Alle Medien, Zusätze, Waschpuffer (PBS) und Trypsin-Lösungen für die Zellkultur wurden

(1)

5. Material

5.1. Zelllinien und Nährmedien:

HEK29-Zellen, humane Nieren-Zelllinie, ATCC-Nummer: CRL-57 (ATCC, Rockville, USA)

Nährmedium: „Dulbecco�sminimalessentialmedium“

0%fetalesKälberserum(FCS)

20mMGlutamin

xNicht-essentielleAminosäuren

SH-SY5Y-Zellen, humane Neuroblastoma-Zelllinie, ATCC-Nummer: CRL-2266 (ATCC, Rockville,USA)

Nährmedium: 50%„Dulbecco�sminimalessentialmedium“

50%HAM�sF2

0%FCS

20mMGlutamin

20mMNatriumpyruvat

xNicht-essentielleAminosäuren Selektionsmedium: plus250µg/mlHygromycin

AlleMedien,Zusätze,Waschpuffer(PBS)undTrypsin-LösungenfürdieZellkulturwurden vondenFirmenPAA,USAoderBiochrom,Berlinbezogen.EswurdenZellkulturschalen vonderFirmaTPP,Schweizverwendet.

5.2. Bakterienstämme DH5a(Invitrogen,Karlsruhe)

Nährmedium:LB-Medium Top0(Invitrogen,Karlsruhe)

Nährmedium:LB-Medium CH-Blue(Bioline,Mannheim)

Nährmedium:LB-Medium FHK2,(BedouelleandDuplay,988)

Nährmedium:0gHefe-Extrakt,6gBakto-Trypton,5gNaCl,auf800mlH₂Oplus 2%Glukoseund0,05%–0,2%L-Arabinose

PD28,(Kolmaretal.,994)

Nährmedium:M9-Minimalmedium:xM9-Salze,0,4%Maltose,80µg/mlLeucin, 80µg/mlThreonin,2mMMgSO₄

M9-Salze:2,8gNa₂HPO₄x7H₂O,gKH₂PO₄,0,5gNaCl,gNH₄Clauf200ml H₂O

(2)

5.3. Plasmid-Vektoren

5...Klonierungsvektoren

pBluescriptIIKS(+)(Stratagene,LaJolla,USA)Ampicillin-Resistenz 5..2.VektorenzurProteinexpressionineukaryotischenZellen

pCEP4(Invitrogen,Karlsruhe)Amicillin-undHygromycin-Resistenz

pcDNA3.1-YFP (Invitrogen, Karlsruhe) modifiziert von AG Prof. Michael Schaefer InstitutfürPharmakologie,CharitéBerlin

pcDNA3.1-CFP (Invitrogen, Karlsruhe) modifiziert von AG Prof. Michael Schaefer, InstitutfürPharmakologie,CharitéBerlin

5...VektorenzurProteinexpressioninbakteriellenZellen

pToxRV,(GurezkaandLangosch,200),Kanamycin-Resistenz 5.4. Primer

Tabelle 1: Auflistung der für Klonierungen verwendeten Primer (Sigma-Aldrich, Deisenhofen) mitAngabederPrimerbezeichnungundderNukleotidsequenz.

Primer Sequenz(5‘-‘)

Flag-R GCTGTGGCGGGGGTCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTTCTGCAT CTGCTCAAAG

EcoRI-F AAGATGGATGCAGAATTCCGACATGAC KpnI-F CTAGAAGCTGGGTACCGGGGGAGACGG EBV-R GTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATG APP-206 CCTCCTCGGCCTCGTCACGTGTTCAATATGC G25A-F GTTGATGTGGCTTCAAACAAAGG

G29A-F TTCAACAAAGCTGCAATCATTGG GA-F GCAATCATTGCACTCATGGTGG

GI-F GTTCAAACAAAGGTGCAATCATTATACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGC IV-F CAAAGGTGCAGTCATTGGACTCATGG

(3)

5.5. Erzeugte Konstrukte

Tabelle 2: Auflistung der erzeugten Konstrukte mit Angabe des Vektors, des eingefügten FragmentsundderMutation.wt:Wildtyp.

GI-F GCAATCATTATACTCATGGTGGGCGG GI-R CCGCCCACCATGAGTATAATGATTGC Tox_IV_F GCTAGCGGTGCAGTCATTGGACTCATGG Tox_IV_R CCATGAGTCCAATGACTGCACCGCTAGC Tox_I2V_F GCGGTGCAATCGTTGGACTCATGGTGG Tox_I2V_R CCACCATGAGTCCAACGATTGCACCGC

FRET-NotI-F TTATATATATATTGCGGCCGCGGACGCGGCGGATCCCACTCG FRET-XbaI-R GCCCTTGCTCACCTCTAGAACGTTCTGCATCTGCTCAAAGAAC

Vektor Insert Mutation

pToxRV Aß25-42 wt

pToxRV Aß29-42 wt,G29A,IV,I2V,GA,G29/A,

GI,L4A,G7A,G8A

pToxRV Aß29-52 wt

pToxRV Aß9-52 wt

pToxRV Aß-4 wt

pToxRV PS--TMS6 wt

pToxRV GpA wt,G8A

pcDNA.-YFP APP695 wt,GA,G29/A,GI

pcDNA.-CFP APP695 wt,GA,G29/A,GI

pcDNA.-YFP SPA4CT wt,GA,G29/A,GI

pcDNA.-CFP SPA4CT wt,GA,G29/A,GI

pCEP4 APP695-N-Myc-C-Flag wt, L7C, G25A, G29A, IV, I2V, GA,L4A,G29/A,GI

pCEP4 SPA4CT-C-Flag wt,L7C,G25A,G29A,GA,G29/A, GI,L7C/GI

pCEP4 APP695sw-N-Myc-C-Flag wt,GA,G29/A,GI pCEP4 APP695arc-N-Myc-C-Flag wt,GA,G29/A,GI

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5.6. Antiseren und Antikörper

Folgende Abkürzungen bedeuten WB: Western Blot; IP: Immunpräzipitation; IF:

Immunfluoreszenz;

W0-2: monoklonalerMaus-Antikörper(TheGeneticsCompany(TGC));EpitopAß 5–8, humanspezifisch, (Ida et al., 1996)

WB:0,0µg/ml IP:0,5µg/ml

22C: monoklonalerMaus-Antikörper;Epitop:APP66–8,(Hilbichetal.,99)

WB::0000

G2-0: monoklonalerMaus-Antikörper(TGC);Epitop:C-TerminusvonAß40

ELISAnachAngabenTGC

G2-: monoklonalerMaus-Antikörper(TGC);Epitop:C-TerminusvonAß42 ELISAnachAngabenTGC IP:0,5µg/ml

BAP-29: monoklonalerMaus-Antikörper(M.Brockhaus,Roche);Epitop:C-Terminus

vonAß8

ELISA:8µg/ml

Anti-Flag-„tag“:monoklonalerMaus-Antikörper(Sigma-Aldrich);Epitop:DYKDDDDK

WB:0,25µg/ml IF:0,5µg/ml

Anti-Myc-„tag“:monoklonalerMaus-Antikörper(CellSignaling,USA);EpitopEQKLISEEDL

ELISA::2000

40090: polyklonalerKaninchen-Antikörper;wurdehergestelltdurchImmunisierung mitinHeferekombinantexprimierterAPP-EktodomäneAPP8–50 (Schmecheletal.,2004)

IF::00

27576: polyklonalerKaninchen-Antikörper;hergestelltdurchImmunisierungmit synthetischemPeptid,SequenzAPP648-695,AGProf.Dr.Multhaup IP:5µg/ml

879: polyklonalerKaninchen-Antikörper;Epitop:C-TerminussAPPß, P.Paganetti,Novartis

WB::000

8-: polyklonalerKaninchen-Antikörper;hergestelltdurchImmmunisierung mitsynthetischemAß40,AGProf.Dr.Multhaup

IP:5µl/ml

Anti-MBP: polyklonalerKaninchen-Antikörper(NewEnglandBiolabs,USA);

WB::0000

(5)

2nd-anti-Kaninchen-Cy:mitdemFluorophorCymarkierterZweitantikörperzur Fluoreszenz-Detektion polyklonaler Erstantikörper in der Immunfluoreszenz

(Dianova)

IF::400

2nd-anti-Maus-Alexa-Fluor594:mitdemFluorophorAlexa-Fluor594markierter ZweitantikörperzurFluoreszenz-DetektionmonoklonalerErstantikörperin

der Immunfluoreszenz (Invitrogen, Karlsruhe)

IF::600

5.7.AllgemeineLaborchemikalien

Alle nicht gesondert aufgeführten Chemikalien zum Ansetzen von Puffern und ReaktionslösungenwurdenvonSigma-Aldrich,Deisenhofen,RothGmbH,Karlsruheoder Merck,Darmstadtinderpro analysisQualitätsstufebezogen.

5.8. Enzyme und „Kits“

Alle in dieserArbeit verwendeten und nicht gesondert aufgeführten Enzyme und „Kits“

wurden von folgenden Firmen bezogen und nachAngaben des Herstellers verwendet:

Macherey-Nagel,Düren;Biozym,hess.Oldendorf;Qiagen,Hilden;TheGeneticsCompany, Schlieren, Schweiz; Stratagene, USA; Invitrogen, Karlsruhe. DNA-Polymerasen und RestriktionsenzymewurdenvonNewEnglandBiolabs,USAbezogen.DNA-Ligasenwurden vonderFirmaBioline,MannheimoderNewEnglandBiolabs,USAbezogen.

5.9. Allgemeine Verbrauchsmaterialen

Plastikwaren wie Reagiergefäße, Mikrotiterplatten und Petrischalen wurden von Sarstedt,Nümbrechtbezogen.MikrotiterplattenfürELISAwurdenvonNunc,Wiesbaden, PipettenspitzenvonSteinbrenner,WiesbadenoderRothGmbH,Karlsruhebezogen.Es wurden Röntgenfilme Hyperfilm ECL von Amersham Pharmacia, GB verwendet.

5.10. Pufferlösungen

AllenichtgesondertaufgelistetenPufferlösungenwurdennachSambrooketal.hergestellt (Sambrook,989).

5.0..PufferfürdasToxR-System

Z-Puffer:60mMNa₂HPO₄x7H₂0,40mMNaH₂PO₄xH₂0,0mMKCl,mMMgSO₄x7 H₂O

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Z-Puffer/Chloroform:20mlZ-Puffer,2mlChloroform,200µlß-Mercaptoethanol Z-Puffer/SDS:20mlZ-Puffer,,6ml20%SDS

ONPG-Lösung:0mlZ-Puffermit40mgo-Nitro-phenyl-Galaktoside(ONPG) 5.11. Geräte

-BegasungsbrutschrankHeraCell240(Heraeus-Kendro,USA) -SterileWerkbankHerasafe(Heraeus-Kendro,USA)

-Pipetten,000µl,200µl,20µl,0µlund2µl(Gilson,USA) -EntwicklermaschineCawomat2000IR(Cawo,Deutschland)

- Massenspektrometer Bruker Reflex, MALDI-TOF-Massenspektrometer mit Reflektor undkontinuierlicherExtraktion(BrukerDaltonic,Bremen)

-PhotometerSmartSpec000(Biorad,München) -ThermomixerComfort(Eppendorf,Hamburg) -PCR-MaschineMastercycler(Eppendorf,Hamburg) -AnalysenwaageBP2D(Sartorius,Göttingen) -VakuumkonzentratorSpeedVac(Savant)

-Li-Cor4000Flachgelsequenzer(Li-CorBiosciences,Lincoln,NE) -MikrotiterplattenlesegerätAnthosht2(Anthos,Salzburg)

-SchüttelinkubatorTR-225HT(InforsAG,Bottmingen) 5.12. Software

5.2..Bildverarbeitung

AdobePhotoshopCS2,AdobeIllustratorCS2 5.2.2.TextverarbeitungundLayout

MicrosoftWord2004fürMacmitEndNote8.0,AdobeInDesignCS2 5.2..Datenauswertung

MicrosoftExel2004fürMac