances, and macrorestriction analysis. Transferability of resistance to third-generation cephalosporins was assessed by conjugation experiments and the plasmids tested for their incompatibility groups.

Results

The three isolates from legal imports were identified as S. Heidelberg or as non-flagellated.

All three isolates were identified as AmpC producers carrying blaCMY-2 and as non-susceptible to ciprofloxacin. They were additionally resistant to tetracycline and sulfamethoxazole. The blaCMY-2-carrying plasmids were transferable by conjugation and belonged to incompatibility groups IncI1 or IncA/C. The two isolates from illegally imported meat belonged to the serovars Infantis or Weltevreden. The former was phenotypically resistant to five classes of antimicrobial agents while the S. Weltevreden isolate was fully susceptible to all agents tested.

Conclusion

The results of this study demonstrate that meat products imported from third countries, both legally and illegally, can harbor multiresistant Salmonella enterica. Consequently, these imports could constitute a source for the dissemination of antimicrobial resistant isolates, including those resistant to third-generation cephalosporins and fluoroquinolones.

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Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion 17

Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion 3.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden bakterielle Lebensmittelinfektions- bzw. -intoxikations- erreger untersucht, die aus legal und illegal aus Drittländern eingeführten Fleischwaren isoliert wurden. Dabei wurden Isolate der Spezies Staphylococcus aureus, Escherichia coli und Salmonella enterica mittels mikrobiologischer und molekularbiologischer Methoden hinsichtlich ihrer phänotypischen und genotypischen Charakteristika untersucht. Die ermittelten Daten liefern detaillierte Informationen über die Eigenschaften von Isolaten, die über den internationalen Handel und die illegale Einfuhr von Fleisch und Fleischprodukten aus Drittländern nach Deutschland gelangen. Dies soll dabei helfen zu überprüfen, ob solche Produkte ein mögliches Reservoir für resistente und/oder besonders virulente Stämme der untersuchten Bakterienspezies darstellen.

3.1 Importierte Fleischprodukte als mögliche Vektoren für Zoonoseerreger

3.1.1 Gesetzliche Grundlagen für die legale Einfuhr von Fleischprodukten

Um ein möglichst hohes Niveau der Lebensmittelsicherheit zu erreichen müssen Lebensmittel, die innerhalb der Europäischen Union vermarktet werden, eine Reihe rechtlicher Anforderungen erfüllen. Die allgemeinen Grundsätze zur Lebensmittelsicherheit und dem Verbraucherschutz wurden in der Verordnung (EG) Nr. 178/2002 des Europäischen Parlaments und des Rates festgelegt. Diese sogenannte „Basisverordnung“ wird durch weitere Verordnungen und Richtlinien ergänzt bzw. konkretisiert. Dabei sind besonders die Verordnungen (EG) Nr. 852/2004, 853/2004, 854/2004 und 2073/2005 zu nennen, die auch als „EU-Hygienepaket“ bezeichnet werden. Diese beinhalten Vorgaben zu allgemeinen und spezifischen Hygienevorschriften für Lebensmittel tierischen Ursprungs sowie deren Überwachung. In Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 über mikrobiologische Kriterien für Lebensmittel sind zudem spezifische Grenzwerte für verschiedene Produktkategorien festgelegt, welche neben verschiedenen Mikroorganismen auch von ihnen gebildete Toxine

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und schädliche Metabolite umfassen. Mit dem allgemeinen Geltungsbeginn der umfangreichen Verordnung (EU) 2017/625, auch als EU-Kontroll-Verordnung bezeichnet, werden ab Dezember 2019 verschiedene derzeit gültige Verordnungen aufgehoben bzw.

ersetzt, darunter auch Verordnung (EG) 854/2004. Ziel ist die Bündelung verschiedener Rechtsvorschriften in einem Rechtsakt, eine engere Zusammenarbeit der EU-Mitgliedsstaaten sowie die Harmonisierung und Optimierung der amtlichen Kontrollen.

Für importierte Lebensmittel gelten grundsätzlich die gleichen Mindestanforderungen wie für Produkte aus dem Binnenmarkt. Laut Verordnung (EG) Nr. 854/2004 ist der Import von Lebensmitteln tierischen Ursprungs nur aus Drittländern vorgesehen, deren zuständige Behörden angemessene Garantien für die Einhaltung dieser Anforderungen bieten.

Zugelassene Länder bzw. Regionen innerhalb eines Drittlandes werden in entsprechenden Positivlisten aufgeführt. Zusätzlich wurden an den EU-Außengrenzen Grenzkontrollstellen eingerichtet, an denen sämtliche Warensendungen aus diesen Drittstaaten einer Einfuhrkontrolle durch die zuständigen Behörden unterzogen werden. Im Wesentlichen beschränken sich diese Kontrollen auf eine Dokumentenprüfung sowie eine stichprobenartige Nämlichkeitskontrolle der Warenlieferungen. Nur ein Teil wird physischen Kontrollen unterzogen. Laut Entscheidung 94/360/EG ist dabei für Schweinefleisch eine Kontrollhäufigkeit von mindestens 20% und bei Geflügelfleisch eine Kontrolle von mindestens 50% aller Warensendungen vorgeschrieben. Weiterführende Laboruntersuchungen erfolgen entweder im Verdachtsfall oder risikoorientiert, als Planproben im Rahmen des mehrjährigen nationalen Kontrollplans, basierend auf Verordnung (EG) Nr. 882/2004. Warenlieferungen, welche die entsprechenden Anforderungen nicht erfüllen, werden an der EU-Außengrenze zurückgewiesen. In den vergangenen Jahren kam es angesichts des steigenden Importvolumens vermehrt zu solchen Grenzzurückweisungen durch die europäischen Grenzkontrollstellen, häufig aufgrund einer Kontamination mit pathogenen Mikroorgansimen (JANSEN et al. 2016a; EC 2017).

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3.1.2 Mikrobiologische Beschaffenheit legaler Importe

Meldungen über Missstände in exportierenden Ländern können den Verbraucher verunsichern. Ein aktuelles Beispiel stellen die polizeilichen Ermittlungen im brasilianischen Fleischsektor dar, welche auch Exportbetriebe mit EU-Zulassung betrafen (EC 2017). Die im Rahmen von Publikation 3 untersuchten Proben von importiertem frischen Schweine- und Geflügelfleisch, darunter auch ein großer Anteil von Geflügelfleisch aus Brasilien, waren jedoch im Hinblick auf mikrobiologische Lebensmittelsicherheits- und –qualitätskriterien zum überwiegenden Teil als unbedenklich anzusehen. Neben den in Verordnung (EG) Nr.

2073/2005 festgelegten Kriterien wurden zur Bewertung der erhobenen Daten auch die Richt- und Warnwerte der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM) herangezogen. Diese rechtlich nicht bindenden Empfehlungen bieten ergänzend zu Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 eine Orientierung über die Art und Anzahl von Mikroorganismen, die auf einem bestimmten Produkt zu erwarten sind (Richtwert) bzw. noch akzeptabel sind (Warnwert) (DGHM 2018). Sie umfassen Werte für verschiedene Hygieneindikatoren wie Enterobakterien und die aerobe mesophile Keimzahl, sowie für pathogene Mikroorgansimen, die eine Gefährdung für die Verbrauchergesundheit darstellen, beispielsweise Salmonella spp. und Listerien.

Von den untersuchten Proben von legalen Importen überschritt keine der 498 Geflügelfleisch- und 136 Schweinefiletproben die Warnwerte für Enterobacteriaceae, E. coli oder die aerobe mesophile Keimzahl. Lediglich eine Geflügel- und zehn Schweinefiletproben überschritten den Warnwert von 3,7 log10 koloniebildenden Einheiten pro Gramm (KbE/g) für Staphylokokken. Eine Überschreitung der Richtwerte (jedoch ohne Überschreitung der Warnwerte) wurde hingegen bei einigen Proben festgestellt und war häufiger bei Schweinefleischproben zu beobachten als bei Geflügelfleisch. Dies betraf besonders die Richtwerte für Enterobacteriaceae, E. coli und Staphylokokken, die von 9,6%, 7,4% bzw.

13,4% der Schweinefleischproben überschritten wurden, wohingegen dies bei jeweils weniger als 1% der Geflügelfleischproben der Fall war. Allgemein lagen die ermittelten Keimzahlen jedoch zumeist weit unterhalb der jeweiligen Richtwerte, was auf eine gute Prozesshygiene und angemessene Transportbedingungen schließen lässt.

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Die qualitative Bestimmung von Lebensmittelsicherheitskriterien ergab, dass 1,2% der Geflügelfleischproben aufgrund des Nachweises von Salmonella spp. als inakzeptabel anzusehen waren. Aus den Schweinefleischproben hingegen wurden keine Salmonellen isoliert. Ebenso konnten weder Yersinia enterocolitica noch Campylobacter spp. in den untersuchten Schweine- bzw. Geflügelfleischproben nachgewiesen werden. S. aureus konnte qualitativ bei 10,3% der Schweinefleisch- und 16% der Geflügelfleischproben nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu werden in Geflügelfleisch innerhalb der EU wesentlich höhere Prävalenzen von Salmonella spp., Campylobacter spp. und S. aureus ermittelt. Eine aktuelle Meta-Analyse von Gonçalves-Tenório und Kollegen zeigt, dass im Mittel etwa 38,5% des europäischen Geflügelfleischs S. aureus beherbergt, 33,3% positiv für Campylobacter spp. ist und auf 7,1% Salmonella spp. nachgewiesen werden können (GONÇALVES-TENÓRIO et al. 2018). Auch die EFSA und das ECDC berichten von sehr ähnlichen Prävalenzen von Campylobacter spp. uns Salmonella spp. auf Hähnchenfleisch (EFSA u. ECDC 2017).

Die Proben von legal eingeführtem Geflügel- und Schweinefleisch wurden zudem auf die Anwesenheit von MRSA und ESBL-/AmpC-bildenden E. coli untersucht. MRSA konnten dabei in keiner Probe bestätigt werden. Insgesamt 6,4% der Geflügelfleischproben, sowie eine einzelne Schweinefleischprobe, beherbergten ESBL-/AmpC-bildende E. coli. Diese Werte liegen ebenfalls unter den in der EU ermittelten. Nach Angaben der EFSA und des ECDC können in etwa 60% der europäischen Geflügelfleischproben ESBL-/AmpC-Bildner nachgewiesen werden (EFSA u. ECDC 2018). Auch südamerikanisches Geflügelfleisch weist in der Literatur höhere Raten an ESBL-/AmpC-Bildnern auf (CANTÓN et al. 2008;

EGERVÄRN et al. 2014; KOGA et al. 2015). In einer Studie von Egervärn und Kollegen wurden sogar in 95% der untersuchten Proben von Geflügelfleisch aus Brasilien ESBL- /AmpC-Bildner nachgewiesen (EGERVÄRN et al. 2014). Laut einer aktuellen Meta-Analyse liegt die gepoolte Prävalenz von MRSA auf Geflügelfleisch in Südamerika bei etwa 27%

(RIBEIRO et al. 2018).

Möglicherweise hatte die Tatsache, dass die untersuchten Proben von legal importiertem Schweine- und Geflügelfleisch bis zur mikrobiologischen Untersuchung gefroren gelagert wurden, einen Einfluss auf den Erregernachweis. Auch Gonçalves-Tenório und Kollegen stellten fest, dass das Einfrieren von Geflügelfleisch die Nachweisrate von Campylobacter spp. stark reduziert, während für andere bakterielle Spezies nicht genügend Daten für eine

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Ableitung des Einflusses einer Gefrierbehandlung vorhanden waren (GONÇALVES- TENÓRIO et al. 2018). Des Weiteren können methodische Unterschiede der Anzuchtverfahren, beispielsweise die Verwendung anderer Selektivmedien oder unterschiedliche Vorgehensweisen hinsichtlich einer Voranreicherung, mitunter die Nachweisraten beeinflussen (SAFDAR et al. 2003; JAZMATI et al. 2016).

3.1.3 Illegal eingeführte Fleischprodukte

Auch Privatpersonen können zum unerwünschten Import kontaminierter Lebensmittel tierischen Ursprungs beitragen. Die private Einfuhr von Fleischwaren aus Drittländern ist laut Verordnung (EG) Nr. 206/2009 grundsätzlich verboten. Diesbezüglich gibt es nur wenige Ausnahmen, beispielsweise für gewisse Mengen bei Anreise aus Island, Grönland oder den Färöern. Dennoch werden Fleisch und Fleischprodukte im Rahmen des internationalen Reiseverkehrs in nicht unerheblichen Mengen auch aus anderen Ländern illegal im Reisegepäck mitgeführt (JANSEN et al. 2016b). Die Internationale Luftverkehrs-Vereinigung (International Air Transport Association, IATA) verzeichnet seit Jahren stetig ansteigende Passagierzahlen und schätzt eine ungefähre Verdopplung der derzeitigen jährlichen Zahl an Flugreisenden auf bis zu 7,8 Milliarden Personen bis zum Jahr 2036 (IATA 2017, 2018).

Entsprechend ist auch ein Anstieg der illegal im Reisegepäck mitgeführten Lebensmittel tierischen Ursprungs zu erwarten. Bereits in den Jahren 2010 und 2011 wurden allein an den Flughäfen Berlin Schönefeld und Frankfurt am Main zusammen etwa 11 Tonnen Fleischprodukte pro Jahr durch die zuständigen Behörden konfisziert (JANSEN et al. 2016b).

Da nicht alle Reisenden kontrolliert werden können, liegt die Dunkelziffer der Fleischprodukte, die auf diesem Weg eingeführt werden, vermutlich wesentlich höher (JANSEN et al. 2015). Meist werden vergleichsweise kleine Mengen dieser Produkte illegal eigenführt und sie sind häufig für den Eigenverzehr bestimmt, sodass vermutlich keine nennenswerte Verteilung in der Bevölkerung stattfindet. Jedoch sind sie unter unbekannten Produktionsbedingungen hergestellt sowie unter teils problematischen hygienischen Bedingungen transportiert worden und sind somit aus lebensmittelhygienischer Sicht als besonders kritisch anzusehen (FALK et al. 2013). Da über die Eigenschaften von

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Bakterienisolaten auf illegal im Reisegepäck mitgeführten Fleischprodukten bisher nur sehr wenig bekannt ist, wurden auch solche Isolate im Rahmen dieser Arbeit weitergehend untersucht. Die Isolate wurden aus illegal eingeführten Fleischprodukten gewonnen, welche im Rahmen von Routinekontrollen an den Flughäfen Berlin Schönefeld und Frankfurt/Main von Flugreisenden konfisziert wurden. Die Isolation erfolgte mittels der gleichen Methodik, wie bei den legalen Proben. MRSA konnten dabei aus 6% der untersuchten Proben isoliert werden. In zwei spanischen Studien wurden in jeweils 3% der untersuchten illegal importierten Lebensmittel tierischen Ursprungs MRSA nachgewiesen (RODRÍGUEZ- LÁZARO et al. 2015b, 2017).

ESBL-/AmpC-bildende E. coli konnten aus drei der 126 Proben (2,3%) von illegal eingeführtem Geflügelfleisch nachgewiesen werden, wohingegen alle 171 untersuchten Schweinefleischprodukte negativ waren. In einer Studie von Nagy et al. wurden im Rahmen der Resistenztestung von vermeintlich kommensalen E. coli unter 113 untersuchten Isolaten aus illegal in die EU eingeführten Lebensmitteln tierischen Ursprungs zwei ESBL-Bildner identifiziert, ein gezielter Nachweis des entsprechenden Resistenzphänotyps erfolgte jedoch nicht (NAGY et al. 2015).

Salmonella enterica-Isolate wurden aus zwei untersuchten Proben gewonnen. In der Literatur sind unterschiedliche Nachweisraten von Salmonellen auf illegal in die EU eingeführten Lebensmitteln beschrieben. Zwei Studien berichten von einer sehr geringen Nachweisrate von jeweils etwa 1%, während die Autoren einer Studie aus Spanien in 5,5% der untersuchten Proben Salmonellen nachweisen konnten (RODRÍGUEZ-LÁZARO et al. 2014; BEUTLICH et al. 2015; SCHODER et al. 2015).

Für die Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit standen somit neben den Isolaten aus legal importierten Fleischwaren zusätzlich insgesamt 17 S. aureus (davon neun präsumtive

MRSA), drei ESBL-/AmpC-bildende E. coli und zwei Salmonella enterica-Isolate aus illegal importierten Fleischprodukten zur Verfügung.

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3.2 Untersuchte Isolate und ihre Herkünfte

Eine eingehende molekulare Charakterisierung erfolgte von Isolaten der Spezies S. aureus, E.

coli und Salmonella enterica subsp. enterica. Es wurden zudem gezielt präsumtive MRSA- und ESBL-/AmpC-produzierende E. coli-Isolate in die Untersuchungen einbezogen, die ein Wachstum auf entsprechenden Selektivmedien zeigten. Da auch Methicillin-sensible S.

aureus (MSSA) bedeutende Virulenzfaktoren tragen können und teils multiple Resistenzen gegenüber anderen antimikrobiellen Wirkstoffklassen aufweisen, wurden zusätzlich auch MSSA-Isolate untersucht. Insgesamt standen 23 S. aureus, 36 ESBL-/AmpC-produzierende E. coli sowie fünf Salmonella enterica-Isolate für die weiteren Analysen zur Verfügung. Die Probenart und die Herkunft der Proben, aus denen die Isolate gewonnen wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Dabei fällt auf, dass die ESBL-/AmpC-bildenden E. coli zum überwiegenden Teil aus legal importierten Geflügelfleischproben stammten, während die MRSA-Isolate alle aus illegal eingeführtem Fleisch gewonnen wurden. Da die MRSA-Isolate zu einem großen Anteil vermutlich auf eine Verunreinigung durch Personen zurückzuführen sind, worauf in Kapitel 3.3.1 näher eingegangen wird, ist eine mangelhafte Hygiene im Umgang mit illegal verbrachten Produkten eine mögliche Erklärung für die vermehrte MRSA-Detektion im Vergleich zu legalen Importen. Jedoch war die Anzahl der verfügbaren Isolate begrenzt, sodass die beobachtete Verteilung nicht zwangsläufig repräsentativ ist.

Insgesamt stammte der überwiegende Teil aller Isolate aus Geflügelfleisch. Die legalen Geflügelfleischimporte wurden dabei nahezu ausschließlich aus Südamerika eingeführt, insbesondere aus Brasilien. Die illegal eingeführten Geflügelfleischprodukte, aus denen Isolate gewonnen wurden, stammten alle aus Ägypten.

Bei der Betrachtung der Herkünfte ist jedoch zu beachten, dass nur aus zugelassenen Drittländern Fleisch in die EU importiert wird und auch die Herkunft der illegal eingeführten Produkte entscheidend davon beeinflusst wurde, welche Flüge an den entsprechenden Flughäfen bedient werden. Es bestand somit grundsätzlich eine gewisse Assoziation der einzelnen Probenkategorien, sowie der daraus gewonnen Isolate, zu bestimmten Herkunftsländern. Zudem ist jeweils nur die Herkunft des Fluges eindeutig bekannt. Es ist also prinzipiell möglich, dass ein illegal eingeführtes Produkt nicht aus dem Land stammen

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könnte, aus dem der Flug gestartet ist, sondern bereits vorher über eine Ländergrenze hinweg transportiert wurde.

Tabelle 1: Herkünfte der untersuchten Isolate

Spezies Probenart Herkunftsland Anzahl Isolate Escherichia coli Geflügelfleisch legal Brasilien 29

Chile 3

Geflügelfleisch illegal Ägypten 3

Schweinefleisch legal Chile 1

Staphylococcus aureus

Geflügelfleisch illegal Ägypten 14 Geflügelfleisch legal Brasilien 2

Argentinien 1

Chile 1

Thailand 1

Schweinefleisch legal Chile 1

Schweinefleisch illegal Russland 1 Weißrussland 1

Vietnam 1

Salmonella enterica

Geflügelfleisch legal Brasilien 3 Geflügelfleisch illegal Ägypten 1 Kaninchenfleisch illegal Vietnam 1

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3.3 Typisierung der untersuchten Isolate

Typisierungsverfahren ermöglichen eine Differenzierung von Isolaten derselben Spezies und die Bestimmung ihrer Klonalität. Eine Erregertypisierung kann somit entscheidend dazu beitragen, epidemiologische Zusammenhänge und geographische Verteilungen zu erkennen, sowie spezifische Stämme zu identifizieren (WICHELHAUS et al. 2000). Dafür wurde eine Vielzahl verschiedener Typisierungsmethoden entwickelt, welche jeweils bestimmte Vor- und Nachteile haben (SABAT et al. 2013). Für viele Erreger wird die Makrorestriktionsanalyse mit anschließender Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) aufgrund ihres besonders hohen diskriminatorischen Potentials als Goldstandard angesehen (SABAT et al. 2013; SHARMA- KUINKEL et al. 2016). Des Weiteren gibt es für viele Bakterienspezies etablierte sequenzbasierte Typisierungsschemata. Die Multilocus-Sequenztypisierung (MLST), welche die Analyse multipler Genabschnitte einschließt, eignet sich besonders gut für die Analyse langzeitepidemiologischer Zusammenhänge (COOKSON et al. 2007; SABAT et al. 2013).

Für einige Erreger gibt es zudem Verfahren, bei denen eine Typisierung über die Sequenzierung eines einzelnen aussagekräftigen Genlocus erfolgt (SABAT et al. 2013).

Um eine besonders präzise Differenzierung auch nahe verwandter Isolate zu erreichen und mögliche Schwächen einzelner Methoden auszugleichen, ist es häufig sinnvoll, verschiedene adäquate Typisierungsverfahren zu kombinieren (SABAT et al. 2013).

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Isolate daher mittels verschiedener, für die jeweilige Spezies geeigneter Methoden untersucht. Für die Isolate der Spezies S. aureus und E. coli wurde neben PFGE und PCR-basierten Typisierungsverfahren auch eine DNA-Mikroarray- Analyse durchgeführt. Dabei erfolgt ein simultaner Nachweis einer Vielzahl verschiedener Gene mittels hochspezifischer Gensonden (BALLMER et al. 2007; MONECKE et al. 2011).

Über die entstehenden Hybridisierungsmuster oder den direkten Nachweis bestimmter, für eine Typisierung geeigneter Gene, kann so auch eine Zugehörigkeit zu klonalen Linien abgeleitet werden. Die Ergebnisse werden im Folgenden nach Spezies getrennt diskutiert.

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3.3.1 Staphylococcus aureus

Für S. aureus existiert eine Reihe anerkannter, sequenzbasierter Typisierungsverfahren. Diese umfassen insbesondere die MLST, basierend auf Allelen von sieben Haushaltsgenen, und die spa-Typisierung (COOKSON et al. 2007; JOHLER u. STEPHAN 2010). Letztere erfolgt anhand von Polymorphismen im Gen für das Protein A, welches der Zellwand von S. aureus aufgelagert ist (JOHLER u. STEPHAN 2010). Genetisch verwandte Linien werden basierend auf den Ergebnissen der Sequenzanalysen zu sogenannten klonalen Komplexen zusammengefasst. Der im Rahmen dieser Studie verwendete DNA-Mikroarray ermöglicht ebenfalls eine Zuordnung zu klonalen Komplexen anhand von Hybridisierungsmustern, welche eine gute Korrelation mit der Zuordnung anhand von MLST-Daten aufweist (MONECKE et al. 2008).

Unter den 23 im Rahmen dieser Arbeit untersuchten S. aureus waren Isolate aus sieben verschiedenen klonalen Komplexen vertreten. Am häufigsten wurden Isolate den klonalen Komplexen (CC) 1 oder 5 zugeordnet. Beides sind weit verbreitete klonale Komplexe. Sie umfassen diverse MRSA-Stämme mit hoher klinischer Relevanz, entweder als Erreger nosokomialer Infektionen („hospital-associated MRSA“, HA-MRSA) oder von Erkrankungen ohne Bezug zu Krankenhausaufenthalten („community-associated“, CA-MRSA) (MONECKE et al. 2011). Zudem werden auch Nutztier-assoziierte MRSA und MSSA diesen beiden klonalen Komplexen zugeordnet (KÖCK et al. 2013; ALBA et al. 2015). In der EU werden auf Fleischprodukten am häufigsten S. aureus-Isolate des CC398 nachgewiesen, welcher als dominanter Nutztier-assoziierter CC in Europa gilt (DE BOER et al. 2009;

TEGEGNE et al. 2017; EFSA u. ECDC 2018). Zunehmend werden allerdings auch durch CC398-MRSA und andere Nutztier-assoziierte Stämme hervorgerufene Erkrankungen bei Menschen beschrieben, auch wenn ihr Anteil an den gesamten humanen MRSA-Infektionen derzeit vergleichsweise gering ist (KÖCK et al. 2013; BERNING et al. 2015; LARSEN et al.

2017). Von den Isolaten, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden, gehörte jedoch keines zu diesem klassischen Nutztier-assoziierten CC. Drei der MRSA-Isolate, die aus illegal eingeführtem Geflügelfleisch aus Ägypten isoliert wurden, gehörten dem CC80 an. Dieser setzt sich zum überwiegenden Teil aus einer spezifischen klonalen Linie von CA-MRSA zusammen, die auch als europäischer CA-MRSA-Klon bezeichnet wird (MONECKE et al.

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2011). Trotz dieser Bezeichnung sind diese Stämme auch im Nahen Osten, und somit auch in Ägypten, weit verbreitet (MONECKE et al. 2011; ABDULGADER et al. 2015).

Für die weitere Differenzierung phylogenetischer Beziehungen zwischen den Isolaten wurde eine spa-Typisierung durchgeführt und jeweils ein repräsentatives Isolat pro spa-Typ wurde zusätzlich mittels MLST untersucht. Insgesamt wurden zehn verschiedene spa-Typen identifiziert. Am häufigsten war der spa-Typ t127, welcher mit dem MLST Sequenztyp ST1 assoziiert ist. Diesem gehörten acht MSSA- sowie zwei MRSA-Isolate an. In einer umfangreichen epidemiologischen Analyse wurde ermittelt, dass MSSA-Isolate von Patienten mit invasiven Infektionsverläufen in Europa am sechsthäufigsten dem spa-Typ t127 angehören (GRUNDMANN et al. 2010). Eine weitere Studie zeigte, dass etwa ein Drittel aller CA-MRSA in einem britischen Krankenhaus t127 angehörte (OTTER et al. 2009). CC1 MRSA des spa-Typs t127 werden auch regelmäßig aus Nutztieren isoliert. In einer vergleichenden Studie wurde gezeigt, dass t127 MRSA von Rindern eine sehr hohe genetische Ähnlichkeit zu Isolaten von Menschen aufwiesen, was das zoonotische Potential dieser Stämme verdeutlicht (ALBA et al. 2015).

In Deutschland gehören MRSA aus Geflügelfleisch besonders häufig spa-Typen an, die mit CC398-assoziiert sind, beispielsweise t011 (FESSLER et al. 2011; KÖCK et al. 2013). Zu den häufigsten nicht-CC398-assoziierten spa-Typen bei Isolaten von Geflügelfleisch zählen t1430 (CC9) und t002 (CC5) (KÖCK et al. 2013; VOSSENKUHL et al. 2014). Letzterem wurden auch zwei Isolate im Rahmen dieser Arbeit zugeordnet, wohingegen kein Isolat einem CC398-assozierten spa-Typ angehörte.

Die MLST-Analyse von insgesamt zehn Isolaten zeigte, dass drei der Isolate neue Varianten eines Allels oder eine neue Kombination bekannter Allele aufwiesen. Sie konnten dementsprechend keinem bestehenden Sequenztyp zugeordnet werden. Basierend auf den Sequenzen dieser Isolate wurden somit vom Kurator der S. aureus MLST-Datenbank (https://pubmlst.org/saureus) die neuen Sequenztypen ST3216, ST3217 und ST3218 definiert.

Sie unterschieden sich in jeweils einem einzelnen Allel von den Sequenztypen ST15, ST80 bzw. ST5 und gehörten somit zu den klonalen Komplexen CC15, CC80 oder CC5. Diese vergleichsweise hohe Anzahl neu beschriebener Sequenztypen weist auf bisher wenig

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bekannte S. aureus-Klone hin, die über Fleisch- und Fleischprodukte aus Drittländern in die EU gelangen.

Für MRSA gibt es weitere Typisierungsverfahren, welche auf einer Charakterisierung der für ihre Methicillin-Resistenz verantwortlichen Genkassette beruhen. Dieses sogenannte

„staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec)“ enthält neben der Methicillin- Resistenzdeterminante mecA auch Rekombinase-Gene und regulatorische Elemente, sowie in variablem Maße weitere Gene, über die eine Einteilung in verschiedene SCCmec-Typen vorgenommen werden kann (MONECKE et al. 2011). Die neun untersuchten MRSA-Isolate trugen SCCmec-Elemente der Typen IV oder V. Ein Isolat konnte anhand der Mikroarray- Ergebnisse keinem definierten Typ zugeordnet werden. SCCmec IV und V kommen sowohl bei CA-MRSA als auch bei Nutztier-assoziierten MRSA vor und sind auch bei Isolaten aus Fleischprodukten am häufigsten vorzufinden (FESSLER et al. 2011; MONECKE et al. 2011;

VOSSENKUHL et al. 2014). Im Gegensatz dazu tragen HA-MRSA typischerweise SCCmec- Elemente der Typen I, II oder III (MONECKE et al. 2011). Entsprechend ist davon auszugehen, dass es sich bei den untersuchten Isolaten um CA-MRSA oder Nutztier- assoziierte MRSA handelte.

Eine weitere Möglichkeit der MRSA-Typisierung besteht in der Analyse direkter Sequenzwiederholungen (direkt repeat units, dru) in der Umgebung des SCCmec-Elements.

Dies bietet eine zusätzliche Differenzierungsmöglichkeit für MRSA-Isolate, die sich nicht durch andere Typisierungsverfahren unterscheiden lassen (GOERING et al. 2008). Unter den neun MRSA aus illegal importiertem Fleisch wurde am häufigsten der dru-Typ dt10a nachgewiesen. Dabei handelt es sich um einen international weit verbreiteten dru-Typ und es wird angenommen, dass es sich dabei um den Ausgangstyp handelt, aus dem sich die anderen Typen entwickelt haben (BARTELS et al. 2013). Bei drei Isolaten konnten jedoch auch neue dru-Typen ermittelt werden. Zwei dieser Isolate wiesen dabei den gleichen neuen dru-Typ, dt11dc auf, während das dritte Isolat dem dru-Typ dt10dg zugeordnet wurde.

Eine Feintypisierung aller Isolate erfolgte zudem über eine Makrorestriktionsanalyse mit dem Enzym SmaI und anschließender PFGE. Die Ergebnisse zeigten eine gute Korrelation mit jenen der spa-Typisierung und der Mikroarray-Analyse (s. auch Fig. 1, Publikation 1). Isolate

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mit identischen Bandenmustern gehörten jeweils zum gleichen klonalen Komplex und spa- Typ. Unter den Isolaten des CC1 und CC5 konnte eine Clusterbildung beobachtet werden, bei der sich jeweils die MRSA- und MSSA-Isolate deutlich voneinander unterschieden.

Insgesamt konnte eine deutliche genetische Heterogenität unter den Isolaten beobachtet werden. Eine typische Eigenschaft von CC398-Isolaten ist eine Methylierung der SmaI- Schnittstellen wodurch sie nicht mittels SmaI-PFGE typisiert werden können (BOSCH et al.

2010). In einer niederländischen Studie wurden CC398-Isolate stattdessen mittels Cfr9I- PFGE typisiert, wobei sich insgesamt eine recht hohe Ähnlichkeit der Isolate zeigte (BOSCH et al. 2010). Da im Rahmen dieser Arbeit keine CC398-Isolate nachgewiesen wurden, konnte die PFGE-Analyse jedoch nach dem etablierten HARMONY-Protokoll mit SmaI-Verdau erfolgen (COOKSON et al. 2007).

Um weitere Rückschlüsse auf die mögliche Quelle der untersuchten Isolate zu ziehen, wurden sie auf das Vorhandensein von Genen des sogenannten „Immune Evasion Clusters (IEC)“

getestet. Das IEC enthält verschiedene Virulenz-assoziierte Gene, darunter das Gen scn, welches für ein Komplement-inhibierendes Protein codiert, sowie variable Kombinationen der Gene chp (codiert einen Chemotaxis-Inhibitor), sea (Staphylokokken-Enterotoxin A) und sak (Staphylokinase). Unter human-adaptierten S. aureus ist das IEC weit verbreitet, während es nur selten bei Isolaten tierischen Ursprungs vorkommt (VERKAIK et al. 2011; HAU et al.

2015). Von den untersuchten Isolaten wiesen insgesamt 16 der 23 Isolate, darunter alle MRSA, mindestens zwei Gene des IEC auf. Demnach gehört ein Großteil der Isolate zu klonalen Linien, die häufig beim Menschen vorkommen. Dies deutet auf eine Kontamination durch Personen im Laufe der Verarbeitung oder des Transportes hin. Viele der MSSA sowie alle MRSA wurden aus illegal importiertem Fleisch isoliert, wo mangelhafte hygienische Bedingungen beim Umgang mit den Produkten keine Seltenheit sind (FALK et al. 2013).

Jedoch wurden auch bei drei der sechs Isolate aus legalen Proben Gene des IEC nachgewiesen.

Des Weiteren erfolgte ein Nachweis bestimmter mobiler genetischer Elemente, die mit einer Adaptation von S. aureus an Geflügel in Verbindung gebracht wurden (LOWDER et al.

2009). Bei einem MSSA-Isolat aus legal importiertem Geflügelfleisch konnte der β- konvertierende Phage φAvβ sowie das Plasmid pAvX nachgewiesen werden, was auf einen

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aviären Ursprung dieses Isolats hindeutet. Ein weiteres CC5-Isolat beherbergte das Plasmid pAvY, jedoch stammte dieses Isolat aus Schweinefleisch und trug zudem Gene des IEC.

Möglicherweise kommt pAvY somit auch bei Stämmen vor, die nicht Geflügel-assoziiert sind. Bei den übrigen Isolaten konnten keine der von Lowder et al. beschriebenen Geflügel- assoziierten mobilen genetischen Elemente nachgewiesen werden.

3.3.2 ESBL-/AmpC-produzierende Escherichia coli

Die komplexe Populationsstruktur von E. coli ist durch intensiven horizontalen Gentransfer geprägt und zeichnet sich durch eine große genetische Vielfalt innerhalb der Spezies aus, was auf die hohe Anpassungsfähigkeit von E. coli an verschiedene Habitate zurückgeführt wird (SELBITZ et al. 2011; CHANDRAN u. MAZUMDER 2015). Phylogenetische Analysen zeigten jedoch, dass bei E. coli vier große phylogenetische Hauptgruppen unterschieden werden können (A, B1, B2, D) (CLERMONT et al. 2000). Eine Gruppenzuordnung von Isolaten kann dabei mittels PCR-Nachweis der An- bzw. Abwesenheit von drei Genen bzw.

DNA-Abschnitten erfolgen: (i) chuA, welches für einen Häm-Transporter codiert und einen Virulenzfaktor darstellt, (ii) yjaA, dessen Genprodukt vermeintlich an der zellulären Antwort auf verschiedene Stressoren sowie an der Biofilmbildung beteiligt ist, und (iii) TSPE4.C2, ein DNA-Fragment mit unbekannter Funktion (CLERMONT et al. 2000; LEE et al. 2010).

Klinische Isolate vom Menschen sind zumeist chuA-positiv und gehören demnach vorwiegend zur Gruppe B2, gefolgt von Gruppe D. Bei der gesunden Bevölkerung hingegen werden häufiger Stämme der Gruppe A nachgewiesen, welche vorwiegend kommensale E.

coli umfasst (VALENTIN et al. 2014; CLERMONT et al. 2016). Auch Isolate tierischer Herkunft gehören häufig zur Gruppe A oder zur Gruppe B1 (VALENTIN et al. 2014).

Unter den untersuchten Isolaten aus legal und illegal importierten Fleischwaren konnten alle vier phylogenetischen Hauptgruppen nachgewiesen werden. Am häufigsten war Gruppe D vertreten, der die Hälfte aller Isolate angehörte, gefolgt von Gruppe B1. Gruppe A und Gruppe B2 waren weniger häufig vertreten. Die hohe Anzahl von Isolaten aus Gruppe D weist auf eine mögliche Pathogenität dieser Isolate für den Menschen hin, während es sich bei nur vergleichsweise wenigen Isolaten um präsumtiv kommensale Stämme handelte. Auf die

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gezielte Überprüfung der Virulenzeigenschaften der Isolate wird in Kapitel 3.5.2 eingegangen. Für die weitere Differenzierung der Isolate wurden ergänzend zu der allgemeinen Einteilung anhand ihrer phylogenetischen Gruppen weitere Typisierungsverfahren verwendet.

Eine schon seit langer Zeit verwendete Methode zur phänotypischen Charakterisierung von E. coli ist die Bestimmung des Serotyps. Neben der aufwendigen und kostenintensiven Serotypisierung über den Nachweis der Oberflächenantigene mittels Agglutinationstests gibt es mittlerweile auch DNA-basierte Verfahren, die eine präzise Vorhersage des Serotyps ermöglichen (FRATAMICO et al. 2016). Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Mikroarray-Analyse ermöglichte ebenfalls eine Bestimmung der O- und H-Antigene über den Nachweis entsprechender Gene bzw. Genvarianten (BALLMER et al. 2007). Dabei zeigte sich, dass eines der Isolate zum Serotyp O157:H4 gehörte. Die Serogruppe O157 ist bekannt für ihre Assoziation mit Shiga-Toxin-produzierenden E. coli-Stämmen (STEC). Der überwiegende Teil aller STEC-Infektionen des Menschen werden von E. coli dieser Serogruppe hervorgerufen, besonders von dem prominenten Serotyp O157:H7 (RAHAL et al.

2012; EFSA u. ECDC 2017). Auch O157:H4-E.coli produzieren mitunter Shiga-Toxine. In einer Studie aus Süddeutschland gehörten STEC aus kleinen Wiederkäuern am zweithäufigsten zu diesem Serotyp (SCHILLING et al. 2012). Bei dem Isolat, das im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde, konnte jedoch weder das Gen stx1 noch stx2 nachgewiesen werden und es handelte sich somit nicht um ein STEC-Isolat (s. auch Kapitel 3.5.2).

Auch für E. coli stellt die MLST eine weit verbreitete und aussagekräftige, sequenzbasierte Typisierungsmethode dar, die im Rahmen dieser Studie für die Typisierung aller Isolate verwendet wurde (TARTOF et al. 2005). Dabei wurde eine Vielzahl verschiedener Sequenztypen unter den Isolaten in dieser Arbeit identifiziert. Am häufigsten waren ST101 und ST117 vertreten, mit jeweils drei Isolaten. ST117 wird regelmäßig mit geflügelpathogenen Stämmen („avian pathogenic E. coli“, APEC) in Verbindung gebracht, jedoch gehören auch klinische Isolate aus der Humanmedizin sowie Isolate von anderen Tieren diesem Sequenztyp an (MALUTA et al. 2014; S. W. KIM et al. 2017). In einer brasilianischen Studie gehörten E. coli, die aus an Osteomyelitis oder Arthritis erkrankten

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Masthühnern isoliert wurden, am häufigsten diesem Sequenztyp an (BRAGA et al. 2016). In einer weiteren Studie von Day und Kollegen wurden E.coli von Menschen, Tieren und Lebensmitteln untersucht. Dabei wurden bei Geflügel und Geflügelfleisch neben ST117 besonders häufig auch ST88 und ST10 nachgewiesen (DAY et al. 2016). Diese beiden Sequenztypen wurden im Rahmen der aktuellen Arbeit jedoch nicht nachgewiesen.

Ein einzelnes der in dieser Arbeit untersuchten Isolate gehörte zum ST131, welcher sich weltweit zu einem dominanten ExPEC-Sequenztyp entwickelt hat und zu dem viele Stämme mit hoher klinischer Relevanz gehören (H. KIM et al. 2017; PITOUT u. DEVINNEY 2017).

Vier Isolate konnten keinem beschriebenen Sequenztyp zugeordnet werden. Für die Zuteilung der Sequenztypen in der Datenbank (http://enterobase.warwick.ac.uk/) wurden diese Isolate einer Ganzgenomsequenzierung unterzogen. Zwei Isolate aus illegal importiertem Fleisch gehörten zu demselben neu definierten Sequenztyp, sodass insgesamt drei neue Typen ermittelt wurden.

Des Weiteren erfolgte eine Feintypisierung aller Isolate mittels Makrorestriktionsanalyse und PFGE. Für E. coli wurde dabei das für diese Spezies geeignete Restriktionsenzym XbaI verwendet. Auch mit diesem Verfahren zeigte sich eine deutliche genetische Diversität unter den Isolaten. Sie zeigten zum überwiegenden Teil nur etwa 40% - 70% Übereinstimmung der Bandenmuster mit dem jeweils ähnlichsten Isolat. Einzelne Isolate zeigten jedoch auch identische Bandenmuster, was auf eine sehr enge Verwandtschaft hindeutet.

Insertionen oder Deletionen mobiler genetischer Elemente sowie größere Rekombinations- ereignisse innerhalb der chromosomalen DNA können zu Veränderungen von PFGE- Bandenmustern führen (NEMOY et al. 2005; SABAT et al. 2013). Die bereits am Anfang des Kapitels erwähnte genetische Diversität von E. coli und die hohe Frequenz horizontaler Gentransferprozesse fördern somit eine besonders große Variabilität der PFGE-Ergebnisse bei dieser Spezies. Entsprechend beschreiben auch andere Studien eine deutliche Heterogenität der Bandenmuster von Isolaten außerhalb von Ausbruchsgeschehen (BERGERON et al.

2012; OLSEN et al. 2014).

Eine vollständige Übersicht der Sequenztypen, Makrorestriktionsprofile und der phylogenetischen Gruppenzugehörigkeit aller Isolate ist Fig. 1 aus Publikation 2 zu entnehmen.