Anja Müller, Wiebke Jansen, Nils Th. Grabowski, Corinna Kehrenberg (2018):
Characterization of Salmonella enterica serovars recovered from meat products legally and illegally imported into the EU reveals the presence of multiresistant and AmpC-producing isolates.
Gut Pathogens, 10, 40. https://doi.org/10.1186/s13099-018-0268-3
Autorenbeteiligung:
Idee und Konzeption: CK, AM, WJ, NG
Durchführung der Experimente: AM
Auswertung der Daten: AM, CK
Erstellung des Manuskripts oder
kritische Durchsicht: AM, CK, WJ, NG
Publikationen 15
Characterization of Salmonella enterica serovars recovered from meat products legally and illegally imported into the EU reveals the presence of
multiresistant and AmpC-producing isolates
Anja Müller1, Wiebke Jansen1,2, Nils Th. Grabowski1 and Corinna Kehrenberg1*
1Institute of Food Quality and Food Safety, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Bischofsholer Damm 15, 30173 Hannover, Germany
2Integrated Veterinary Research Unit, University of Namur, rue de Bruxelles 61, B-5000 Namur, Belgium
Keywords: AmpC-β-lactamase, antimicrobial resistance, legal import, illegal import, meat products, Salmonella enterica
*Corresponding author
E-Mail: corinna.kehrenberg@tiho-hannover.de
Abstract
Background
Food products of animal origin brought into the EU from third countries, both legally and illegally, can harbor foodborne pathogens such as Salmonella enterica. In this study, we examined five S. enterica isolates recovered either from legally imported chicken meat (n = 3) or from meat products confiscated from air travel passengers arriving in Germany (n = 2). The isolates were serotyped and further characterized by antimicrobial susceptibility testing, PCR-detection and sequencing of genes associated with antimicrobial resistances, and macrorestriction analysis. Transferability of resistance to third-generation cephalosporins was assessed by conjugation experiments and the plasmids tested for their incompatibility groups.
Results
The three isolates from legal imports were identified as S. Heidelberg or as non-flagellated.
All three isolates were identified as AmpC producers carrying blaCMY-2 and as non-susceptible to ciprofloxacin. They were additionally resistant to tetracycline and sulfamethoxazole. The blaCMY-2-carrying plasmids were transferable by conjugation and belonged to incompatibility groups IncI1 or IncA/C. The two isolates from illegally imported meat belonged to the serovars Infantis or Weltevreden. The former was phenotypically resistant to five classes of antimicrobial agents while the S. Weltevreden isolate was fully susceptible to all agents tested.
Conclusion
The results of this study demonstrate that meat products imported from third countries, both legally and illegally, can harbor multiresistant Salmonella enterica. Consequently, these imports could constitute a source for the dissemination of antimicrobial resistant isolates, including those resistant to third-generation cephalosporins and fluoroquinolones.
Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion 17
Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion 3.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden bakterielle Lebensmittelinfektions- bzw. -intoxikations-erreger untersucht, die aus legal und illegal aus Drittländern eingeführten Fleischwaren isoliert wurden. Dabei wurden Isolate der Spezies Staphylococcus aureus, Escherichia coli und Salmonella enterica mittels mikrobiologischer und molekularbiologischer Methoden hinsichtlich ihrer phänotypischen und genotypischen Charakteristika untersucht. Die ermittelten Daten liefern detaillierte Informationen über die Eigenschaften von Isolaten, die über den internationalen Handel und die illegale Einfuhr von Fleisch und Fleischprodukten aus Drittländern nach Deutschland gelangen. Dies soll dabei helfen zu überprüfen, ob solche Produkte ein mögliches Reservoir für resistente und/oder besonders virulente Stämme der untersuchten Bakterienspezies darstellen.
3.1 Importierte Fleischprodukte als mögliche Vektoren für Zoonoseerreger
3.1.1 Gesetzliche Grundlagen für die legale Einfuhr von Fleischprodukten
Um ein möglichst hohes Niveau der Lebensmittelsicherheit zu erreichen müssen Lebensmittel, die innerhalb der Europäischen Union vermarktet werden, eine Reihe rechtlicher Anforderungen erfüllen. Die allgemeinen Grundsätze zur Lebensmittelsicherheit und dem Verbraucherschutz wurden in der Verordnung (EG) Nr. 178/2002 des Europäischen Parlaments und des Rates festgelegt. Diese sogenannte „Basisverordnung“ wird durch weitere Verordnungen und Richtlinien ergänzt bzw. konkretisiert. Dabei sind besonders die Verordnungen (EG) Nr. 852/2004, 853/2004, 854/2004 und 2073/2005 zu nennen, die auch als „EU-Hygienepaket“ bezeichnet werden. Diese beinhalten Vorgaben zu allgemeinen und spezifischen Hygienevorschriften für Lebensmittel tierischen Ursprungs sowie deren Überwachung. In Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 über mikrobiologische Kriterien für Lebensmittel sind zudem spezifische Grenzwerte für verschiedene Produktkategorien festgelegt, welche neben verschiedenen Mikroorganismen auch von ihnen gebildete Toxine
und schädliche Metabolite umfassen. Mit dem allgemeinen Geltungsbeginn der umfangreichen Verordnung (EU) 2017/625, auch als EU-Kontroll-Verordnung bezeichnet, werden ab Dezember 2019 verschiedene derzeit gültige Verordnungen aufgehoben bzw.
ersetzt, darunter auch Verordnung (EG) 854/2004. Ziel ist die Bündelung verschiedener Rechtsvorschriften in einem Rechtsakt, eine engere Zusammenarbeit der EU-Mitgliedsstaaten sowie die Harmonisierung und Optimierung der amtlichen Kontrollen.
Für importierte Lebensmittel gelten grundsätzlich die gleichen Mindestanforderungen wie für Produkte aus dem Binnenmarkt. Laut Verordnung (EG) Nr. 854/2004 ist der Import von Lebensmitteln tierischen Ursprungs nur aus Drittländern vorgesehen, deren zuständige Behörden angemessene Garantien für die Einhaltung dieser Anforderungen bieten.
Zugelassene Länder bzw. Regionen innerhalb eines Drittlandes werden in entsprechenden Positivlisten aufgeführt. Zusätzlich wurden an den EU-Außengrenzen Grenzkontrollstellen eingerichtet, an denen sämtliche Warensendungen aus diesen Drittstaaten einer Einfuhrkontrolle durch die zuständigen Behörden unterzogen werden. Im Wesentlichen beschränken sich diese Kontrollen auf eine Dokumentenprüfung sowie eine stichprobenartige Nämlichkeitskontrolle der Warenlieferungen. Nur ein Teil wird physischen Kontrollen unterzogen. Laut Entscheidung 94/360/EG ist dabei für Schweinefleisch eine Kontrollhäufigkeit von mindestens 20% und bei Geflügelfleisch eine Kontrolle von mindestens 50% aller Warensendungen vorgeschrieben. Weiterführende Laboruntersuchungen erfolgen entweder im Verdachtsfall oder risikoorientiert, als Planproben im Rahmen des mehrjährigen nationalen Kontrollplans, basierend auf Verordnung (EG) Nr. 882/2004. Warenlieferungen, welche die entsprechenden Anforderungen nicht erfüllen, werden an der EU-Außengrenze zurückgewiesen. In den vergangenen Jahren kam es angesichts des steigenden Importvolumens vermehrt zu solchen Grenzzurückweisungen durch die europäischen Grenzkontrollstellen, häufig aufgrund einer Kontamination mit pathogenen Mikroorgansimen (JANSEN et al. 2016a; EC 2017).
Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion 19
3.1.2 Mikrobiologische Beschaffenheit legaler Importe
Meldungen über Missstände in exportierenden Ländern können den Verbraucher verunsichern. Ein aktuelles Beispiel stellen die polizeilichen Ermittlungen im brasilianischen Fleischsektor dar, welche auch Exportbetriebe mit EU-Zulassung betrafen (EC 2017). Die im Rahmen von Publikation 3 untersuchten Proben von importiertem frischen Schweine- und Geflügelfleisch, darunter auch ein großer Anteil von Geflügelfleisch aus Brasilien, waren jedoch im Hinblick auf mikrobiologische Lebensmittelsicherheits- und –qualitätskriterien zum überwiegenden Teil als unbedenklich anzusehen. Neben den in Verordnung (EG) Nr.
2073/2005 festgelegten Kriterien wurden zur Bewertung der erhobenen Daten auch die Richt- und Warnwerte der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM) herangezogen. Diese rechtlich nicht bindenden Empfehlungen bieten ergänzend zu Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 eine Orientierung über die Art und Anzahl von Mikroorganismen, die auf einem bestimmten Produkt zu erwarten sind (Richtwert) bzw. noch akzeptabel sind (Warnwert) (DGHM 2018). Sie umfassen Werte für verschiedene Hygieneindikatoren wie Enterobakterien und die aerobe mesophile Keimzahl, sowie für pathogene Mikroorgansimen, die eine Gefährdung für die Verbrauchergesundheit darstellen, beispielsweise Salmonella spp. und Listerien.
Von den untersuchten Proben von legalen Importen überschritt keine der 498 Geflügelfleisch- und 136 Schweinefiletproben die Warnwerte für Enterobacteriaceae, E. coli oder die aerobe mesophile Keimzahl. Lediglich eine Geflügel- und zehn Schweinefiletproben überschritten den Warnwert von 3,7 log10 koloniebildenden Einheiten pro Gramm (KbE/g) für Staphylokokken. Eine Überschreitung der Richtwerte (jedoch ohne Überschreitung der Warnwerte) wurde hingegen bei einigen Proben festgestellt und war häufiger bei Schweinefleischproben zu beobachten als bei Geflügelfleisch. Dies betraf besonders die Richtwerte für Enterobacteriaceae, E. coli und Staphylokokken, die von 9,6%, 7,4% bzw.
13,4% der Schweinefleischproben überschritten wurden, wohingegen dies bei jeweils weniger als 1% der Geflügelfleischproben der Fall war. Allgemein lagen die ermittelten Keimzahlen jedoch zumeist weit unterhalb der jeweiligen Richtwerte, was auf eine gute Prozesshygiene und angemessene Transportbedingungen schließen lässt.
Die qualitative Bestimmung von Lebensmittelsicherheitskriterien ergab, dass 1,2% der Geflügelfleischproben aufgrund des Nachweises von Salmonella spp. als inakzeptabel anzusehen waren. Aus den Schweinefleischproben hingegen wurden keine Salmonellen isoliert. Ebenso konnten weder Yersinia enterocolitica noch Campylobacter spp. in den untersuchten Schweine- bzw. Geflügelfleischproben nachgewiesen werden. S. aureus konnte qualitativ bei 10,3% der Schweinefleisch- und 16% der Geflügelfleischproben nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu werden in Geflügelfleisch innerhalb der EU wesentlich höhere Prävalenzen von Salmonella spp., Campylobacter spp. und S. aureus ermittelt. Eine aktuelle Meta-Analyse von Gonçalves-Tenório und Kollegen zeigt, dass im Mittel etwa 38,5% des europäischen Geflügelfleischs S. aureus beherbergt, 33,3% positiv für Campylobacter spp. ist und auf 7,1% Salmonella spp. nachgewiesen werden können (GONÇALVES-TENÓRIO et al. 2018). Auch die EFSA und das ECDC berichten von sehr ähnlichen Prävalenzen von Campylobacter spp. uns Salmonella spp. auf Hähnchenfleisch (EFSA u. ECDC 2017).
Die Proben von legal eingeführtem Geflügel- und Schweinefleisch wurden zudem auf die Anwesenheit von MRSA und ESBL-/AmpC-bildenden E. coli untersucht. MRSA konnten dabei in keiner Probe bestätigt werden. Insgesamt 6,4% der Geflügelfleischproben, sowie eine einzelne Schweinefleischprobe, beherbergten ESBL-/AmpC-bildende E. coli. Diese Werte liegen ebenfalls unter den in der EU ermittelten. Nach Angaben der EFSA und des ECDC können in etwa 60% der europäischen Geflügelfleischproben ESBL-/AmpC-Bildner nachgewiesen werden (EFSA u. ECDC 2018). Auch südamerikanisches Geflügelfleisch weist in der Literatur höhere Raten an ESBL-/AmpC-Bildnern auf (CANTÓN et al. 2008;
EGERVÄRN et al. 2014; KOGA et al. 2015). In einer Studie von Egervärn und Kollegen wurden sogar in 95% der untersuchten Proben von Geflügelfleisch aus Brasilien ESBL-/AmpC-Bildner nachgewiesen (EGERVÄRN et al. 2014). Laut einer aktuellen Meta-Analyse liegt die gepoolte Prävalenz von MRSA auf Geflügelfleisch in Südamerika bei etwa 27%
(RIBEIRO et al. 2018).
Möglicherweise hatte die Tatsache, dass die untersuchten Proben von legal importiertem Schweine- und Geflügelfleisch bis zur mikrobiologischen Untersuchung gefroren gelagert wurden, einen Einfluss auf den Erregernachweis. Auch Gonçalves-Tenório und Kollegen stellten fest, dass das Einfrieren von Geflügelfleisch die Nachweisrate von Campylobacter spp. stark reduziert, während für andere bakterielle Spezies nicht genügend Daten für eine
Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion 21
Ableitung des Einflusses einer Gefrierbehandlung vorhanden waren (GONÇALVES-TENÓRIO et al. 2018). Des Weiteren können methodische Unterschiede der Anzuchtverfahren, beispielsweise die Verwendung anderer Selektivmedien oder unterschiedliche Vorgehensweisen hinsichtlich einer Voranreicherung, mitunter die Nachweisraten beeinflussen (SAFDAR et al. 2003; JAZMATI et al. 2016).
3.1.3 Illegal eingeführte Fleischprodukte
Auch Privatpersonen können zum unerwünschten Import kontaminierter Lebensmittel tierischen Ursprungs beitragen. Die private Einfuhr von Fleischwaren aus Drittländern ist laut Verordnung (EG) Nr. 206/2009 grundsätzlich verboten. Diesbezüglich gibt es nur wenige Ausnahmen, beispielsweise für gewisse Mengen bei Anreise aus Island, Grönland oder den Färöern. Dennoch werden Fleisch und Fleischprodukte im Rahmen des internationalen Reiseverkehrs in nicht unerheblichen Mengen auch aus anderen Ländern illegal im Reisegepäck mitgeführt (JANSEN et al. 2016b). Die Internationale Luftverkehrs-Vereinigung (International Air Transport Association, IATA) verzeichnet seit Jahren stetig ansteigende Passagierzahlen und schätzt eine ungefähre Verdopplung der derzeitigen jährlichen Zahl an Flugreisenden auf bis zu 7,8 Milliarden Personen bis zum Jahr 2036 (IATA 2017, 2018).
Entsprechend ist auch ein Anstieg der illegal im Reisegepäck mitgeführten Lebensmittel tierischen Ursprungs zu erwarten. Bereits in den Jahren 2010 und 2011 wurden allein an den Flughäfen Berlin Schönefeld und Frankfurt am Main zusammen etwa 11 Tonnen Fleischprodukte pro Jahr durch die zuständigen Behörden konfisziert (JANSEN et al. 2016b).
Da nicht alle Reisenden kontrolliert werden können, liegt die Dunkelziffer der Fleischprodukte, die auf diesem Weg eingeführt werden, vermutlich wesentlich höher (JANSEN et al. 2015). Meist werden vergleichsweise kleine Mengen dieser Produkte illegal eigenführt und sie sind häufig für den Eigenverzehr bestimmt, sodass vermutlich keine nennenswerte Verteilung in der Bevölkerung stattfindet. Jedoch sind sie unter unbekannten Produktionsbedingungen hergestellt sowie unter teils problematischen hygienischen Bedingungen transportiert worden und sind somit aus lebensmittelhygienischer Sicht als besonders kritisch anzusehen (FALK et al. 2013). Da über die Eigenschaften von
Bakterienisolaten auf illegal im Reisegepäck mitgeführten Fleischprodukten bisher nur sehr wenig bekannt ist, wurden auch solche Isolate im Rahmen dieser Arbeit weitergehend untersucht. Die Isolate wurden aus illegal eingeführten Fleischprodukten gewonnen, welche im Rahmen von Routinekontrollen an den Flughäfen Berlin Schönefeld und Frankfurt/Main von Flugreisenden konfisziert wurden. Die Isolation erfolgte mittels der gleichen Methodik, wie bei den legalen Proben. MRSA konnten dabei aus 6% der untersuchten Proben isoliert werden. In zwei spanischen Studien wurden in jeweils 3% der untersuchten illegal importierten Lebensmittel tierischen Ursprungs MRSA nachgewiesen (RODRÍGUEZ-LÁZARO et al. 2015b, 2017).
ESBL-/AmpC-bildende E. coli konnten aus drei der 126 Proben (2,3%) von illegal eingeführtem Geflügelfleisch nachgewiesen werden, wohingegen alle 171 untersuchten Schweinefleischprodukte negativ waren. In einer Studie von Nagy et al. wurden im Rahmen der Resistenztestung von vermeintlich kommensalen E. coli unter 113 untersuchten Isolaten aus illegal in die EU eingeführten Lebensmitteln tierischen Ursprungs zwei ESBL-Bildner identifiziert, ein gezielter Nachweis des entsprechenden Resistenzphänotyps erfolgte jedoch nicht (NAGY et al. 2015).
Salmonella enterica-Isolate wurden aus zwei untersuchten Proben gewonnen. In der Literatur sind unterschiedliche Nachweisraten von Salmonellen auf illegal in die EU eingeführten Lebensmitteln beschrieben. Zwei Studien berichten von einer sehr geringen Nachweisrate von jeweils etwa 1%, während die Autoren einer Studie aus Spanien in 5,5% der untersuchten Proben Salmonellen nachweisen konnten (RODRÍGUEZ-LÁZARO et al. 2014; BEUTLICH et al. 2015; SCHODER et al. 2015).
Für die Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit standen somit neben den Isolaten aus legal importierten Fleischwaren zusätzlich insgesamt 17 S. aureus (davon neun präsumtive
MRSA), drei ESBL-/AmpC-bildende E. coli und zwei Salmonella enterica-Isolate aus illegal importierten Fleischprodukten zur Verfügung.
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