Virulenzeigenschaften und Nachweis Virulenz-assoziierter Gene

Alle drei untersuchten Spezies haben eine hohe klinische Relevanz und können sowohl Lebensmittelinfektionen bzw. –intoxikationen hervorrufen, als auch zum Teil schwere systemische Erkrankungen (JOHLER u. STEPHAN 2010; SELBITZ et al. 2011; ALLOCATI et al. 2013; CHEN et al. 2013). Einzelne Stämme unterscheiden sich jedoch mitunter erheblich hinsichtlich ihrer Virulenz. Um das pathogene Potential der ESBL-/AmpC-bildenden E. coli und S. aureus-Isolate zu ermitteln wurden diese Isolate daher mittels PCR und Mikroarray-Analyse auf das Vorhandensein bedeutsamer Virulenz-assoziierter Gene untersucht. Die Ergebnisse werden in den folgenden Kapiteln dargestellt und diskutiert.

3.5.1 Staphylococcus aureus

S. aureus-Stämme unterscheiden sich deutlich in ihrer Virulenz. Einige Stämme sind in der Lage Lebensmittelintoxikationen hervorzurufen, welche sich besonders durch Bauchkrämpfe, Übelkeit und Erbrechen auszeichnen (KADARIYA et al. 2014). Diese Stämme produzieren Staphylokokken-Enterotoxine (SE) mit potenter emetischer Aktivität, die eine hohe Tenazität gegenüber verschiedenen Stressoren besitzen. Toxine, deren emetische Aktivität nicht bewiesen wurde bzw. nicht vorhanden ist, werden auch als „staphyloccocal enterotoxin-like superantigens (SEl)“ bezeichnet (ARGUDÍN et al. 2010). SEA ist das Enterotoxin, welches am häufigsten mit Ausbrüchen von Lebensmittelintoxikationen in Verbindung gebracht wird, gefolgt von SED und SEB (ARGUDÍN et al. 2010; JOHLER u. STEPHAN 2010). Das entsprechende Gen, sea, konnte auch im Rahmen dieser Arbeit bei zwei Isolaten nachgewiesen werden. Beide Isolate trugen zudem Gene für weitere SEs bzw. SEls in Form von seh, sek und seq. Insgesamt wurde bei 15 der 23 Isolate mindestens ein Gen für ein SE bzw. SEl nachgewiesen (s. auch Fig. 1 Publikation 1). Neben ihrer gastrointestinalen Wirkung gehören SEs zu den pyrogenen Superantigen und können durch eine unspezifische Aktivierung antigenrepräsentierender Zellen eine Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren auslösen (ARGUDÍN et al. 2010; JOHLER u. STEPHAN 2010). Ein weiteres bedeutendes Toxin aus dieser Gruppe der Staphylokokken-Superantigene ist das Toxic Shock

Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion 49

Syndrome Toxin-1. Durch die massive Ausschüttung von Zytokinen können Superantigene Multisystemerkrankungen mit hohem Fieber, Schockzuständen und Multiorganversagen verursachen, welche mitunter tödlich verlaufen (JOHLER u. STEPHAN 2010). Im Rahmen dieser Arbeit konnte das Gen tst1, welches für das Toxic Shock Syndrome Toxin-1 codiert, bei zwei MSSA-Isolaten nachgewiesen werden. S. aureus des CC398, welche den überwiegenden Teil der Isolate auf Geflügelfleisch in Deutschland und der EU ausmachen, tragen typischerweise keine Gene für SEs und sind negativ für tst1 (FESSLER et al. 2011;

MONECKE et al. 2011; EL-ADAWY et al. 2016).

Ein weiterer bedeutsamer Virulenzfaktor von S. aureus ist das Panton-Valentin Leukozidin (PVL). Die Produktion dieses leukotoxischen, porenbildenden Toxins wird mit dem Auftreten chronischer bzw. rekurrierender Haut- und Weichgewebsinfektionen sowie nekrotisierender Pneumonien in Verbindung gebracht – häufig auch bei jungen, zuvor gesunden Personen (MONECKE et al. 2011; SAEED et al. 2018). Im Rahmen dieser Arbeit wurden bei sechs der neun MRSA PVL-codierende Gene nachgewiesen. PVL-positive Stämme finden sich besonders unter verschiedenen erfolgreichen CA-MRSA-Linien, wohingegen Nutztier-assoziierte Stämme in der Regel PVL-negativ sind (MONECKE et al. 2011).

Dementsprechend sind in der EU auch S. aureus-Isolate aus Fleisch zum weitaus überwiegenden Teil PVL-negativ (FESSLER et al. 2011; EFSA u. ECDC 2018). Alle im Rahmen dieser Arbeit untersuchten PVL-positiven Isolate trugen zudem mindestens zwei Gene des Immune Evasion Clusters welche als charakteristisch für die Anpassung von S. aureus an den Menschen als Wirt angesehen werden (s. Kapitel 3.3.1). Durch ihre Beteiligung an der Immunevasion spielen sie ebenfalls eine Rolle als Virulenz-assoziierte Faktoren. Bei drei PVL-positiven Isolaten konnten zudem die Gene etD („exfoliative toxin D“) und edinB („epidermal cell differentiation inhibitor B“) nachgewiesen werden. Diese Gene sind gemeinsam auf einer Pathogenitätsinsel im Chromosom von S. aureus lokalisiert (BUKOWSKI et al. 2010). Die exfoliativen Toxine von S. aureus können beim Menschen das typische Bild des Staphylococcal-Scalded-Skin-Syndroms (SSSS) hervorrufen, bei dem es zu einer Blasenbildung und Ablösung von Hautarealen kommt, was den Folgen einer Verbrühung ähnelt (SELBITZ et al. 2011). Dies wird jedoch häufiger auf die Produktion der exfoliativen Toxine A und B zurückgeführt, während das exfoliative Toxin D besonders oft

mit der Bildung dermaler Abszesse und Furunkeln in Verbindung gebracht wird (BUKOWSKI et al. 2010). Das gemeinsame Vorkommen von PVL und etD ist typisch für CA-MRSA des CC80, zu dem auch die drei etD-positiven MRSA-Isolate aus illegal eingeführtem Geflügelfleisch gehörten.

Insgesamt konnten bei den untersuchten Isolaten verschiedene bedeutsame Virulenz-assoziierte Gene nachgewiesen werden. Besonders die MRSA-Isolate trugen zum Teil multiple Gene, welche für potente Virulenzfaktoren codieren. Der Nachweis von diversen Enterotoxin-codierenden Genen zeigt zudem, dass es sich bei vielen der Isolate um potentielle Erreger von Lebensmittelintoxikationen handelt.

3.5.2 ESBL-/AmpC-produzierende Escherichia coli

Bei E. coli gibt es besonders große Unterschiede bezüglich der Virulenz verschiedener Stämme. Es sind diverse Pathotypen beschrieben, welche meist umschriebene intra- oder extraintestinale Erkrankungsbilder hervorrufen (SELBITZ et al. 2011; CROXEN et al. 2013).

Bei vielen Stämmen handelt es sich jedoch um harmlose kommensale Bakterien, welche einen wichtigen Bestandteil des Darmmikrobioms warmblütiger Tiere darstellen (MORABITO 2014). Zahlreiche Studien haben die genetischen Hintergründe und spezifischen Virulenzfaktoren der E. coli Pathovare untersucht. Dabei zeigte sich, dass eine Zuordnung einzelner Isolate zu definierten Pathovaren auf molekularer Ebene komplex ist und oftmals nicht anhand einiger weniger Markergene erfolgen kann (CROXEN et al. 2013).

Besonders unter ExPEC besteht eine große Diversität der Virulenzgenmuster und die Einflüsse einzelner Gene auf die Virulenz eines Isolats sind mitunter unvollständig geklärt (MORA-RILLO et al. 2015). Bei den untersuchten Isolaten konnte jedoch eine Reihe verschiedener Virulenz- und Fitness-assoziierter Gene identifiziert werden, die mit ExPEC in Verbindung gebracht werden. Dies umfasste insbesondere Gene für Fimbrien in Form von lpfA und prfB/papB, sowie Gene für erhöhte Fitness durch Eisenakquisition (iroN, ireA, chuA) und erhöhte Serumresistenz (iss), von denen nahezu jedes Isolat mindestens eines trug (ANJUM et al. 2007). Mit 29 von 36 positiven Isolaten war iss das am häufigsten

Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion 51

nachgewiesene Virulenz-assoziierte Gen. Dieses Gen wird innerhalb der Gruppe der ExPEC besonders mit APEC in Verbindung gebracht, ebenso wie tsh, welches für einen Serin-Potease-Autotransporter codiert und bei 22 Isolaten nachgewiesen wurde (DELICATO et al.

2003; SELBITZ et al. 2011). In anderen Studien konnte gezeigt werden, dass zum Teil eine große Ähnlichkeit zwischen APEC-Isolaten auf Geflügelfleisch und humanen ExPEC besteht und kontaminiertes Geflügelfleisch somit eine Quelle für humanpathogene E. coli darstellen könnte (JOHNSON et al. 2009; KLUYTMANS et al. 2013).

Des Weiteren konnten unter den Isolaten Gene nachgewiesen werden, die mit intraintestinaler Pathogenität in Verbindung stehen. Besonders häufig wurde das Gen astA nachgewiesen, welches 16 der 36 Isolate trugen. Das hitzestabile EAST-1-Enterotoxin, für welches astA codiert, wurde erstmals bei enteroaggregativen E. coli beschrieben, jedoch wurden Varianten dieses Gens seither auch bei anderen Pathovaren nachgewiesen (MALUTA et al. 2017).

Ein Isolat gehörte zudem zur Gruppe der enteropathogenen E. coli (EPEC). Dieses Isolat trug das Gen eae, welches für den sekundären Adhäsionsfaktor Intimin codiert, sowie Gene für ein Typ-III-Sekretionssystem, das E. coli-sezernierte Protein A sowie einen Intimin-Rezeptor, der in die Wirtszelle sezerniert wird (SELBITZ et al. 2011). Diese Gene befinden sich, zusammen mit weiteren Virulenz-assoziierten Genen, auf einer Pathogenitätsinsel die auch als „Locus of Enterocyte Effacement (LEE)“ bezeichnet wird und für die Ausbildung der typischen Attaching-and-Effacing-Läsionen im Darmepithel benötigt wird (SELBITZ et al. 2011;

COMERY et al. 2013). Neben dem LEE besitzen typische EPEC auch ein Virulenzplasmid, welches für bündelförmige Pili codiert. Das entsprechende Gen, bfpA, war bei dem untersuchten EPEC-Isolat nicht vorhanden und es gehört somit zu den atypischen EPEC. Im Gegensatz zu typischen EPEC, bei denen der Mensch als Hauptreservoir angesehen wird, wurden atypische EPEC auch aus verschiedenen Nutz- und Haustieren isoliert, welche als mögliches Reservoir für die Übertragung dieser Erreger auf den Menschen gelten (HERNANDES et al. 2009). Keines der untersuchten Isolate trug Gene, die für Shiga-Toxine codieren.

Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass der überwiegende Teil der Isolate multiple Virulenz- und Fitness-assoziierte Gene trug. Besonders die Häufigkeit der Gene iss und tsh deuten auf einen großen Anteil von APEC unter den Isolaten hin.

3.5.3 Salmonella enterica

Bei Salmonella enterica subsp. enterica lässt sich über die Bestimmung des Serovars bereits ein gewisser Rückschluss auf die mögliche Virulenz für einen bestimmten Wirtsorganismus ziehen, wobei jedoch grundsätzlich jedes Serovar als potentiell humanpathogen anzusehen ist (HALD 2013; SKARŻYŃSKA et al. 2017). Einige, an bestimmte Tierarten angepasste Serovare, wie S. Dublin (Rind) oder S. Cholerasuis (Schwein), rufen nur in Einzelfällen Erkrankungen bei anderen Spezies wie dem Menschen hervor, welche dann jedoch häufig schwerwiegend sind (CRUMP et al. 2015). Die größte Bedeutung als Zoonoseerreger und Verursacher von Gastroenteritiden beim Menschen haben die nicht-wirtsadaptierten Serovare Enteritidis und Typhimurium. Besonders in Nordamerika ist auch S. Heidelberg ein häufiger Erreger humaner Salmonellosen, die im Vergleich zu Erkrankungen durch S. Enteritidis und S. Typhimurium häufiger invasiv verlaufen (FOLEY et al. 2013; CRUMP et al. 2015).

Aufgrund des vergleichsweise großen Anteils konservierter Virulenzgene und der Vielfalt der variablen Virulenzdeterminanten bei Salmonella enterica wurde im Rahmen dieser Arbeit auf einen Nachweis spezifischer Virulenzgene verzichtet.

In diesem Zusammenhang war jedoch interessant, dass eines der aus legal importierten Proben gewonnenen Isolate unbegeißelt war. Flagellen vermitteln nicht nur Motilität, sondern spielen auch eine Rolle bei der Adhäsion und Invasion von Wirtszellen (HORSTMANN et al.

2017). Im Mausmodell zeigten unbegeißelte S. Typhimurium-Mutanten jedoch keine signifikante Reduktion ihrer Virulenz im Vergleich zum Wildtyp (LOCKMAN u. CURTISS 1990). Weitere Versuche wären nötig, um die Virulenz des Isolats aus legal importiertem Geflügelfleisch zu bestimmen.

Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion 53

3.6 Schlussfolgerung

Die vorliegende Arbeit zeigt, dass aus Drittländern eingeführtes Fleisch und Fleischprodukte virulente und multiresistente S. aureus, E. coli und Salmonella enterica beherbergen können.

Viele der untersuchten Isolate zeigten ungewöhnliche oder in Europa derzeit wenig verbreitete Resistenzphänotypen oder –genotypen. Bei den untersuchten S. aureus und E. coli konnten zudem bedeutende Virulenz-assoziierte Gene nachgewiesen werden. Durch den Verzehr von unzureichend durchgegartem Fleisch oder in Folge einer Kreuzkontamination besteht die Möglichkeit einer Infektion oder Besiedlung von Personen mit diesen Stämmen.

Über horizontalen Gentransfer kann es in der Folge zu einer Weitergabe von Resistenzdeterminanten an kommensale oder pathogene Bakterien kommen.

Auch wenn die legalen Importe zum überwiegenden Teil den rechtlichen Vorgaben entsprechen und alle mikrobiologischen Kriterien erfüllen, können sie somit zur Verbreitung antimikrobieller Resistenzen beitragen. Der Nachweis von CA-MRSA auf illegal eingeführten Fleischprodukten deutet zudem darauf hin, dass unzureichende Hygiene bei der Herstellung oder dem Umgang mit diesen Lebensmitteln die Ausbreitung virulenter und resistenter, human-adaptierter Stämme fördern kann.

Trotz der begrenzten Anzahl der untersuchten Isolate demonstrieren die Ergebnisse somit, dass die legale sowie die illegale Einfuhr von Lebensmitteln zur Verbreitung von Zoonoseerregern und antimikrobiellen Resistenzen über weite Strecken beitragen können.

Eine weitere Überwachung dieser möglichen Transmissionswege ist somit wichtig, auch um zukünftige Entwicklungen zeitnah zu erkennen. Die Ergebnisse verdeutlichen zudem die Relevanz globaler Strategien und internationaler Kooperation im Hinblick auf die Eingrenzung antimikrobieller Resistenzen.

Zusammenfassung 55

Zusammenfassung 4.

Anja Müller

Molekulare Charakterisierung von Staphylococcus aureus, ESBL-/AmpC-bildenden Escherichia coli und Salmonella enterica aus legal und illegal aus Drittländern eingeführten Lebensmitteln

Jährlich werden in großem Umfang Fleisch und Fleischprodukte aus Drittländern in die EU eingeführt. Neben dem legalen Import werden auch nicht unerhebliche Mengen dieser Produkte illegal eingeführt, beispielsweise im Reisegepäck. Über kontaminiertes Fleisch könnte somit auch die globale Verbreitung von Zoonoseerregern und antimikrobiellen Resistenzen gefördert werden. Jedoch wurden bisher nur in wenigen Studien gezielt einzelne Isolate untersucht, die auf diesen Wegen nach Deutschland bzw. in die EU gelangen.

Besonders über Isolate, die sich auf illegal eingeführten Produkten befinden, gibt es bisher kaum Informationen. Daher erfolgte im Rahmen dieser Arbeit eine eingehende Charakteri-sierung von Zoonoseerregern, die aus legal und illegal importierten Fleischwaren gewonnen wurden, mit dem Ziel zu überprüfen, ob solche Produkte ein mögliches Reservoir für resistente und/oder besonders virulente Stämme der untersuchten Bakterienspezies darstellen.

Dabei wurden Isolate von drei klinisch relevanten Bakterienspezies untersucht, die eine wichtige Rolle als Erreger von Lebensmittelinfektionen bzw. –intoxikationen spielen und zudem systemische Erkrankungen hervorrufen können. Dies umfasste Methicillin-resistente (MRSA, n = 9) sowie Methicillin-sensible Staphylococcus aureus (MSSA, n = 14), AmpC- oder extended-spectrum β-Laktamase (ESBL)-produzierende Escherichia coli (n = 36) sowie Salmonella enterica (n = 5). Es erfolgte eine molekulare Typisierung der jeweiligen Isolate sowie eine eingehende Charakterisierung hinsichtlich ihres Resistenzphänotyps und -genotyps. Für S. aureus und E. coli-Isolate erfolgte zusätzlich ein spezifischer Nachweis Virulenz-assoziierter Gene. Dabei kamen für die jeweilige Spezies geeignete Methoden zum Einsatz. Diese umfassten antimikrobielle Empfindlichkeitstestungen, verschiedene Typisierungsverfahren, Mikroarray-Analysen, PCR-Assays, Ganzgenomsequenzierung, Sequenzanalysen einzelner Gene und Konjugations-Experimente.

Unter den 23 untersuchten S. aureus-Isolaten, darunter neun MRSA aus illegal eingeführten Fleischprodukten, wurden diverse Resistenzen nachgewiesen und 14 Isolate waren resistent gegenüber Wirkstoffen aus drei oder mehr Wirkstoffklassen. Zudem wurden teilweise ungewöhnliche Resistenzmuster beobachtet. So wiesen einige der S. aureus-Isolate, die keinen MRSA-Genotyp aufwiesen, eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Oxacillin auf. Bei einem weiteren S. aureus-Isolat wurde zudem eine ungewöhnliche Variante des Phenicol-Resistenzgens fexA identifiziert, welche lediglich eine Resistenz gegenüber Chloramphenicol vermittelt, jedoch nicht gegenüber Florfenicol.

Die molekulare Typisierung zeigte eine deutliche genetische Heterogenität unter den Isolaten.

Kein Isolat gehörte zu dem in der EU typischen Nutztier-assoziierten klonalen Komplex CC398. Stattdessen konnten viele der Isolate anhand der Ergebnisse der Erreger-Typisierung klonalen Linien zugeordnet werden, die häufig beim Menschen vorgefunden werden (sak-, chp-, scn-positive Isolate des CC1, CC5, CC80). Des Weiteren wurden teils bedeutende Virulenzdeterminanten nachgewiesen, darunter diverse Gene, die für Enterotoxine codieren, einschließlich sea und sed, sowie Gene für verschiedene weitere bedeutende Virulenzfaktoren wie das Panton-Valentin-Leukozidin, das Toxic Shock Syndrome Toxin-1 (tst1) und das exfoliative Toxin D (etD).

Es wurden zudem insgesamt 36 ESBL-/AmpC-bildende E. coli untersucht, darunter drei aus illegal importierten Fleischwaren. Die Bestimmung der β-Laktamasegene der 36 ESBL-/AmpC-bildenden E. coli zeigte, dass blaCTX-M-2 das häufigste ESBL-Gen unter den Isolaten war, gefolgt vom AmpC-β-Laktamasegen blaCMY-2 und blaCTX-M-8. Im Gegensatz dazu tragen ESBL-Bildner von Nutztieren und von Fleischprodukten in der EU überwiegend blaCTX-M-1, blaTEM-52 oder blaSHV-12. Neben der Resistenz gegenüber β-Laktamen konnten diverse phäno-typische und genophäno-typische Resistenzen gegenüber weiteren Wirkstoffklassen nachgewiesen werden. Besonders häufig waren Resistenzen gegenüber Tetrazyklin, Sulfamethoxazol/Tri-methoprim und Gentamicin. Eine beträchtliche Anzahl der E. coli-Isolate zeigte zudem eine verminderte Fluorchinolon-Empfindlichkeit und neun der Isolate trugen Plasmid-vermittelte Chinolon-Resistenzdeterminanten (qnrB oder qnrS).

Auch bei den E. coli-Isolaten konnte mittels verschiedener Typisierungsverfahren eine deutliche genetische Heterogenität nachgewiesen werden. So konnten insgesamt 25

Zusammenfassung 57

unterschiedliche Multilokus-Sequenztypen ermittelt werden sowie alle vier phylogenetischen Hauptgruppen (A. B1, B2, D) nachgewiesen werden, wobei die Isolate besonders oft zur Gruppe D gehörten. Diese umfasst zusammen mit Gruppe B2 den Großteil aller extra-intestinal pathogenen E. coli. Es konnten zudem verschiedene Virulenz- und Fitness-assoziierte Gene nachgewiesen werden, darunter hlyE, iroN und astA. Häufig wurden Gene nachgewiesen, welche oft bei Geflügel-assoziierten Isolaten vorkommen (iss, tsh). Ein Isolat trug zudem Gene, die typisch für enteropathogene E. coli sind, darunter eae, espB_O26 und Gene für ein Typ-III-Sekretionssystem.

Von den insgesamt fünf Salmonella enterica subsp. enterica-Isolaten wurden zwei Isolate aus illegal importiertem Fleisch als S. Infantis und S. Weltevreden identifiziert. Während das S.

Infantis-Isolat Resistenzen gegenüber Wirkstoffen aus fünf Wirkstoffklassen aufwies, zeigte das S. Weltevreden-Isolat keinerlei phänotypische Resistenzen. Die drei Isolate aus legalen Importen gehörten zum Serovar Heidelberg oder waren unbegeißelt. Alle drei Isolate aus legalen Importen zeigten Resistenzen gegenüber Cephalosporinen der dritten Generation und trugen das AmpC-β-Laktamasegen bla_CMY-2. Sie waren zudem resistent gegenüber Cipro-floxacin, Tetrazyklin sowie Sulfamethoxazol. Dies ist bedenklich, da Co-Resistenzen gegenüber Cephalosporinen der dritten Generation und Fluorchinolonen bei nicht-typhösen Salmonellen in der EU derzeit selten sind. Die bla_CMY-2-Gene der Isolate lagen jeweils auf konjugativen Plasmiden, die sich auf einen E. coli-Empfängerstamm übertragen ließen. In zwei Fällen erfolgte ein Co-Transfer der Gene sul2 und tet(A), welche für Sulfonamid- bzw.

Tetrazyklinresistenz codieren.

Insgesamt konnte im Rahmen dieser Arbeit aufgedeckt werden, dass legal sowie illegal importierte Fleischwaren S. aureus, E. coli- und Salmonella enterica-Isolate beherbergen können, die mitunter multiple antimikrobielle Resistenzen und bedeutsame Virulenz-determinanten aufweisen. Viele Isolate unterschieden sich genetisch deutlich von jenen, die in der EU üblicherweise auf Fleischprodukten nachgewiesen werden und es wurden bisher unbeschriebene Genvarianten identifiziert. Zudem wiesen die Isolate mitunter ungewöhnliche Resistenzphänotypen auf. In der Folge könnte es zu einer Infektion oder Besiedlung von Personen durch solche resistenten Stämme kommen. Des Weiteren besteht die Möglichkeit

einer Übertragung von derzeit in der EU wenig verbreiteten Resistenzdeterminanten auf andere Bakterienstämme durch horizontalen Gentransfer. Der internationale Handel und die illegale Einfuhr von Fleisch und Fleischprodukten könnten somit die Ausbreitung von Zoonoseerregern und antimikrobiellen Resistenzen über weite Strecken fördern.

Summary 59

Summary 5.

Anja Müller

Molecular characterization of Staphylococcus aureus, ESBL-/AmpC-producing Escherichia coli and Salmonella enterica recovered from food products legally and illegally imported to Germany from third countries

Meat and meat products are imported into the EU in large quantities. In addition to legal imports, considerable amounts of these products are introduced illegally, for example in passenger luggage. This might facilitate the global spread of zoonotic pathogens and antimicrobial resistances through contaminated meat. However, to date, few studies provide information about the characteristics of individual isolates entering Germany and the EU in these ways. The available data on strains isolated from illegally imported meat is particularly scarce. For this reason, the present study focused on a detailed characterization of zoonotic pathogens recovered from legally and illegally imported meat and meat products. Isolates of three different clinically relevant bacterial species, which can cause foodborne infections or intoxications as well as systemic infections, were included in the analyses. These comprised methicillin-resistant (MRSA, n = 9) and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus (MSSA, n = 14), AmpC- or extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing Escherichia coli (n = 16), and Salmonella enterica (n = 5). The genetic relationship of the isolates within each species was determined using different molecular typing procedures. All isolates were further examined regarding their antimicrobial resistance phenotype and genotype. For this purpose, several methods were used, including antimicrobial susceptibility testing, PCR assays, whole genome sequencing, sequence analyses of individual genes and conjugation experiments. S. aureus- and E. coli-isolates were additionally tested for the presence of major virulence-associated genes.

Various antimicrobial resistances were identified among the 23 S. aureus isolates, including nine MRSA recovered from illegally imported meat products, and 14 isolates were resistant to substances from three or more classes of antimicrobials. Additionally, unusual resistance patterns were observed. Several isolates lacking an MRSA genotype showed borderline

resistance to oxacillin. Another isolate carried an unusual variant of the phenicol-resistance gene fexA, which conferred resistance to chloramphenicol but not to florfenicol.

Molecular typing results revealed a marked genetic heterogeneity among the S. aureus isolates. No isolate belonged to CC398, the predominant livestock-associated clonal complex in Western Europe. Instead, many isolates belonged to clonal lineages frequently found in humans (sak-, chp-, scn-positive isolates of CC1, CC5, CC80).

Moreover, major virulence-associated determinants were identified among the isolates. These comprised genes encoding enterotoxins, including sea and sed, as well as genes coding for other important virulence factors such as the Panton-Valentin leucocidin, toxic shock syndrome toxin-1 (tst1) and exfoliative toxin D (etD).

Furthermore, a total of 36 ESBL-/AmpC-producing E. coli were examined, including three isolates from illegally imported meat products. The identification of their respective β-lactamase genes revealed that bla_CTX-M-2was the most prevalent ESBL gene among the isolates, followed by the AmpC β-lactamase gene bla_CMY-2and bla_CTX-M-8. In contrast to this, ESBL producers isolated from livestock or meat in the EU most frequently carry bla_CTX-M-1, bla_TEM-52 or bla_SHV-12. In addition to β-lactam-resistance, a variety of phenotypic and

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