Studiengang Lebensmitteltechnologie WS 2017/2018
Untersuchungen zur Verbreitung und Diversität von Colistin-Resistenzen in
kommensalen Escherichia coli Isolaten aus Lebensmitteln und Nutztieren:
Welche Infektionsgefahr besteht für den Verbraucher?
urn:nbn:de:gbv:519-thesis2017-0710-1
Verfasserin: Anja Müller
Betreuer: Professor Dr. Karl Steffens Dr. Jens Andre Hammerl
The study was conducted to characterize the genetic basis of colistin-resistant Escherichia coli isolates recovered during the annual national zoonoses monitoring of food and livestock (2009-2017) in Germany. Colistin is considered as antimicrobial of the last resort only used for treatment of human infections with ESBL- or carbapenemase-producing gram-negative bacteria. As colistin is commonly used for the treatment of livestock-infections, the question on the extent of transmission of colistin-resistant bacteria from livestock to humans via food products arises. During routine microbroth dilution-testing of the national reference laboratory for antimicrobial resistance more than 750 of ~20000 commensal E. coli isolates were identified as colistin-resistant (MIC ≥4 mg/L) since 2010. As some of them exhibited an unusually high value for colistin (MIC ≥8 mg/L), selected isolates were further investigated phenotypically and genetically to determine their genetic basis. The isolates were analyzed for their phylogenetic relationship (XbaI-PFGE) and their plasmid content (S1-PFGE). XbaI-PFGE analyzes showed no significant relationship between the isolates suggesting that they originate from independent evolutionary lineages. S1-PFGE analysis revealed that the isolates harbored up to nine plasmids of different size (104 -350 kb). Short-read whole genome sequencing and bioinformatics of the isolates confirmed that the isolates are not related (MLST, sero- and Fim-type). In silico-detection of the antimicrobial resistance determinants indicated that some of the isolates comprises a mobile colistin resistance gene (e.g. mcr-1) on plasmids. However, as the presence of this gene usually result in a low value of colistin resistance in E. coli, the genomes were further investigated for known mutation chromosomal factors. Therefore two genes, pmrA and pmrB, which are involved in the development of the LPS-structure in E. coli, were analyzed for nucleotide variations potentially resulting in a development of the colistin-resistance. However, up to now the genetic basis of the increase colistin resistance could not be completely determined. Interestingly, some of the isolates did not harbor known factors for the development of a colistin resistance suggesting that they comprise novel determinants and/or mechanisms for resistance development.
In a second part of the study the variability of the mcr-1-gene in E. coli was investigated. Sanger sequencing of mcr-1 PCR products of 678 E. coli isolates resulted in the identification of six novel gene variants. However, due to the low prevalence the variants are not suited for further epidemiological analyses or diagnostic purposes.
In the future, the data of this work were used for the risk assessment and further identification and characterization of the novel resistance mechanism of the isolates.
An erster Stelle geht mein Dank an Herrn Dr. Jens Hammerl, der mir diese Arbeit am Bundesinstitut für Risikobewertung in der Abteilung für Biologische Sicherheit ermöglicht hat. Vielen herzlichen Dank für die ausgezeichnete Betreuung, auch schon während des Praxissemesters zuvor, die netten Gespräche und ausführlichen Erklärungen.
Weiterhin bedanke ich mich bei Frau Prof. Annemarie Käsbohrer für die Möglichkeit meine Bachelorarbeit in ihrer Fachgruppe durchzuführen. Außerdem geht ein Dank an die Mitarbeiter der Fachgruppe 43 für die herzliche Aufnahme und angenehme Arbeitsatmosphäre. Insbesondere an Silvia Schmoger und Alexandra Irrgang für die Hilfsbereitschaft und netten Gespräche.
Ein herzliches Dankeschön geht an meine Eltern und meinen Bruder für jegliche Unterstützung, nicht nur während des Studiums.
Zu guter Letzt bedanke ich mich bei meinem Freund, der mir ebenfalls immer zur Seite steht und mich immer unterstützt.
Abb. Abbildung AMP Ampicillin AZI Azithromycin BfR Bundesinstitut für Risikobewertung bp Basenpaare CHL Chloramphenicol CIP Ciprofloxacin COL Colistin CSB Zell-Suspension-Puffer
EDTA (Na2EDTAxH2O) Ethylendiamintetraessigsäure
EtOH Ethanol FOT Cefotaxime GEN Gentamicin I Intermediär Kb Kilobasen L Lysat LB Lysogeny Broth MERO Meropenem NaCl2 Natriumchlorid NAL Nalidixinsäure NEO Neomycin
o.D. ohne Datum
OD optische Dichte PFGE Pulsfeldgelelektrophorese R Resistent S Sensibel SMX Sulfamethoxazole Tab. Tabelle TAZ Ceftazidime TBE TRIS-Borat-EDTA-Puffer TE TRIS-EDTA-Puffer TET Tetracycline TGC Tigezykline TMP Trimethoprim TRIS Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 7
1.1 Bedeutung von Antibiotikaresistenzen ... 7
1.2 Mobile genetische Elemente und Mechanismen des horizontalen Gentransfers ... 7
1.3 Das Antibiotikum Colistin ... 9
1.4 Verbreitung von Colistin Resistenzen ... 9
1.5 Zielsetzung ... 10
2. Material und Methoden ... 11
2.1 Material ... 11
2.1.1 Chemikalien und Lösungen ... 11
2.1.2 Reaktionskits ... 11
2.1.3 Geräte und Materialien ... 12
2.1.4 Computerprogramme ... 13
2.1.5 Enzyme und Primer ... 13
2.1.6 Medien und Puffer ... 14
2.1.7 Bakterienstämme ... 15
2.2 Methoden ... 15
2.2.1 Stammhaltung ... 15
2.2.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ... 15
2.2.3 Agarosegelelektrophorese ... 16
2.2.4 Aufreinigung der mcr-1 -PCR-Produkte und Messung der DNA-Quantität... 16
2.2.5 Isolierung und Sequenzierung der Gesamt-DNA der Escherichia coli-Isolate ... 16
2.2.6 Bestimmung der minimalen Hemmstoffkonzentration (MHK) ... 17
2.2.7 Pulsfeld-Gelelektrophorese ... 17
2.2.8 Plasmid Isolation ... 18
2.2.9 Elektroporation ... 18
3. Ergebnisse ... 20
3.1 Molekulare Bestimmung der mcr-1 Prävalenz in Escherichia coli-Isolaten aus Lebensmitteln oder Nutztieren Deutschlands ... 20
3.2 Charakterisierung von ausgewählten Escherichia coli Isolaten mit einer starken Colistin-Resistenzausprägung ... 22
3.3 Bestätigungsuntersuchungen zur minimalen Hemmstoffkonzentration ausgewählter Escherichia coli-Isolate mit starker Colistin-Resistenzausprägung ... 22
3.4 Bestimmung der verwandtschaftlichen Beziehungen der Isolate mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) ... 26
3.4.1 Phylogenetische Verwandtschaftsanalysen auf Basis der XbaI-PFGE- Profile ... 26
3.4.2 Bestimmung extrachromosomaler Elemente in den Escherichia –coli -Isolaten mittels S1-Nuklease-PFGE ... 27
3.4.3 Untersuchungen zur Transferierbarkeit von Plasmiden mit Colistin-Resistenzgendeterminante ... 30
3.5 Bioinformatische Auswertung der Escherichia coli Genome ... 31
4. Diskussion ... 41 5. Zusammenfassung ... 46 6. Literatur ... 47 7. Tabellen ... 49 8. Abbildungsverzeichnis ... 49 9. Anlagenverzeichnis ... 50
1. Einleitung
1.1 Bedeutung von Antibiotikaresistenzen
Die Präsenz eines Antibiotikaresistenzgens ermöglicht es Mikroorganismen sich in Anwesenheit einer antimikrobiellen Substanz zu vermehren. Diese Eigenschaft kann durch eine natürliche Unempfindlichkeit (intrinsische Resistenz) hervorgerufen werden oder durch die Aufnahme und Ausbildung von entsprechenden Resistenzen anderer Organismen (extrinsische Resistenz) („Antibiotika-Resistenz“, o.D.). Dies ist insbesondere dann problematisch, wenn es sich um Erreger handelt die Krankheiten hervorrufen können. Resistente Erreger besitzen gegenüber sensiblen Bakterien einen Selektionsvorteil wenn sie entsprechenden antimikrobiellen Substanzen ausgesetzt sind. Das heißt, dass sie sich unter den gegebenen Umständen deutlich besser vermehren können („Antibiotikaresistenz in Nutztierbeständen und Lebensmitteln - Ihre Bedeutung für die Humanmedizin und Handlungsoptionen für das Risikomanagement“, 2015). Allein in Deutschland werden in der Humanmedizin jährlich 816 t Antibiotika eingesetzt. In der Veterinärmedizin ist dieser Anteil deutlich höher, da jährlich 1706 t Antibiotika, in der Massentierhaltung zur Prävention von Krankheiten eingesetzt werden. Darunter fallen teilweise auch Reserveantibiotika (z.B. Colistin) die in der Humanmedizin nur in Ausnahmefällen eingesetzt werden, wenn Erkrankungen mit multiresistenten Gram-negativen Erregern oder Carbapenemase-produzierenden Bakterien vorliegen (Spelsberg, o.D., Jeannot et al., 2017).
1.2 Mobile genetische Elemente und Mechanismen des horizontalen Gentransfers
Als mobile genetische Elemente werden DNA-Moleküle bezeichnet, die innerhalb eines Bakteriums ihre genetische Lokalisation verändern können (z.B. Transposons, die vom Chromosom auf ein extrachromosomales Element transponieren) oder sogar von Bakterium zu Bakterium übertragen werden können. Transposons werden dabei durch Rekombination innerhalb eines Chromosoms oder Plasmides, auf andere genetische Elemente übertragen. In Archaebakterien (Archebakterien), Eubakterien und Eukaryonten sind transponierbare Elemente weit verbreitet und können zu einer Umorganisation des Genoms führen. Dadurch entsteht eine genetische Variabilität, die dem Bakterium einen zusätzlichen Selektionsvorteil verschaffen kann. Es gibt verschiedene Arten mobiler genetischer Elemente wie z.B. Plasmide (Fuchs, 2007). Plasmide kommen vorrangig bei Bakterien vor und bestehen aus einem zirkulären, doppelsträngigen DNA-Molekül. Plasmide werden unabhängig vom bakteriellen Chromosom repliziert, da sie eigenständige genetische Elemente sind. Die Größe von Plasmiden kann sehr stark variieren. Übliche Größen belaufen sich von 2-3 kb auf bis zu 200 kb (Fernandez-Lopez et
al., 2017). Es wurden aber auch schon Megaplasmide identifiziert, deren Größen bis zu 2 Mbp betragen können. Plasmide enthalten mindestens einen Replikationsursprung, den sogenannten vegetativen Origin. Darüber hinaus können Plasmide den Bakterien zusätzliche Eigenschaften verleihen. So können Bakterien beispielsweise durch sogenannte F-Plasmide (Fertilitätsplasmide) Pili ausbilden, durch die eine Übertragung von genetischen Informationen möglich ist (z.B. Konjugation) (Fernandez-Lopez et al., 2017). Eine weitere bedeutende Gruppe sind die R-Plasmide (Resistenzplasmide). Diese enthalten Resistenzgene gegen verschiedene Antibiotika und können bei der Übertragung in andere Bakterien zur Resistenzausbildung führen. R-Plasmide sind von großer Bedeutung, da sie die Behandlung von Krankheitserregern durch Verringerung der therapeutischen Maßnahmen erschweren. Meist enthalten R-Plasmide zusätzlich Transferfaktoren, wodurch sich die Resistenz auf andere Zellen übertragen kann („Plasmid“, o.D.). Beim sogenannten horizontalen Gentransfer wird genetisches Material von einer Zelle in eine andere weitergegeben. Dies kann auch bei nicht artverwandten Bakterien erfolgen, was den Unterschied zum vertikalen Gentransfer darstellt. Beim horizontalen Gentransfer wird zwischen den Mechanismen (1) Transformation, (2) Konjugation und (3) Transduktion unterschieden. Der unterschiedliche Wirtsbereich charakterisiert dabei die Mechanismen. Die Transformation ist ein Prozess der nicht selektiv und weit verbreitet ist und bei dem freie DNA-Moleküle von einem Organismus direkt aufgenommen werden können. Wenn Bakterienzellen im Stande sind, freie DNA aufzunehmen, werden diese als „kompetent“ bezeichnet. Nachdem die Aufnahme der DNA erfolgt ist, muss diese durch Rekombination in das Erbgut der Empfängerzelle eingebaut werden, da sie sonst nicht vervielfältigt wird und verloren geht. Bei der Konjugation findet ein Genaustausch meist nur zwischen verwandten Organsimen statt. Durch Pili kommt es zum direkten Zellkontakt und es kann genetisches Material übertragen werden. Es kann zum Austausch von in das Genom integrierter DNA kommen oder zum Transfer von extrachromosomal vorliegender Fremd-DNA, z.B. in Form von Transposons oder Plasmiden. Der Gentransfer mittels Bakteriophagen in eine Empfängerzelle wird als Transduktion bezeichnet. Dabei können Bakteriophagen Fremd-DNA in ihrem Genom tragen, die sie aus ihrem ursprünglichen Wirt oder einem anderen bakteriellen Zwischenwirt aufgenommen haben. Durch die Infektion einer anderen, neuen Bakterienzelle kann so die Information weitergegeben werden. Da der Wirtsbereich der Bakteriophagen sehr spezifisch ist, wird die Transduktion als ein Prozess angesehen, der oftmals nicht zur Ausbreitung des genetischen Materials über die Artgrenzen hinaus führt (Hartmann, 2004/2005).
1.3 Das Antibiotikum Colistin
Colistin gehört der Gruppe der Polymyxine an und ist ein Polypeptidanbitiotikum. Es wird hauptsächlich in der Veterinärmedizin eingesetzt um intestinale Infektionen zu behandeln (Srinivas & Rivard, 2017). Im Jahr 2016 wurden in Deutschland insgesamt 69 t Polypeptidantibiotika verwendet, wobei es sich in den meisten Fällen um Colistin handelte. In der Humanmedizin wird Colistin selten eingesetzt, da es weniger verträglich als andere Antibiotika ist. Allerdings gilt Colistin in der Humanmedizin als Reserveantibiotikum, dass bei auftretenden Infektionen durch multiresistente Gram-negative Bakterien oder Carbapenemase-produzierenden Enterobacteriaceen eingesetzt wird (Irrgang et al., 2016). Colistin wurde von der World Health Organisation (WHO) 2017 zu einem besonders wichtigen Antibiotikum mit höchster Priorität eingestuft (Jeannot et al., 2017). Einerseits begründet die WHO dies mit der zunehmenden Bedeutung, Colistin in der Humanmedizin einzusetzen um schwierige Infektionen zu behandeln und das durch die übertragbare Resistenz diese in die Lebensmittelkette gelangen kann („Fragen und Antworten zum Antibiotikum Colistin und zur übertragbaren Colistin-Resistenz von Bakterien“, 2018).
1.4 Verbreitung von Colistin Resistenzen
Bei Tierisolaten wird die Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Colistin schon einige Jahre beschrieben. Allerdings wurde bis 2015 angenommen, dass die Resistenz der Isolate chromosomal bedingt ist. Dabei wurde nachgewiesen, dass Veränderungen in der Nukleotidsequenz der chromosomalen Gene pmrA und pmrB eine Resistenz gegenüber Colistin hervorrufen kann (Jeannot et al., 2017; Quesada et al., 2015). Im Jahr 2015 wurde erstmals ein Plasmid identifiziert, welches ein Gen zur Resistenzausbildung gegen Colistin überträgt. Das entsprechende Resistenzgen mit der Bezeichnung mcr-1 wurde in Nutztieren und Menschen in China beschrieben (Liu et al., 2016). Seither wurden weitere übertragbare Colistin-Resistenzgene nachgewiesen (mcr-1 bis mcr-5). Es ist davon auszugehen, dass diese Gene auch in die Lebensmittelkette gelangen und auf den Verbraucher übertragen werden können. Seit 2010 wird als Bund-Länder-Programm durch das Zoonosen-Monitoring die Colistin-Resistenz bei kommensalen E. coli und Zoonosenerregern (z.B. Salmonella enterica) untersucht. Dabei konnte im Zeitraum 2010 bis 2015 nachgewiesen werden, dass vor allem E. coli-Isolaten aus Geflügel (Putenfleisch 11,7% und Hähnchenfleisch 6,0%) resistent gegen Colistin sind (Irrgang et al., 2016). Auch für Salmonellen wurden z.T. hohe Colistin-Resistenz-Nachweisraten festgestellt (Borowiak et al., 2017A, Borowiak et al., 2017B).
1.5 Zielsetzung
In den Untersuchungen dieser Arbeit sollen verschiedene Aspekte der enterobakteriellen Resistenzausprägung gegenüber dem Reserveantibiotikum Colistin in E. coli-Isolaten untersucht und charakterisiert werden. Dabei wird ein Teil der praktischen Untersuchungen eine tiefgründige phäno- und genotypische Charakterisierung von Colistin-resistenten E. coli-Isolaten umfassen. Die Isolate stammen aus Lebensmitteln bzw. lebensmittelliefernden Nutztieren und wurden im Rahmen des Nationalen Zoonosen-Monitorings zwischen 2009 und 2017 isoliert. Anhand ihrer Colistin-Resistenzausprägung (MIC ≥4 mg/L), die auf initialen Mikrodilutionsuntersuchungen basiert, wurden 18 Isolate für weitere Studien ausgewählt. Zur weiteren Charakterisierung sollen von diesen Isolaten die antimikrobiellen Resistenzen bestätigend untersucht werden. Im Anschluss werden die Isolate mittels XbaI-Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) vergleichend untersucht. Weitere Untersuchungen mittels S1-PFGE sollen zeigen, ob die Isolate Plasmide aufweisen, die ggf. Träger mobiler Colistin-Resistenzgene sind. Weitere Untersuchungen zur Charakterisierung der Plasmide einschließlich ihrer Übertragbarkeit und Stabilität in E. coli sind geplant. Die biologischen Untersuchungsergebnisse sollen mit Daten des Gesamtgenoms, das mittels MiSeq-Sequenzierung bestimmt werden soll, abgeglichen werden. Dafür werden die genetischen Resistenzdeterminanten in silico über bioinformatische Datenbankabfragen bestimmt. Zusätzlich werden potentielle Plasmidsequenzen identifiziert, um Aussagen zur Bedeutung der mobilen genetischen Elemente in E. coli machen zu können. Weitere Klassifizierungen der Isolate wie. z.B. die Bestimmung des MLST-, Sero-und Fim-Typs sowie phylogenetische Verwandtschaftsanalysen sollen vorgenommen werden. Ein zweiter Teil der Arbeit wird sich mit der Typisierung von mcr-1 tragenden, Colistin-resistenten E. coli befassen. Dafür wird das mcr-1 Gen von einer Vielzahl von Isolaten mittels PCR amplifiziert und über Sanger Sequenzierung bestimmt. Mit diesem Vorgehen sollen Varianten des mcr-1 Gens identifiziert werden, die mindestens einen Aminosäureaustausch im Vergleich zur Referenz aufweisen. Anhand der Verbreitung der Varianten sollen epidemiologische Zusammenhänge zur Herkunft, Verbreitung und Evolution Colistin- resistenten E. coli gewonnen werden. Die Gesamtheit der geplanten Untersuchungen sollen Aufschluss zu den genetischen Grundlagen Colistin-resistenter E. coli liefern. Diese Informationen sollen für Risikobewertungen genutzt werden, um die Ursache der Verbreitung Colistin-resistenter E. coli nachvollziehen zu können. Darüber hinaus sollen diese Risikobewertungen Ansätze für Managementstrategien liefern, die zukünftig eine Verbreitung entsprechender Isolate in der Lebensmittelwarenkette verschiedener Produkte minimieren.
2. Material und Methoden 2.1 Material
2.1.1 Chemikalien und Lösungen
Tab. 1: Verwendete Chemikalien und Lösungen
Chemikalien/ Lösungen Hersteller
GelRed Nucleic Acid Strain Biotium, Biotrend Chemikalien GmbH, Deutschland
GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder, DreamTaq Green PCR Mastermix (2x konz.), Elektrokompetente E. coli DHB10
Thermo Fisher Scientific, Deutschland
Midori Green Advance DNA Strain Nippin Genetics Europe GmbH, Deutschland Biozym Gold-Agarose Biozym Scientific GmbH, Deutschland Ultra Pure™ Agarose Invitrogen, Deutschland
EDTA, Natriumchlorid (NaCl2), Salzsäure
(HCl)
Carl Roth, Deutschland
Sodium N-Lauroylsarcosin Natriumsalz Fluka, Deutschland SDS, Borsäure,
Tris(hydroxymethyl)amino-methane (Tris), Ethanol absolut (EtOH)
Merck, Deutschland
Thioharnstoff TCI Deutschland GmbH, Deutschland
2.1.2 Reaktionskits Tab. 2: Reaktionskits
Kit-Systeme Hersteller
PureLink® Genomic DNA Mini Kit Invitrogen, Deutschland
Agencourt® CosMCPrep® Mini Kit Beckmann Coulter, Vereinigte Staaten von Amerika
Illustra™ GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit
GE Healthcare, Großbritannien
2.1.3 Geräte und Materialien Tab. 3: Geräte und Materialien
Geräte/ Material Hersteller
Pipetten Eppendorf, Deutschland
Flachgelapparatur (Kammer, Gelträger, Kämme), inkl. Spannungsgerät für Gelelektrophorese
Bio-Rad PowerPacTM Basic, Deutschland
Geldokumentationssystem; VWR, G:Box Syngene, Deutschland MHK:
Antibiotika-Platten: Sensititre™ EUVSEC ,TREK Diagnostic Systems (Vizion), OD-Messgerät: Densimat, Abfüllautomat MHK: Sensititre Auto Inoculator
Thermo Scientific, Deutschland
MiSeq-System (WGS-Sequenzierer) Illumina GmbH, Deutschland
MS2 Minishaker IKA, Deutschland
Nanodrop1000 Spektrometer V3.7 Thermo Scientific, Deutschland PFGE:
OD-Messgerät: WPA CO8000 Cell Density Meter
Heizrüttler Thermomixer Compact Wasserbad-Rüttler, beheizbar Kreis-/Orbitalschüttler GFL 3015 System von Bio-Rad: CHEF-DR® III
Variable Angle System inkl. Cooling Module, Electrophoresis Cell und Variable Speed Pump
Shaker DRS-12 Küvetten
Biochrom, Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Deutschland
Eppendorf GmbH, Deutschland Köttermann GmbH & Co. KG,
Deutschland
GFL Gesellschaft für Labortechnik mbH, Deutschland
Bio-Rad Laboratories GmbH, Deutschland
NeoLab, Deutschland Ratiolab, Deutschland Sterilbank HeraSafe,
Brutschrank
Heraeus, Deutschland
Thermocycler, PCR: 2720 Thermal Cycler; Gen Amp PCR System 9700
Applied Biosystem, Deutschland
Zentrifuge 5415D Eppendorf, Deutschland
Micro Pulser ™ und Küvetten, 0,1 cm Bio-Rad Laboratories GmbH, Deutschland Eppendorf-Reaktionsgefäße (Eppis),
Falkontubes (15-50 ml)
NeoLab, Deutschland
2.1.4 Computerprogramme Tab. 4: Computerprogramme
Methode Computerprogramm Hersteller
Geldokumentation GeneSnap Syngene, Deutschland Sequenzauswertung DNAStar Lasergene,
SeqMan
DNAStar, Madison, Vereinigte Staaten von Amerika
Geldokumentation Intas Software Intas Science Imaging Instruments GmbH, Deutschland
Auswertung MHK SWIN Thermo Scientific, Deutschland
2.1.5 Enzyme und Primer Tabelle 5: Verwendete Enzyme Enzym/
Primer
Erkennungssequenz/ Bindungsstelle
Puffer Temp. Hersteller XbaI 5'...T^CTAGA...3' 3'...AGATC^T...5' SuRE Cut- Puffer H 37° C Roche Diagnostic GmbH, Deutschland
S1-Nuklease einzelsträngige DNA S1-Puffer 37° C Takara Bio, Vereinigte Staaten von Amerika Proteinase K (20 mg/ml) Peptide - 37° C Qiagen GmbH, Deutschland AMmcr-1F 5’-ATC GCT GTC GTG CTC TTT G-3’ - - Metabion GmbH, Deutschland AMmcr-1R 5’-TGC AGC CAC
TGG ATA CTT TG-3’
- - Metabion GmbH,
2.1.6 Medien und Puffer Tabelle 6: Verwendete Medien
Medium Zusammensetzung/ Hersteller
Lysogeny-Broth Medium 5 g Hefeextrakt; 10 g Trypton; 10 g NaCl; Einstellung des pH mit NaOH (pH 7.4), ad 1000 ml Wasser
Api® NaCl 0,85% Medium Suspension Medium
BioMérieux, Deutschland
Sensitire™ Cation Adjustet 2 ml Mueller-Hinton Broth
Thermo Scientific, Deutschland
Lysogeny-Broth Agar 5 g Hefeextrakt; 10 g Trypton; 10 g NaCl; 15 g Bacto-Agar; ad 1 L H2O; Einstellung des pH mit NaOH (pH 7.4)
Columbia-Blutagarplatten Oxoid, Deutschland
Tabelle 7: Zusammensetzung der Puffer
Puffer Zusammensetzung
Zell-Lyse-Puffer (mit Sarkosyl versetzt)
5 mM HCl: 5 mM EDTA; 1% (w/v) Sarkosyl ≙ 25 ml 1 M Tris-HCl (pH 8); 50 ml 0,5 M EDTA (pH 8); ad 0,5 L H2O; autoklavieren;
5 g N-Lauroyl-Sarcosine Zellsuspensionspuffer
(CSB-Puffer)
100 mM Tris-HCl; 100 mM EDTA ≙ 100 ml 1 M Tris-HCl (pH 8); 200 ml 0,5 M EDTA (pH 8); ad 1 L H2O; autoklavieren
1 x Tris-EDTA Puffer (TE-Puffer)
10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA ≙ 10 ml 1 M Tris-HCl (pH 8); 2 ml 0,5 M EDTA (pH 8); ad 1 L H2O; autoklavieren
10 x Tris-Borat-EDTA (TBE-Puffer)
109 g 0,9M Tris; 55,6 g 0,9 M Borsäure; 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8); ad 1 L H2O; autoklavieren
20 % SDS-Lösung 20 g SDS; 100 ml H2O
1 M Tris-HCl (pH 8) 121,1 g Tris(hydroxymethyl)-aminomethan) (Tris-Base); 800 ml H2O;
pH 8 mit 5 M HCl-Lösung einstellen, ad 1 L H2O
0,5 M EDTA (pH 8) 186,1 g Na2EDTAxH2O; 800 ml H2O, pH 8 mit NaOH-Lösung
einstellen, ad 1 L H2O; autoklavieren 0,5 x TBE 120 ml 10 x TBE; 2280 ml H2O 0,5 x TBE mit 100 µl Thioharnstoff 2200 ml 0,5 X TBE; 16,74 mg Thioharnstoff Zell-Lyse/ Proteinase K- Puffer
für X Proben: X* 5 ml Zell-Lyse-Puffer + X * 25 ml Proteinase K (20 mg/ml)
2.1.7 Bakterienstämme
Tabelle 8: untersuchte Bakterienstämme
Stamm-Nummer Gattung/ Spezies Herkunft Jahr der Isolation
09E00689 E. coli Fleisch, Pute 2009
09E01748 E. coli Fleisch, Schwein 2009
10E00132 E. coli Legebestand, Sockentupfer 2010
10E00174 E. coli Kalb, Kot 2010
10E00195 E. coli Fleisch, Pute 2010
10E00644 E. coli Legebestand, Sockentupfer 2010 14-AB00866 E. coli Hühnereier, Güteklasse A,
Gewichtsklasse M
2014
14-AB01030 E. coli Truthühner, Kot 2014
14-AB02083 E. coli Hühnereier 2014
14-AB03498 E. coli Legehennen (Suppenhuhn), Kot 2014 15-AB00353 E. coli Masthähnchen, Blinddarminhalt 2015
15-AB01290 E. coli Ferkel, Kot 2015
16-AB00831 E. coli Fleischteilstück Pute, gefroren 2016 16-AB01081 E. coli Hähnchen, tiefgefroren 2016 16-AB01700 E. coli Truthühner, Blinddarminhalt 2016
16-AB02049 E. coli Mohrrübe 2016
16-AB02950 E. coli Masthähnchen/-hühner, Kot 2016 17-AB00275 E. coli Masthähnchen/-hühner, Kot 2017
2.2 Methoden
2.2.1 Stammhaltung
Die E. coli-Isolate (Tab. 8) wurden bei 37 °C für 24 h aerob auf LB-Agarplatten kultiviert. Anschließend wurden sie bei 4 °C aufbewahrt. Langfristig werden die Stämme bei -80 °C in Glycerin-Kryokulturen aufbewahrt (Sambrook & Russel, 2001).
2.2.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Durch die PCR ist es möglich, identische DNA-Abschnitte eines spezifischen DNA-Bereiches zu vervielfältigen. Dafür wird in einem Reaktionsgefäß die DNA-Replikation als Teilschritt wiederholt. Dadurch wird die Kopie eines DNA-Einzelstrangs synthetisiert. Zu Beginn der PCR denaturiert die Doppelhelix durch die Hitzeeinwirkung von 94 °C. Beim Annealing binden die im Reaktionsgemisch enthaltenden PCR-Primer, sobald die Temperatur auf 50 bis 60 °C sinkt, an den passenden komplementären Abschnitten der DNA. Im Anschluss werden die
komplementären DNA-Stränge synthetisiert. Die Auswahl der Primer hängt von dem zu amplifizierenden DNA-Abschnitt ab. Sie sind so spezifisch, dass i.d.R. nur ein PCR-Produkt entsteht (Sambrook & Russel, 2001). Durch die Wiederholung der Schritte der Denaturierung, Annealing und DNA-Synthese, im sogenannten PCR-Zyklus, wird durch die Vervielfältigung der DNA durch hitzestabile DNA-Polymerasen (Taq-Polymerase) umgesetzt. („Polymerasenkettenreaktion“, o.D.). Die in diesem Falle verwendeten Primer sind AMmcr-1F und AMmcr-1R (Tab. 5).
2.2.3 Agarosegelelektrophorese
Die Auftrennung der genomischen DNA erfolgte durch Agarosegelelektrophorese. Dazu wurde eine Flachgelapparatur verwendet, auf der sich die 1,5%-igen Agarosegele auf einer Trägerplatte befanden. Die Taschen des Gels wurden mittels eines Kamms erzeugt, der nach Polymerisierung des Gels entfernt wurde. Kurz bevor das Gel gegossen wird, wird der aufgekochten Agarose Midori Green hinzugefügt. Die PCR-Proben benötigen keinen weiteren Ladungspuffer, da im PCR-Produkt bereits ein Farbstoff enthalten ist. Der Größenmarker (GeneRuler™ 100bp) wird in die äußeren Taschen gegeben. Die Elektrophorese erfolgt bei 90 V/cm für ca. 30-45 min (Sambrook & Russel, 2001). Nach Beendigung der Gelelektrophorese wurde die die DNA mit dem Geldokumentationsgerät von Syngene visualisiert.
2.2.4 Aufreinigung der mcr-1 -PCR-Produkte und Messung der DNA-Quantität
Die Aufreinigung der positiven mcr-1 -Isolate erfolgte mit dem „Illustra™ GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit“ nach Angaben des Herstellers. Für die Messung der DNA-Konzentration wurde das Gerät Nanodrop1000 ND verwendet und nach Angaben des Herstellers bedient. Zur DNA-Quantifizierung wurde 1 µl gereinigte DNA verwendet.
2.2.5 Isolierung und Sequenzierung der Gesamt-DNA der Escherichia coli-Isolate Die Gesamt-DNA der E. coli -Isolate wurde mittels des PureLink™ Genomic DNA Mini Kit der Firma Thermo Fisher Scientific isoliert. Dazu wurden die Stämme in 5 ml LB-Medium angeimpft und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Zur Isolation wurden 1,5 ml Bakteriensuspension nach Angaben des Herstellers eingesetzt und präpariert (LA Nr. 253-1). Die Sequenzierung der Gesamt-DNA wurde nach dem Protokoll „Nextera TX DNA Library Kit“ von der Firma Illumina durchgeführt. Für die Sequenzierung wird die zuvor isolierte DNA verwendet (LA Nr. 309-1).
2.2.6 Bestimmung der minimalen Hemmstoffkonzentration (MHK)
Die MHK ist die minimale Konzentration eines Antibiotikums, durch die das Wachstum eines Mikroorganismus gehemmt wird („Bestimmung“, o.D.). Für die Bestimmung der MHK-Werte eines Antibiotikums für ein Bakterium werden 96-Well-Platten (EUVSEC1 von BioMérieux) verwendet.
Der Ausstrich der Bakterien erfolgte auf Columbia-Blutagarplatten, welche anschließend für 24 h bei 37 °C inkubiert wurden. Anschließend wurde in einem Suspensions-Medium eine Bakterienkonzentration eingestellt, welche mit einem Densimat (OD-Bestimmungsgerät) überprüft wurde. Um die Bakterien auf der EUVSEC-Platte aufzubringen, wurden 50 µl der eingestellten Bakterien/Medien-Suspension in Mueller-Hinton-Medium überführt. Durch Invertieren wurde dies darin verteilt und in den AutoInoculator (Abfüllautomat) eingespannt. Der Automat verteilt in jedes Well 50 µl der Bakterien-Medien-Suspension. Anschließend wird aus einem Well ohne lyophilisiertes Antibiotikum eine Reinheitskontrolle auf einer Columbia-Blutagarplatte ausgestrichen. Diese Kontrollen und die mit einer Klebefolie verschlossenen Wellplatten werden 24 h bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation erfolgt eine Auswertung der Reinheitskontrollen und die Bestimmung der MHK mittels Trek Diagnostic Systems (LA Nr. 277-2).
2.2.7 Pulsfeld-Gelelektrophorese
Durch ein angelegtes, nicht konstantes Feld werden die Richtungen der elektrischen Felder bei der Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) pulsierend geändert. Dadurch entsteht zum Einen der Vorteil, dass die besonders langen DNA-Fragmente eine deutlich längere Strecke zurück legen. Zum Anderen richten sich die DNA-Moleküle stets neu nach dem elektrischen Feld aus und stauchen und dehnen sich so in ihrer Helixstruktur. Die in dieser Arbeit verwendete Methode heißt „CHEF-Methode: Clamped Homogeneous Electric Field“. Das zu untersuchende Gel befindet sich dabei in der Mitte aus als Sechseck angeordneten Elektroden. Der Strom wechselt pulsierend zwischen den Elektroden. Dabei sind immer zwei sich gegenüberliegende Elektronenpaare aktiv. So durchläuft die DNA das Gel zickzack-artig. Durch diese Methode kann eine Feintypisierung von Bakterien stattfinden (Sambrook & Russel, 2001). Für die Größenbestimmung wird der Referenzstamm Salmonella enterica Serovar Braenderup H9812 verwendet (www.pulsenetinternational.org).
Für die Herstellung der Agarose-Blöckchen wird in 4 ml CSB-Puffer eine OD zwischen 1,4 und 1,5 eingestellt. Im nächsten Schritt wird aufgekochte 1%-ige Agarose mit 20% SDS versetzt und
im 50 °C Wasserbad aufbewahrt. In 1,5 ml Tubes wird jeweils 15 µl Proteinase K pipettiert und mit jeweils 300 µl eingestellter Zellsuspension vermischt. Die Tubes mit der Proteinase K- Zellsuspension werden mit 300 µl Agaroselösung versetzt und sofort in die Blöckchenkammern pipettiert. Nach der Erstarrungszeit von 20 min können die Blöckchen aus den Kammern gelöst werden. Zum Waschen werden die Blöckchen in Falkontubes mit 5 ml Zelllyse-Puffer und 25 µl Proteinase K im Schwenkwasserbad bei 54 °C für 2 h geschüttelt. Anschließend wird die Lösung abgeschüttet und es werden 10-15 ml temperiertes Aqua Bidest (50 °C) zugesetzt. Nun werden die Blöckchen im Schwenkwasserbad bei 50 °C für 10 min gewaschen. Dieser Vorgang wird zwei Mal mit Aqua Bidest (50 °C) und drei Mal mit TE-Puffer (50 °C) wiederholt. Nach diesen Waschschritten werden die Blöckchen in TE-Puffer bei 4 °C bis zur Verwendung aufbewahrt. Die nachfolgende Tabelle gibt einen Überblick zu den Parametern der enzymatischen Behandlungen und der eingesetzten Enzym- und Puffermenge je Probe (LA Nr. 153-1, Rodriguez et al., 2009).
Tab. 9: Übersicht der Parameter und Zusammensetzung der Lösungen für jeweils eine Probe Enzym Parameter Ansatz beim äquilibrieren Ansatz zum Verdau XbaI 4h, 37 °C 10 µl H-Buffer 10 x + 90 µl Aqua Bidest 10 µl H-Buffer 10 x + 86 µl Aqua Bidest + 4 µl XbaI-Enzym S1 45 min, 37 °C 10 µl S1-Buffer 10 x + 90 µl Bidest 10 µl S1-Buffer 10 x + 90 µl Aqua Bidest + 0,04 µl S1-Enzym
2.2.8 Plasmid Isolation
Die durch die PFGE identifizierten Plasmide der Stämme wurden mit Hilfe des „Agencourt® CosMCPrep® Mini Kit“ nach Angaben des Herstellers isoliert. Diese Plasmide sollen für weitere Untersuchungen mittels Elektroporation in kompetente E. coli DHB10 Zellen übertragen und weiter untersucht werden (Sambrook & Russel, 2001).
2.2.9 Elektroporation
Mittels der Elektroporation ist es möglich, Plasmide durch einen Stromstoß (2,5 kV) in elektrokompetente E. coli zu übertragen. Durch die Spannung erhöht sich die Kompetenz der Zellen und die Plasmide werden besser aufgenommen. Über diese Untersuchung soll geklärt werden, ob die Colistin-Resistenz auf einem der Plasmide lokalisiert ist (Sambrook & Russel, 2001).
2.2.10 Bioinformatische Auswertung
Die bioinformatisch Auswertung wurde mit Tools der Web-basierten Plattform „Center for Genomic Epidemiology“ (http://www.genomicepidemiology.org) durchgeführt. Dafür wurden die sequenzierten Daten assembliert und auf der Plattform analysiert.
3. Ergebnisse
In dieser Bachelorarbeit wurden detaillierte Untersuchungen zur Charakterisierung Colistin-resistenter E. coli Isolate durchgeführt. Dafür wurden zwei Untersuchungsstränge verfolgt. Zum einen wurden alle Colistin-resistenten Isolate des nationalen Referenzlabors für Antibiotikaresistenz (NRL-AR) am BfR seit 2009 molekular hinsichtlich ihres Vorkommens auf das mobile Colistin-Resistenzgen mcr-1 untersucht. Zum anderen wurden ausgewählte Isolate mit einer starken Resistenzausprägung eingehend genetisch charakterisiert, um den Ursprung der Colistin-Resistenz auf die entsprechenden genetischen Bereiche festzulegen. Die Teiluntersuchungen zu den einzelnen Bereichen und die spezifischen Zielsetzungen der methodischen Ansätze sind nachfolgen detailliert dargestellt.
3.1 Molekulare Bestimmung der mcr-1 Prävalenz in Escherichia coli-Isolaten aus Lebensmitteln oder Nutztieren Deutschlands
Die Untersuchungen zur molekularen Prävalenzbestimmung des mcr-1 Gens wurden durchgeführt, um den Anteil dieser weit verbreiteten Resistenzdeterminante in E. coli-Isolaten über die Untersuchungsjahre 2009 bis heute zu untersuchen. Dafür wurden in dieser Arbeit insgesamt 678 Stämme mittels konventioneller PCR auf die Anwesenheit des mcr-1 Gens untersucht. Die untersuchten Isolate stammen aus Lebensmitteln oder lebensmittelproduzierenden Tieren und wurden im nationalen Zoonosen-Monitoring seit 2009 gewonnen. Alle Isolate werden im Rahmen amtlicher Untersuchungen im NRL-AR am BfR mittels Mikrodilutionsverfahren hinsichtlich ihrer minimalen Hemmstoffkonzentration (MHK) gegen 14 Antibiotika untersucht. Für diese Bachelorarbeit wurden alle Isolate mit einer Resistenz gegen Colistin einer weiteren molekularen Typisierung (PCR) unterzogen. Eine Resistenz gegen Colistin liegt vor, wenn der sogenannte MHK-Wert für Colistin ≥4 mg/l beträgt. Isolate, die in der phänotypischen Untersuchung diesen Wert erreichten oder überstiegen, wurden für das mcr-1 PCR-Screening ausgewählt. Das PCR-Screening beschränkt sich auf das mcr-mcr-1 Gen, da dies die häufigste mobile Colistin-Resistenz darstellt. Dabei wurden mittels PCR alle mcr-1-positiven Isolate identifiziert. Die weitere Sanger-Sequenzierung der PCR-Produkte sollte dazu beitragen neue Genvarianten, mit spezifischen Aminosäureaustauschen, zu bestimmen. Epidemiologische Auswertungen sollen zeigen ob der Ursprung bzw. die Herkunft der Isolate anhand der vorliegenden Metadaten bestimmbar ist.
Tab. 10: Verteilung der mcr-1-positiven Isolate über die Jahre und Isolationsmatrix Isolationsjahr Matrix 2009 2010 2011 2012 2013 2014 201 5 2016 2017 Schwein - - 14 - - - 15 3 5 Rind - 17 5 4 - 1 1 2 - Geflügel - 53 65 74 66 78 12 117 1 Sonstige - - 2 4 - - - - 1 Anzahl aller untersuchten Isolate 2 96 131 90 75 90 41 140 13
PCR-Produkte von Isolaten, die beim molekularen Screening durch das Auftreten eines spezifischen PCR-Produktes als mcr1-positiv eingestuft wurden, wurden mittels „Illustra™ GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit“ aufgereinigt und für die Sequenzierung nach Sanger der Firma Eurofins Genomics (Ebersberg, Deutschland) bereitgestellt. Die von Eurofins Genomics generierten Sequenzdaten wurden bioinformatisch unter Verwendung der Programme DS Gene (Accelrys Inc.) und SeqMan (Lasergene Inc.) ausgewertet.
Von den 678 untersuchten Isolaten wurden insgesamt 540 als mcr-1-positiv eingestuft. Sequenzvergleiche der generierten PCR-Produkte zeigten, dass in nahezu allen amplifizierten DNA-Fragmenten keine Abweichungen zur Referenzsequenz festgestellt werden konnten. Nur bei den Produkten der Isolate AB00583, AB00810, AB00869, AB03111, 16-AB02557 und 15-AB01101 konnten Veränderungen in der Nukleotidsequenz festgestellt werden, die auch in einer Veränderung in der Aminosäuresequenz resultieren und somit als Genvariante betrachtet werden. Darüber hinaus wurden vereinzelt Abweichungen in der Nukleotidsequenz festgestellt, die jedoch stille Mutationen darstellen und somit keinen Einfluss auf die Aminosäuresequenz des MCR-1 Proteins haben.
Tab. 11: Übersicht zu den nachgewiesenen mcr-1 Genvarianten (Allele)
Isolat Allel Veränderung
16-AB00583 mcr-1.2 Punktmutation mit Aminosäureaustausch 16-AB00810 mcr-1.2 Punktmutation mit Aminosäureaustausch 16-AB00869 mcr-1.2 Punktmutation mit Aminosäureaustausch 16-AB03111 Neuer Typ Punktmutation mit Aminosäureaustausch 16-AB02557 Neuer Typ Punktmutation mit Aminosäureaustausch 15-AB01101 mcr-1.11 Punktmutation mit Aminosäureaustausch
Die Anzahl der nachgewiesenen Genvarianten ist sehr gering und lässt somit keine weiteren epidemiologischen Auswertungen zu, um den Ursprung bzw. die Verbreitung dieser Genvarianten zu bestimmen. Die Untersuchungen werden jedoch in Zukunft standardisiert im NRL-AR durchgeführt, um das Auftreten bzw. Verschwinden bekannter und neuer Resistenzgenvarianten nachvollziehen zu können.
3.2 Charakterisierung von ausgewählten Escherichia coli Isolaten mit einer starken Colistin-Resistenzausprägung
Im zweiten Teil der Arbeit wurden ausgewählte Isolate mit einer ungewöhnlich hohen Colistin-Resistenzausprägung phänotypisch und genotypisch charakterisiert. Ziel der Untersuchungen war die Bestimmung der genetischen Basis, die für die Colistin-Resistenzausprägung verantwortlich ist.
3.3 Bestätigungsuntersuchungen zur minimalen Hemmstoffkonzentration ausgewählter Escherichia coli-Isolate mit starker Colistin-Resistenzausprägung
Da die MHK-Bestimmung eine Standartuntersuchung ist und diese gesetzlich-verpflichtend im NRL-AR durchgeführt wird, liegen für alle E. coli Isolate des Zoonosen-Monitorings entsprechende Daten vor. In diesen Untersuchungen wurden einige Isolate mit einem besonders hohen MHK-Wert identifiziert. Da die Ursache dieser starken Resistenzausprägung bisher unbekannt ist, sollten diese Isolate in dieser Bachelorarbeit eingehend charakterisiert werden. Zur Bestätigung der MHK-Werte wurden 18 ausgewählte E. coli Isolate nochmals hinsichtlich ihrer Resistenzausprägung charakterisiert. Dafür wurde die akkreditierte Untersuchungsmethode des NRL-AR verwendet. Interessanterweise stellte sich dabei heraus, dass nur für einige Stämme die ursprünglich starke Resistenzausprägung bestätigt werden konnte. Darüber hinaus wurden auch Isolate identifiziert, die in der Nachuntersuchung keine Resistenz mehr gegenüber Colistin (MHK <4) aufwiesen. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in Tabelle 12 zusammengefasst.
Tab. 12: Übersicht der MHK-Werte der Stämme im Vergleich
MHK-Wert
Stammnummer Herkunft Alte Messung Neue Messung
10E00132 Legebestand, Sockentupfer >16 > 16
10E00174 Kalb, Kot 16 8
10E00195 Fleisch, Pute >16 ≤1
10E00644 Legebestand, Sockentupfer >16 ≤1
09E00689 Fleisch, Pute 16 ≤1
09E01748 Fleisch, Schwein 16 >16
14-AB00866 Hühnereier Gütekl. A Gewichtskl. M 32 >16
14-AB01030 Truthühner, Kot 16 8
14-AB02083 Hühnereier 32 ≤1
14-AB03498 Legehennen (Suppenhuhn), Kot 32 >16 15-AB00353 Masthähnchen, Blinddarminhalt 16 4
15-AB01290 Ferkel, Kot 16 8
16-AB00831 Fleischteilstück Pute, gefroren 16 8
16-AB01081 Hähnchen, gefroren 16 8
16-AB01700 Truthühner, Blinddarminhalt 16 8
16-AB02049 Mohrrübe 16 4
16-AB02950 Masthähnchen/-hühner, Kot 16 4
17-AB00275 Masthähnchen/-hühner, Kot 16 8
Legende: rot hinterlegt: sehr hohe Resistenzwerte, orange hinterlegt: hohe Resistenzwerte, grün hinterlegt: keine Resistenz
Für die Interpretation der Daten muss bemerkt werden, dass eine Schwankung von einer Konzentrationsstufe bei den mikrobiologischen MHK-Untersuchungen akzeptiert wird. Diskrepanzen, die auf dem Unterschied eine Stufe basieren werden als natürliche Schwankungen angesehen. Insgesamt konnten die MHK-Ergebnisse von elf Isolaten bestätigt werden. Nur drei Isolate wiesen eine Schwankung von mehr als zwei Konzentrationsstufen im Vergleich zur initialen Resistenzbestimmung auf. Im Gegensatz dazu konnte für vier Isolate keine Resistenz gegenüber Colistin im Vergleich zur initialen Messung festgestellt werden.
Durch die MHK-Untersuchung mit dem verwendeten Antibiotika-Plattenformat (EUVSEC) wurden bei den getesteten Isolaten auch Resistenzen gegen andere Antibiotika festgestellt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 13 zusammengefasst.
Tab. 13: Übersicht der MHK-Ergebnisse S tam m -n u m m er AM P
AZI CHL CIP COL FOT GE
N NAL SM X TET TM P 10E00132 R R S S R I S S S S S 09E01748 S S S S R S S S S S S 14-AB00866 S S S I R I R R S R S 14-AB03498 S S S I R S S S S R S 10E00174 R S R I R S S R R R R 14-AB01030 R S R I R S S S R R R 15-AB01290 R R I I R R R S R R R 16-AB00831 R S S R R S S R S R S 16-AB01081 R S S S R S S S S R S 16-AB01700 R S I I R R R R R R S 17-AB00275 R S S I R S S R R S R 15-AB00353 R S I I R S S R R S S 16-AB02049 R S S S R R S S S S S 16-AB02950 R S S S R R S S R R R 10E00195 S S S S S S S S S S S 10E00644 S S S S S S S S S S S 09E00689 R S S I S S S R R R R 14-AB02083 S S S S S S S S S S S
Legende: S: sensibel, R: resistent, I: intermediär, rot hinterlegt: sehr hohe Resistenzwerte, orange hinterlegt: hohe Resistenzwerte, grün hinterlegt: keine Resistenz
*es wurden keine Resistenzen gegen MERO (Indikator: Carbapenemasen) und TAZ festgestellt
Die Tabelle zeigt, dass vier der ausgewählten Isolate verdächtig für eine Resistenz gegenüber Extended Spektrum Beta-Laktamasen (ESBL) sind. Das Indikatorantibiotikum für ESBL-Bildner (FOT) zeigt eine deutliche Resistenz. Für die weitere Charakterisierung der ESBL-Ausprägung müsste eine zweite 96-Well-Mikrotiterplatte (EUVSEC2) nachgeschaltet werden. Die EUVSEC2-Platte enthält im Wesentlichen Antibiotika aus den Antibiotikaklassen Beta-Laktame und Carbapeneme. Auf Grund der Fragestellung in dieser Arbeit wurde die ESBL-Ausprägung nicht im Detail charakterisiert. Auffällig ist bei den MHK-Ergebnissen auch die weit verbreitete Resistenz gegen AMP, TET, NAL, SMX und TMP. Eine antimikrobielle Resistenz gegenüber AZI, CHL, CIP und GEN wurde hingegen nur in wenigen Isolaten nachgewiesen. Die Interpretation der MHK-Ergebnisse lässt vermuten, dass die Isolate nicht miteinander verwandt sind und somit keinen gemeinsamen Ursprung haben. Diese Interpretation basiert dabei auf dem Auftreten stark unterschiedlicher Resistenzprofile bei den einzelnen Isolaten. Um ausschließen
zu können, dass die variablen Resistenzprofile auf der An- bzw. Abwesenheit mobiler genetischer Elemente (z.B. Plasmide) basieren, wurden 14 der 18 Isolate weiteren Untersuchungen unterzogen. Ausgewählt wurden dafür alle Isolate mit einer Colistin-Resistenz um durch eine eingehende genetische Charakterisierung die Ursache der Resistenzausprägung feststellen zu können.
3.4 Bestimmung der verwandtschaftlichen Beziehungen der Isolate mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE)
3.4.1 Phylogenetische Verwandtschaftsanalysen auf Basis der XbaI-PFGE- Profile Über eine spezifische Behandlung mit der Restriktionsendonuklease XbaI wird das Genom eines E. coli-Isolates an 20-40 Schnittstellen mit Längenberiechen von 30-1000 kb reproduzierbar gespalten. Durch das entstehende Restriktionsmuster können Aussagen zum Grad der Verwandtschaft der untersuchten Isolate gemacht werden. Die Abbildung 1 zeigt die Restriktionsprofile der untersuchten E. coli Isolate.
Abb. 1: PFGE-Gel des XbaI-Verdaus (M= Marker; 1= 10E00132, 2= 10E00174, 3= 10E00195, 4= 10E00644, 5= 09E00689, 6= 09E01748, 7= 14-AB00866, 8=14-AB01030, 9= 14-AB02083, 10= 14-AB03498, 11= 15-AB00353, 12= 15-AB01290, 13= 16-AB01081, 14= 16-AB01700, 15= 16-AB02049, 16= 16-AB02950, 17= 16-AB00831, 18= 17-AB00275)
Die Abbildung 1 zeigt, dass alle XbaI-Profile der untersuchten Isolate verschieden sind. Demnach besteht keine oder nur eine geringe Verwandtschaft zwischen den einzelnen Isolaten. Auffällig ist das Profil eines Isolates (14-AB03498), das im Wesentlichen kleine Restriktionsfragmente zeigt. Eine Wiederholungsprüfung dieses Isolates bestätigte das o.g. ungewöhnliche Restriktionsprofil. Ein entsprechendes Ergebnis war zu erwarten, da alle Stämme aus verschiedenen Matrizen stammen und in unterschiedlichen Jahren isoliert wurden (Tab. 12). Die Ergebnisse zeigen, dass die Isolate nicht von einer klonalen E. coli Linie abstammen können. Somit kann vermutet werden, dass die starke Resistenzausprägung entweder durch mobile genetische Elemente hervorgerufen wird oder dass sich verschiedene Isolate diese stark ausgeprägte Resistenzeigenschaft evolutionär parallel entwickelt haben. Um zu prüfen, ob die Isolate ggf. ähnliche Plasmide aufweisen, die mit einer Colistin-Resistenzausbildung verbunden sein können, wurden S1-PFGE Analysen durchgeführt.
3.4.2 Bestimmung extrachromosomaler Elemente in den Escherichia –coli -Isolaten mittels S1-Nuklease-PFGE
Wie in der Einleitung bereits dargestellt, kann eine Resistenz gegenüber Colistin chromosomal oder plasmidal begründet sein. Da eine plasmidal-kodierte Colistin-Resistenz eine größere Bedeutung für die Übertragung auf andere Bakterien hat, wurden Untersuchungen durchgeführt, ob die ausgewählten Isolate über mobile genetische Elemente (Plasmide) verfügen. Die weitere Charakterisierung vorhandener Plasmide sollte zeigen, ob die Resistenz plasmidkodiert ist. Durch die Behandlung des bakteriellen Genoms mit der S1-Nuklease wird die chromosomale DNA abgebaut und die zirkuläre, plasmidale DNA des Bakteriums bleibt länger erhalten. Nach der Behandlung können Plasmide als visuelle Banden identifiziert werden. Die Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse des S1-Verdaus.
Abb. 2: PFGE-Bild des S1-Verdaus (M= Marker; 1= 10E00132, 2= 10E00174, 3= 10E00195, 4= 10E00644, 5= 09E00689, 6= 09E01748, 7= 14-AB00866, 8=14-AB01030, 9= 14-AB02083, 10= 14-AB03498, 11= 15-AB00353, 12= 15-AB01290, 13= 16-AB01081, 14= 16-AB01700, 15= 16-AB02049, 16= 16-AB02950, 17= 16-AB00831, 18= 17-AB00275)
Die Abbildung 2 zeigt, dass 12 von 18 Isolaten mindestens ein Plasmid enthalten. Eine Übersicht zur Anzahl und Größe der identifizierten Plasmide ist in Tabelle 14 dargestellt.
Tab. 14: Übersicht der Ergebnisse des S1-Verdaus
Stammnummer Zahl der Plasmide Größe der Plasmide
14-AB03498 2 <104,5 kb
14-AB00866 3 ca. 170 kb, ca. 104 kb, <104 kb
09E01748 1 ca. 104 kb
10E00174 9 ca 350 kb, ca. 170 kb, ca. 104 kb, <104 kb 14-AB01030 4 ca 335,6 kb, ca. 170 kb, <104 kb 15-AB01290 3 ca 138 kb, ca. 104 kb, <104 kb 16-AB00831 4 ca. 104 kb, <104 kb 16-AB01700 7 ca. 310 kb, ca 138 kb, <104 kb 17-AB00275 1 ca. 170 kb
15-AB00353 4 ca. 170 kb, ca. 104 kb, <104 kb
16-AB02950 4 ca. 310 kb, ca 138 kb
09E00689 2 ca. 216 kb, <104 kb
10E0195 1 ca. 104 kb
10E00644 2 ca. 104 kb, <104 kb
Legende: rot hinterlegt: sehr hohe Resistenzwerte, orange hinterlegt: hohe Resistenzwerte, grün hinterlegt: keine Resistenz
Die Tab. 14 zeigt, dass sich der Anteil der Plasmide in den Stämmen stark unterscheidet. Es erscheint somit unwahrscheinlich, dass die Isolate über ein ähnliches Plasmid verfügen, dass für die Colistin-Resistenzausprägung verantwortlich ist. Auf Grund des Vorkommens mehrerer Plasmide in den Isolaten muss jedoch noch geklärt werden, welches Plasmid die genetische Resistenzdeterminante trägt. Um eine Vorauswahl treffen zu können, welche Plasmide für eine Colistin-Resistenz verantwortlich sind, wurden die bioinformatischen Ergebnisse zur Auswertung herangezogen. Eine ausführliche Übersicht zur bioinformatischen Auswertung findet sich im Kapitel 3.6.
Die nachfolgende Tabelle 15 zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse der S1-PFGE und der bioinformatischen Auswertung in Bezug auf das Vorhandensein des mcr-1 Gens und die Plasmide und deren Übertragbarkeit.
Tab. 15: Zusammenfassung der Ergebnisse der S1-PFGE und bioinformatischen Auswertung in Bezug auf die Übertragbarkeit eines Plasmids
Stammnummer mcr-Gen Plasmid S1-Gel Übertragbares Plasmid
14-AB01030 mcr-1 + + 15-AB00353 mcr-1 + + 15-AB01290 mcr-1 + - 16-AB00831 mcr-1 + + 16-AB01081 mcr-3 - -/+ 16-AB01700 mcr-1 + + 16-AB02950 mcr-1 + +
Legende: orange hinterlegt: hohe Resistenzwerte, + = vorhanden, - = nicht vorhanden
Der Tabelle 15 ist zu entnehmen, dass nur sechs der 14 Stämme das mcr-1 -Gen tragen. Diese sechs Stämme enthalten mindestens ein Plasmid. Zur weiteren Charakterisierung der Plasmide, wurde von den Stämmen 14-AB01030, 15-AB-00353, 15-AB01290, 16-AB00831, 16-AB01700 und 16-AB02950 eine Plasmidextraktion mit dem „Agencourt® CosMCPrep® Mini Kit“ durchgeführt. Durch die Bereitstellung der Plasmid-DNA (pDNA) sollte genetisches Material gewonnen werden, dass zur gezielten Übertragung (Transformation) in E. coli geeignet ist.
3.4.3 Untersuchungen zur Transferierbarkeit von Plasmiden mit Colistin-Resistenzgendeterminante
Die extrahierte pDNA wurde mittels Elektroporation in einen elektrokompetenten E. coli Stamm DHB10 eingebracht. Die Zellen wurden nach einer Wachstumsperiode von 60 min auf ein Vollmedium mit Colistin zur Selektion positiver Transformanten aufgebracht. Kolonien, die nach Selektion auf den Agarplatten isoliert werden können, sollten ein Plasmid tragen, das ein Gen für eine Colistin-Resistenzvermittlung trägt. Zur weiteren Bestätigung des pDNA-Transfers ist eine S1-PFGE notwendig, die zeigen soll, dass die Transformanten ein Plasmid enthalten. In Abbildung 3 sind die Ergebnisse der Untersuchung gezeigt.
Abb. 3: PFGE-Bild des S1-Verdaus (M= Marker, 1= AB01030_1, 2= AB01030_2, 3= 14-AB01030_3, 4= 15-AB-00353_1, 5= 15-AB-00353_2, 6= 15-AB-00353_3, 7= 15-AB01290_1, 8= 15-AB01290_2, 9= 15-AB01290_3, 10= AB00831_1, 11= AB00831_2, 12= AB00831_3, 13 =AB01700_1, 14= AB01700_2, 15= AB01700_3, 16= 16-AB02950_1, 17= 16-AB02950_2, 18= 16-AB02950_3)
Wie in der Abbildung 3 zu erkennen ist, sind keine Plasmide in den jeweiligen Stämmen zu erkennen. Die Bakterien weisen auf den Colistin-Agarplatten eine Resistenz auf, allerdings sind die Resistenzplasmide in dem Laborstamm DHB10 wahrscheinlich nicht stabil oder werden nicht repliziert. Aus Zeitgründen konnten kein alternativer E. coli Stamm getestet werden. Diese Untersuchungen werden jedoch auch nach Fertigstellung der Arbeit fortgeführt.
3.5 Bioinformatische Auswertung der Escherichia coli Genome
Die Analyse der Gesamtgenomdaten wurde durchgeführt, um genetische Detailuntersuchungen zu ermöglichen. Die Genomdaten wurden zur Bestimmung des phylogenetischen Verwandtschaftsgrades (allgemeine Genomcharakteristika sowie MLST-, Sero- & Fim-Typ) verwendet, sowie zur Identifizierung von Resistenz- und Virulenzgenen.
Tab. 16A: Übersicht zu den Genomeigenschaften der ausgewählten Stämme Stamm-nummer 09E0 1748 14 -AB00866 10E0 0132 14 -AB03498 10E0 0174 14 -AB01030 15 -AB00353 Contigs Spades 34 208 25 25 191 131 159 Genomgröße (bp) 5.222.239 5.267.980 3.753.430 3.753.430 5.288.929 5.456.540 5.267.896 GC Gehalt (%) 55,44 50,75 51,14 51,14 50,50 50,30 50,14 Gene 4.954 5.748 3.592 3.592 5.689 5.856 5.768 CDS 4.954 5.646 3.498 3.498 5.579 5.749 5.655 Gene (kod.) 4.771 5.331 3.433 3.433 5.260 5.495 5.350 CDS (kod.) 4.771 5.331 3.433 3.433 5.260 5.495 5.350 Genes (RNA) 111 102 94 94 110 107 113 rRNAs (5S, 16S, 23S) 7, 3, 9 8, 3, 3 9, 5, 2 9, 5, 2 8, 4, 9 8, 7, 3 6, 7, 8 tRNAs 78 78 74 74 80 84 81 ncRNAs 14 10 4 4 9 5 11 Pseudogene (Total) 72 315 65 65 319 254 305 Pseudogene (ungewöhnl. Seitenkette) 0 0 0 0 0 0 0 Pseudo gene (Frameshift) 38 113 30 30 96 108 103 Pseudogene (unvollst.) 32 167 41 41 186 123 172 Pseudogene (interner Stop) 22 84 13 13 73 55 75 Pseudogene (versch. Probleme) 18 47 17 17 34 32 41 CRISPR Arrays - 1 - - 2 - 2
Legende: rot hinterlegt: sehr hohe Resistenzwerte, orange hinterlegt: hohe Resistenzwerte; - = nicht vorhanden
Tab. 16B: Übersicht zu den Genomeigenschaften der ausgewählten Stämme Stamm-nummer 15 -AB01290 16 -AB00831 16 -AB01081 16 -AB01700 16 -AB0 2950 16 -AB02049 17 -AB00275 Contigs Spades 150 158 100 135 180 64 173 Genomgröße (bp) 5.118.816 5.327.458 4.566.714 5.313.174 5.410.870 5.833.048 5.168.653 GC Gehalt (%) 50,64 50,62 58,69 50,35 50,54 53,68 50,77 Gene 5.520 5.704 4.324 5.634 5.807 5.447 5.506 CDS 5.414 5.594 4.188 5.534 5.695 5.351 5.402 Gene (kod.) 5.100 5.324 4.114 5.245 5.404 5.258 5.123 CDS (kod.) 5.100 5.324 4.114 5.245 5.404 5.258 5.123 Genes (RNA) 106 110 136 100 112 96 104 rRNAs (5S, 16S, 23S) 6, 3, 6 7, 4, 8 9, 8, 3 9, 6, 3 7, 4, 8 6, 5, 2 8, 3, 3 tRNAs 81 80 112 77 82 77 82 ncRNAs 10 11 4 5 11 6 8 Pseudogene (Total) 314 270 74 289 291 93 279 Pseudogene (ungewöhnl. Seitenkette) 0 0 0 0 0 0 0 Pseudo gene (Frameshift) 93 102 21 119 97 40 136 Pseudogene (unvollst.) 197 158 44 144 163 58 121 Pseudogene (interner Stop) 75 70 17 65 85 23 80 Pseudogene (versch. Probleme) 50 53 8 38 51 24 53 CRISPR Arrays 2 2 - - 2 1 2
Legende: orange hinterlegt: hohe Resistenzwerte; - = nicht vorhanden
Die Zusammenfassung der Genomeigenschaften zeigt, dass die Isolate z.T. über beträchtliche Unterschiede im ihrer Genomgröße sowie in der Anwesenheit von Genen, kodierenden Sequenzen, RNAs, CRISPR-Array verfügen.
In weiteren Untersuchungen wurden die Stämme Web-basierten bioinformatischen Auswertungen zur Bestimmung ihres MLST-, Sero- und Fim-Typs unterzogen. Die Ergebnisse sind in Tab. 17A und B aufgeführt.
Tab. 17A: Übersicht zu den nachgewiesenen MSLT-, Sero- und Fim-Typen der sequenzierten Isolate Stamm-nummer 09E0 1748 14 -AB00866 1 0E00 132 14 -AB03498 10E0 0174 14 -AB01030 15 -AB00353
MLST-Typ Unbek. ST-5420 Unbek. Unbek. ST-1721 ST-131 ST-10
S
er
ot
yp
H-Typ - fliC (100%) - - fliC (98,4%) fliC (100%) fliC (98,5%)
O-Typ - wzx (95,4%)
wzy (93,7%)
- - - wzx (96,0%)
wzy (95,7%) -
Fim-Typ Unbek. 27 (100%) Unbek. Unbek. 54 (100%) 22 (100%) 24 (100%)
Legende: rot hinterlegt: sehr hohe Resistenzwerte, orange hinterlegt: hohe Resistenzwerte; - = nicht vorhanden
Tab. 17B: Übersicht zu den nachgewiesenen MSLT-, Sero- und Fim-Typen der sequenzierten Isolate Stamm-nummer 15 -AB01290 16 -AB00831 16 -AB01081 16 -AB01700 16 -AB02950 16 -AB02049 17 -AB00275
MLST-Typ ST-1716 ST-1196 Unbek. ST-428 ST-746 Unbek. ST-117
S
er
ot
yp
H-Typ fliC (99,9%) fliC (99,7%) - fliC (100%) fliC (99,8%) - fliC (100%)
O-Typ wzx (100%) wzy (100%) wzy (95.3%) wzx (99,8%) wzy (99,6%) - wzx (100%) - - wzm (99,3%) wzt (99,5%)
Fim-Typ 54 (100%) 31 (100%) Unbek. 22 (100%) 54 (100%) Unbek. 97 (100%)
Legende: orange hinterlegt: hohe Resistenzwerte; - = nicht vorhanden
Wie den Tabellen 17A und 17B zu entnehmen ist, sind alle MLST-Typen unterschiedlich. Auch bei den Serotypen treten keine gemeinsamen Gene in gleicher Anzahl und Ausprägung auf. Der Fim-Typ 54 konnte bei drei Stämmen (10E00174, 15-AB01290 und 16-AB02950) nachgewiesen
werden. Da allerdings keine anderen Gemeinsamkeiten oder ähnliche Restriktionsmuster (PFGE) auftreten, kann eine nahe Verwandtschaft weitestgehend ausgeschlossen werden.
Tab. 18A: Übersicht zum Nachweis von Resistenzdeterminanten in den Genomen der sequenzierten Stämme Stamm-nummer 09E0 1748 10E0 0132 14 -AB03498 10E0 0174 14 -AB01030 15 -AB00353 Re sis te n zge n e Amino-glycoside aac(6')-Ic (85,9%) - - aph(3')-Ia (100%) aph(6)-Id (100%) aadA5 (100%) aph(3'')-Ib (100%) aadA2 (100%) aadA1 (100%) aadA1 (99%) ß-Laktame blaSST-1 (78%) blaMOR-2 (97,2%) blaTEM-57 (80,8%) blaTEM-1C (100%) blaTEM-1C (100%) blaTEM-1B (100%) Fluoro-quinolone oqxB (80,1%) oqxB (81.9%) QnrB65 (79,4%) - QnrD (100%) - QnrB19 (100%) - Phenicole - catA2 (96,3%) catB4 (78,3%) catA1 (99,9%) cmlA1 (99,7%) cmlA1 (100%) catA1 (99,9%) catB4 (99,1%) Tetra-cycline - - tet(B) (100%) tet(34) (84,8%) tet(M) (99,2%) tet(B) (100%) tet(34) (84,8%) tet(M) (99,2%) tet(34) (84,8%) Sulfo-namide - - - sul2 (100%) sul1 (100%) sul3 (100%) sul1 (100%) sul3 (100%) Trimetho-prim - - - dfrA1 (100%) dfrA1 (100%) - Colistin - - - - mcr-1 (100%) mcr-1 (100%) MLS Gene - - - mef(B) (100%)
Legende: rot hinterlegt: sehr hohe Resistenzwerte, orange hinterlegt: hohe Resistenzwerte
* zusätzlich wurde auf folgende Resistenzgene getestet: Fosfomycin Gene, Fusainsäure Gene, Nitroimidazole Gene, Oxazolidinone Gene, Rifampicin Genes und Glycopeptid Gene, welche nicht vorkommen; ** das 14-AB00866 Genom weist keine Resistenzgene auf
Tab 18B: Übersicht zum Nachweis von Resistenzdeterminanten in den Genomen der sequenzierten Stämme Stamm- nummer 15 -AB01290 16 -AB00831 16 -AB01081 16 -AB01700 16 -AB02950 17 -AB00275 Re sis te n zge n e Amino-glycoside aadA1 (100%) aph(4)-Ia (100%) aadA2 (100%) aac(3)-IVa (99,9%) aph(6)-Id (99,8%) strA (100%) - - aph(3')-Ia (99,3%) aac(3)-IIa (100%) aph(6)-Id (100%) strA (100%) aadA2 (100%) aadA1 (100%) aadA1 (100%) aadA2 (100%) aph(3'')-Ib (100%) aph(6)-Id (100%) ß-Laktame blaCTX-M-1 (100%) blaTEM-1A (100%) blaTEM-1B (100%) blaMOX-6 (84,5%) blaOXA-12 (97%) blaCEPH-A3 (95,9%) blaSHV-12 (100%) blaTEM-1A (100%) blaTEM-1A (100%) blaTEM-1B (100%) blaCTX-M-1 (100%) blaTEM-1B (100%) Fluoro-quinolone QnrS1 (100%) QnrB19 (100%) - - - - Phenicole - catB4 (99,1%) cmlA1 (99,8%) catA1 (99,8%) catB4 (99,1%) cmlA1 (99,8%) - Tetra-cycline tet(B) (100%) tet(34) (84,8%) tet(34) (84,8%) tet(A) (100%) tet(E) (99,9%) tet(A) (99,9%) tet(34) (84,8%) tet(34) (84,8%) tet(A) (100%) - Sulfon-amide sul1 (100%) sul2 (100%) - - sul3 (100%) sul3 (100%) sul2 (100%) sul2 (100%) Trimeth-oprim dfrA12 (100%) - - - dfrA1 (100%) dfrA5 (100%) Colistin mcr-1 (100%) mcr-1 (100%) mcr-3.6 (79,8%) mcr-3.4 (95,2%) mcr-3.6 (94,9%) mcr-1 (100%) mcr-1 (100%) -
MLS Gene mph(A) (100%) - - mef(B) (100%) - -
Legende: Rot hinterlegt: sehr hohe Resistenzwerte, orange hinterlegt: hohe Resistenzwerte * zusätzlich wurde auf folgende Resistenzgene getestet: Fosfomycin Gene, Fusainsäure Gene, Nitroimidazole Gene, Oxazolidinone Gene, Rifampicin Genes und Glycopeptid Gene, welche nicht vorkommen; ** das 6-AB02049 Genom weist keine Resistenzgene auf
Die Ergebnisse der bioinformatischen Auswertung zeigen, dass eine Vielzahl unterschiedlicher Resistenzgene in den Genomen nachgewiesen werden konnten. Interessanterweise konnten jedoch nur für sieben Isolate Colistin-Resistenzgene identifiziert werden. Beim Nachweis dieser Resistenzen traten primär die Determinanten mcr-1 und ein einmal die Determinante mcr-3 auf. Bei der detaillierten Untersuchung der mcr-3 Determinante des Isolates 16-AB01081 wurde festgestellt, dass das Gen vermutlich nicht intakt ist. Neben zahlreichen Veränderungen, die im Vergleich zur Referenzsequenz festgestellt wurden, konnte auch nicht die gesamte kodierende Sequenz des Gens nachgewiesen werden. Es besteht darüber hinaus die Möglichkeit, dass es sich bei der Veränderung um eine neuartige Variante bzw. ein neuartiges mcr-Gen handelt. Hierzu sind weitere Untersuchungen nötig, die nicht Gegenstand dieser Arbeit sind.
Da nicht in allen Genomen ein Colistin-Resistenzgen identifiziert werden konnte, wurden die Sequenzdaten auch hinsichtlich chromosomaler Veränderungen im Genon analysiert, die nachweislich einen Einfluss auf die Colistin-Resistenz der Isolate haben können. Entsprechende Gene sind die LPS-Struktur-beeinflussenden Determinanten pmrA und pmrB. Die Ergebnisse der Analysen sind in Tab. 19A und B zusammengefasst.
Tab. 19A: Übersicht der Ergebnisse der bioinformatischen Auswertung in Bezug auf Resistenzgene S tam m -n u m m er 14 -AB00866 14 -AB03498 10E0 0174 14 -AB01030 15 -AB00353 Resistenz-Gene - - - mcr-1 mcr-1 Chrom osomale M u tat ion pmrA B A C C B pmrB B A B C B Plasmid S1-Gel + + + + + Plasmid-Finder IncB/O/K/Z (99,33) IncFIB (98,4%) Col (92%) IncFIA (99,7%) Col (89,81) ColRNAI (92,2%) Col (92,4%) Col (91,3%) IncFII (94,7%) Col (93,2%) Col3M (98,1%) ColE10 (85,9%) ColE10 (83,7%) IncHI1B (100%) ColRNAI (92,2%) ColRNAI (91,1%) IncL/M (99,5%) IncX3 (84,3%) IncX1 (98,9%) ColRNAI (90,4%) IncY (98,9%) IncFII (100%) ColRNAI (91,7%) ColRNAI (89,4%) ColRNAI (92,9%) IncHI1A (99,8%) IncHI2A (99,5%) ColRNAI (88,3%) Col (92%) Col (94,3%) IncFIB (98,4%) RepA (80,2%) IncHI2 (100%) ColRNAI (90,8%) IncFII (100%) IncX4 (100%) IncX1 (98,7%) IncI2 (100%) Col (94,4%) IncFII (94,3%) p0111 (98,9%) IncX3 (84,3%)
Legende: rot hinterlegt: sehr hohe Resistenzwerte, orange hinterlegt: hohe Resistenzwerte, A = kein Gen gefunden, B = keine Mutationen gefunden, C = keine bekannten Mutationen gefunden *09E01748, 10E00132 keine Gene gefunden, keine Gene bei Plasmid-Finder gefunden
Tab. 19B: Übersicht der Ergebnisse der bioinformatischen Auswertung in Bezug auf Resistenzgene S tam m -n u m m er 15 -AB01290 16 -AB00831 16 -AB01700 16 -AB02950 17 -AB00275 Resistenz-Gene mcr-1 mcr-1 mcr-1 mcr-1 - Chrom osomale M u tat ion pmrA B B C B B pmrB B C C B C Plasmid S1-Gel + + + + + Plasmid-Finder Col (94,4%) IncN (99,3%) IncP1 (80,2%) IncI1 (99,3%) IncR (100%) Col (92%) IncX4 (100%) ColRNAI (92,7%) ColRNAI (90,3%) IncN (99,3%) ColRNAI (88,3%) Col (94,9%) IncFII (98,1%) IncX1 (98,7%) IncX3 (84,4%) IncR (100%) IncX4 (100%) FIA (93,4%) ColRNAI (92,7%) IncFIB (98,4%) IncFIC (95,6%) IncI1 (100%) IncFIB (78,7%) ColRNAI (92,2%) Col (94,2%) IncFII (96,6%) IncHI2A (99,5%) p0111 (98,5%) IncFIB (99,8%) IncN (99,8%) RepA (80,2%) IncHI2 (100%) IncHI1B (93,5%) IncI1 (99,3%) IncFIB (78,7%) IncFIB (98,4%) Col (91,8%) IncQ1 (100%) IncFIB (98,4%) ColRNAI (96,1%) IncFII (100%)
Legende: orange hinterlegt: hohe Resistenzwerte, B = keine Mutationen gefunden, C = keine bekannten Mutationen gefunden