Abschlussarbeit Postgradualstudium Toxikologie der Universität Leipzig

Abschlussarbeit

Postgradualstudium Toxikologie

der Universität Leipzig

Vorgelegt von: Dierk Kratzin, Diplom-Biochemiker Würzburg, den 08.07.03

HNE ist neben Malondialdehyd ein Hauptprodukt der Lipidperoxidation von ω−6 und ω-3 ungesättigten Fettsäuren. Mit der Base Guanin bildet HNE durch Addition an des- sen exozyklische Aminogruppe und anschließende Ringbildung das DNA-Addukt HNE-dG. Dieses DNA-Addukt kann durch die gängigen DNA-Reparaturmechanismen kaum eliminiert werden und daher, nach einer späteren Zellteilung, zu genetischen Veränderungen (Mutationen) führen. HNE-dG ist ein für die Lipidperoxidation spezifi- sches DNA-Addukt. Das ganze HNE-Molekül lagert sich in der oben beschriebenen Weise an die Base Guanin an, auf physiologischem Wege kann HNE nach bisherigem Kenntnisstand nicht gebildet werden. Die Lipidperoxidation ist ein weitgehend patho- logischer Prozess und tritt auf wenn Zellen bzw. Gewebe mit einem Überangebot an reaktiven Sauerstoffspezies konfrontiert sind. Einen derartigen Zustand bezeichnet man auch als oxidativen Stress. Man kann ihn v.a. dann beobachten, wenn die anti- oxidativen Schutzmechanismen der Zellen eines Gewebes oder Organs versagen. Die HNE-dG Bildung kann aber in verringertem Ausmaß auc h in Tieren beobachtet wer- den, die keinem oxidativen Stress ausgesetzt sind. Man spricht in diesem Fall von Hin- tergrundadduktspiegeln.

Die vorliegende Arbeit berichtet über die Untersuchung von Leber- und Nierengewebe aus Ratten, die mit Speiseölen mit unterschiedlichem Anteil an ω−6 ungesättigten Fettsäuren versorgt und je eine Teilgruppe einem Selen und Vitamin E-Mangel ausge- setzt wurde. Es sollte geprüft werden, ob sich durch die Verringerung von Antioxidan- tien (hier Selen und Vitamin E) in der Nahrung die Spiegel des Biomarkers HNE-dG beeinflussen lassen.

Für die Leber konnte eine Abhängigkeit der HNE-dG Adduktspiegel von oxidativem Stress gefunden werden, in der Niere dagegen wurde ein solcher Zusammenhang nicht beobachtet.

i 1) Einleitung

1.1) Dosis-Wirkungs-Beziehung 1

1.2) Von der Dosis zur Wirkung eines Stoffes 3

1.3) Chemische Kanzerogenese 5

1.4) HNE-dG als biochemischer Marker für oxidativen Streß 7

1.5) Fragestellung und Ziel der vorliegenden Arbeit 10

2) Material und Methoden 2.1) Material 12

2.1.1) Chemikalien 12 2.1.2) Geräte 14

2.2) Methodik des ³²P-Postlabelling 14

2.2.1) DNA-Isolierung 15

2.2.2) DNA-Verdau 16

2.2.3) Anreicherung der DNA-Addukte 17

2.2.4) Vorgehensweise beim Postlabelling der DNA-Proben 17

2.2.5) Chromatographische Trennung der 3`,5´-Bisphosphate der DNA-Addukte 18

2.2.6) Auswertung der Chromatogramme im InstantImager 18

2.3) Kontrollexperimente zum ³²P-Postlabelling 22

2.3.1) Verdaukontrolle 22

2.3.2) ATP-Überschußkontrolle 22

2.4) Tierversuch 23

3) Ergebnisse 3.1) HNE-dG Adduktspiegel in der Leber von weiblichen F-344 Ratten 25

3.2) HNE-dG Adduktspiegel in der Niere von weiblichen F-344 Ratten 27

ii 4 ) Diskussion

4.1) ³²P-Postlabelling zur quantitativen Detektion von DNA-Schäden 30 4.2) Ziele des Tierversuchs 30 4.3) HNE-dG Adduktspiegel in Leber und Niere in Abhängigkeit

von der Ernährung 32 4.4) Zusammenfassung und Ausblick 34

iii

Nummer Seite

Abb.1: Dosis-Wirkungs-Kurve (lineare Auftragung) 2

Abb.2: Dosis-Wirkungs-Kurve (halblogarithmisch) 2

Abb.3: Zusammenhang zwischen Exposition und toxischer Schädigung 4

Abb.4: Tumorentstehung nach dem Tumorinitiations /-promotionsmodell 6

Abb.5: Vorgeschlagener Mechanismus zur Bildung von HNE-dG aus Linolsäure 8

Abb.6: Bildung von HNE-dG aus Desoxyguanosin und HNE 10

Abb.7: Vorgehensweise beim Postlabelling von DNA-Addukten 15

Abb.8: Chromatographische Trennung der HNE-dG Addukte 19

Abb.9: Beispiel für eine Kalibriergerade von HNE-dG 20

Abb.10: Dünnschichtchromatogramm einer untersuchten DNA-Probe aus der Leber 21

Abb.11: Verdaukontrolle 23

Abb.12: ATP-Überschußkontrolle 24

Abb.13: Ergebnisse der HNE-dG Adduktspiegelbestimmungen in der Leber von F 344 Ratten 28

Abb.14: Ergebnisse der HNE-dG Adduktspiegelbestimmungen in der Niere von F 344 Ratten 30

Abb.15:Selengehalt in den untersuchten Rattenlebern 32

Abb.16: Aktivität des Enzyms Glutathionperoxidase in den untersuchten Rattenlebern 32

Abb.17:Korrelation HNE-dG Adduktspiegel/Glutathionperoxidaseaktivität 33

iv DANKSAGUNGEN / WIDMUNGEN

Mein Dank gilt Herrn Prof. Eder für die Vergabe des interessanten Themas an mich.

Ebenso möchte ich mich bei den Mitgliedern der Arbeitsgruppe Eder bedanken hier zunächst bei Herrn Paul Wanek für die Einführung in die Postlabelling-Technik und die Hilfe bei der Bewältigung von diversen Softwareproblemen.

Außerdem gilt mein Dank Frau Elisabeth Weinfurtner, die sich v.a. um die Fragen der Radioaktivitätsbilanzierung kümmert und Frau Tanja Pfeuffer, die unsere Ar- beitsgruppe seit Februar diesen Jahres bei der Postlabelling-Analyse weiterer Pro- ben unterstützt.

v Abb. Abbildung

ANOVA Analysis of variance (einfaktorielle Varianzanalyse) AS Ammoniumsulfat

ATP Adenosintriphosphat

Bicin N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-glycin

cpm counts per minute (gezählte Zerfälle pro Minute) Ci Curi (Einheit für Radioaktivität)

DNA Desoxyribonukleinsäure DTT Dithiothreitol

ECD Elektrochemischer Detektor EDTA Ethylendiamintetraessigsäure Hex trans-2-Hexenal

Hex-dG Hexenaldesoxyguanosin (interner Standard) HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie HNE trans-4-hydroxy-2-nonenal

HNE-dG 1,N²-propanodesoxyguanosinaddukt des trans -4-hydroxy-2-nonenals Kcal Kilokalorien

Kg Kilogramm

LD50 Dosis, bei der 50% der Versuchstiere sterben

vi MgCl2 Magnesiumchlorid

MN Micrococcus Nuklease

32P Phosphor 32 (radioaktives Isotop des Phosphors) PNK Polynukleotidkinase

SD Standardabweichung SP Natriumphosphat

SPDE Milz-Phosphodiesterase TE Tris-EDTA-Puffer

Tris Tris[hydroxymethyl]aminomethan VK Variationskoeffizient

1) Einleitung

„Was ist das nit gifft ist? Alle Ding sind gifft und nichts ohn gifft, allein die Dosis macht dass ein Ding kein gifft ist.“ Paracelsus (1493 – 1541)

Das obige Zitat stammt von Paracelsus, dem Begründer der wissenschaftlichen Toxi- kologie, wie sie heute in Forschung und Lehre betrieben wird. Dieser Satz sagt aus, dass die giftige Wirkung eines Stoffes eine Funktion seiner Dosis ist d.h., dass dieser Stoff ab einer bestimmten aufgenommenen Menge die physiologischen Abläufe in sei- nem Zielorganismus stört bzw. diese unmöglich macht und so zu dessen Schädigung (Krankheit oder Tod) führt. Diese Aussage gilt nicht für kanzerogene Stoffe, da für die- se keine Schwellendosis definiert werden kann.

1.1) Dosis-Wirkungs-Beziehung

Die Dosis-Wirkungs-Beziehung beschreibt die toxische Wirkung eines Stoffes als Funktion seiner applizierten Dosis. Sie ist der wichtigste Leitgedanke der Toxikologie und für das Verständnis der toxischen Wirkung eines Stoffes unverzichtbar. Die fol- genden grundlegenden Annahmen sind bei der Erstellung der Dosis-Wirkungs- Beziehung entscheidende Voraussetzungen:

- Der toxische Effekt des zu untersuchenden Stoffes beruht auf einer Wechsel- wirkung mit einem biologischen Makromolekül, welches man allgemein auch als Rezeptor bezeichnet.

- Das Ausmaß der toxischen Wirkung ist der Konzentration des Stoffes am Re- zeptor proportional.

- Die Konzentration am Rezeptor ist proportional der applizierten Dosis des Stof- fes.

Aufgrund der o.g. Voraussetzungen hat eine Dosis-Wirkungs-Kurve das Aussehen einer Sättigungskurve (Abb. 1), welche sich einem Grenzwert annähert. Trägt man die

2

Dosis-Wirkungs-Beziehung in halblogarithmischer Form auf, so ergibt sich eine sig- moide Kurve (Abb. 2), deren Wendepunkt den sogenannten LD50 Wert anzeigt, das ist diejenige Dosis bei der 50 % der Versuchstiere, denen der zu untersuchende Stoff ap- pliziert wurde, sterben ( Beispiel aus [1]).

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Dosis (mg/kg KG)

Abb. 1: Dosis-Wirkungs-Kurve (lineare Auftragung)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

1 10 100

Dosis (mg/kg KG)

LD₅₀

Abb. 2: Dosis-Wirkungs-Kurve (halblogarithmische Auftragung)

In Abb. 1 und 2 ist der Tod von Versuchstieren in Abhängigkeit von der Dosis einer fiktiven Substanz dargestellt, welche den Tieren verabreicht wurde.

1.2) Von der Dosis zur Wirkung eines Stoffes

Bevor ein Stoff wie in 1.1 beschrieben im Organismus wirksam werden kann, muss er von diesem aufgenommen werden und an sein Zielorgan gelangen. Durch die Exposi- tion gegenüber einem Stoff erhält ein Individuum eine interne Dosis (aufgenommene Substanzmenge) des Stoffes, welche zu dessen Belastung führt, man bezeichnet die- se auch als Belastungsdosis. Sie lässt sich durch das sogenannte Dosis-Biomonitori ng erfassen z.B. durch Bestimmung der Konzentration des Stoffes in Blut und / oder Urin.

Die Belastungsdosis führt dann zu biochemischen und physiologischen Effekten, zu deren Erfassung das biochemische Effektmonitoring dient. Es wird diejenige Dosis eines Stoffes ermittelt, die biologisch wirksam ist, d.h. zu biologischen Effekten, verän- derten physiologischen Funktionen und schließlich zur Krankheit führt. Das biochemi- sche Effektmonitoring ist deswegen so wichtig, weil jeder Organismus abhängig von Alter, Umweltbedingungen und genetischer Prädisposition sehr unterschiedlich auf eine Exposition mit einem Stoff reagiert [3]. Für diesen Zweck reicht die Bestimmung der Konzentration eines Stoffes in Blut oder Urin allein nicht aus. Es müssen Verfahren angewandt werden, welche die Bestimmung der „Target-Dosis“ ermöglichen. Das be- deutet, dass es möglich sein muss die für die Reaktion mit kritischen Zielmolekülen, (den o.g. Rezeptoren) erforderliche Konzentration eines Stoffes zu ermitteln ([2] Kapi- tel Biomonitoring). Um dieses Ziel zu erreichen können biologische und / oder bio- chemische Marker ermittelt werden. Abb. 3 zeigt den Zusammenhang zwischen Expo- sition und toxischer Schädigung eines Organismus .

4

Abb. 3: Zusammenhang zwischen Exposition und toxischer Schädigung (nach Rüdiger, 1997 aus [3])

Biologische Marker sind:

- Chromosomenveränderungen (Sister-Chromatid-Austausch (SCE)) - Chromosomen-Aberrationen, -Deletionen und –Brüche.

Biochemische Marker sind:

- Protein-Addukte - DNA-Addukte - DNA-Spaltprodukte

- Nachweis von DNA-Reparatur

Die biochemischen Marker haben eine geringere pathologische Bedeutung als die bio- logischen Marker, da diese bereits vor Eintritt der biologischen Effekte bestimmt wer- den können. Außerdem stellen die biologischen Marker bereits sichtbare Veränderungen von Zellen und / oder Geweben dar.

Die Tatsache, dass biochemische Veränderungen häufig lange vor einer Erkrankung auftreten, ist für die Risikoabschätzung von Chemikalien von großer Bedeutung. Dies gilt v.a. für solche Chemikalien, die als chemische Kanzerogene wirken.

Tumorerkrankungen zählen in Deutschland neben den Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu den häufigsten Todesursachen. Ein Tumor entwickelt sich in einem Organismus meist über viele Jahre hinweg und bleibt zunächst häufig unbemerkt. Im späteren Ver- lauf treten dann die ersten Krankheitssymptome auf, werden immer stärker und führen zum Tod des betroffenen Individuums, durch Versagen der vom Tumor und seinen Metastasen betroffenen Organe. Bei Krebs handelt es sich, von wenigen Ausnahmen abgesehen, um eine Erkrankung, die erst im höheren Lebensalter auftritt. Nach dem heutigen wissenschaftlichen Kenntnisstand erklärt man sich die Krebsentstehung durch chemische Stoffe mit Hilfe des Tumorinitiations-Promotionsmodells, welches nach Versuchen an der Mäuserückenhaut u.a. von Berenblum [2] postuliert wurde.

Zwei Stoffe Tumorinitiator und Tumorpromotor genannt, wirken dabei zusammen (Abb. 4). Der Tumorinitiator z.B. ein polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoff wird auf die Mäusehaut aufgetragen und bewirkt eine Mutation in einem Gen einer Zel- le, welche für die Regulation des Zellwachstums verantwortlich ist. Diese Zelle wird dadurch zur Krebszelle. Das Wachstum dieser Krebszelle wird durch Tumorpromoto- ren, also Stoffe welche die Zellteilung fördern, verstärkt. Im Falle des Versuchs mit der Mäusehaut handelt es sich bei dem Tumorpromotor um Crotonöl einem stark hautrei- zenden Stoff. Die Tumorzellen wachsen weiter und bilden zunächst Papillome. Solan- ge das Tumorgewebe noch von einer Bindegewebskapsel umgeben ist, spricht man von einem gutartigen oder benignen Tumor. Wird diese Bindegewebskapsel aber ge- sprengt, so gelangen die Krebszellen über den Blutkreislauf in andere Organe, diesen Vorgang bezeichnet man auch als Tumorprogression. In den befallenen Organen kön- nen sich Tochtertumoren (Metastasen) bilden, man spricht dann von einem bösartigem oder malignen Tumor.

Behandelt man die Mäusehaut nur mit einem der beiden Stoffen oder vertauscht man die Reihenfolge von Tumorinitiator und Tumorpromotor, so entsteht kein Tumor. Erst die Behandlung in der in Abb. 4 beschriebenen Weise d.h. zuerst Tumorinitiator dann Tumorpromotor führt zur Bildung eines Tumors.

6

Abb. 4: Tumorentstehung nach dem Tumorinitiations /-promotionsmodell (aus [2])

Vor einer Mutation, d.h. vor einer Veränderung der DNA-Basensequenz treten aber bereits biochemische Veränderungen der DNA-Basen durch die betreffenden gentoxi- schen Stoffe auf. Es kommt zur DNA-Adduktbildung. Diese DNA-Addukte können nur mittels hochempfindlicher Analytik nachgewiesen werden. Für diesen Zweck stehen verschiedene physikalisch-chemische und biochemische Verfahren zur Verfügung. Zu den möglichen physikalisch-chemischen Verfahren gehören die Detektion mittels ECD und Massenspektrometrie nach vorheriger Trennung des Probenmaterials durch HPLC. Außerdem besteht die Möglichkeit der Detektion durch Massenspektrometrie.

Nachteilig ist bei all den genannten Methoden aber, dass relativ viel DNA (50-1000 µg) zur Analyse eingesetzt werden muss. Dies ist aber nicht immer in jedem Fall möglich, da sich aus den zu untersuchenden Proben nicht immer ausreichende DNA-Mengen isolieren lassen [4].

Wenn man mit immunchemischen Verfahren arbeitet, kann man das gesuchte DNA- Addukt mit entsprechenden Antikörpern (monoklonal oder polyklonal) nachweisen.

Diese Antikörper müssen aber erst einmal zur Verfügung stehen. Außerdem besteht

DNA-Addukten ähnlicher chemischer Natur. So können DNA-Addukte des Ben- zo(a)pyrens auch mit DNA-Addukten anderer polyaromatischer Kohlenwasserstoffe kreuzreagieren ([2] S. 742).

Die Methode, die mit der geringsten DNA-Menge (10-20 µg) auskommt heißt ³²P Postlabelling. Mit Hilfe dieser Methode können bis zu einem Addukt / 10⁹ Nukleotide nachgewiesen werden [4]. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die ³²P- Postlabelling Technik zum Nachweis vo n HNE-dG verwendet.

1.4) HNE-dG als biochemischer Marker für oxidativen Streß

HNE ist ein einfach ungesättigter Aldehyd, welcher aus mehrfach ungesättigten Fett- säuren während der sogenannten Lipidperoxidation in vivo gebildet wird. Bei der Lipid- peroxidation handelt es sich um einen Prozess, bei dem ungesättigte Fettsäuren, welche z.B. aus den Phospholipiden von Zellmembranen stammen, durch radikalische Sauerstoffspezies gespalten werden.

Abb. 5 zeigt einen möglichen Mechanismus zur Bildung von HNE aus Linolsäure [5].

8

C₅H₁₁ O

COOH

O.

C₅H₁₁ O

COOH

O .

9

8

7 6

C₅H₁₁ O

COOH O

OOH

9

8

7 6

C₅H₁₁ O O

C₅H₁₁

O OH

C₅H₁₁ O

COOH

OOH COOH

C₅H₁₁ .

COOH C₅H₁₁ OOH

COOH C₅H₁₁ O.

O₂, RH

Fe²⁺

O₂, RH

Fe²⁺

O₂, RH

Abb.5: Vorgeschlagener Mechanismus zur Bildung von HNE-dG aus Linolsäure (nach [5])

Die chemisch reaktiven Sauerstoffspezies entstehen, wenn eine Zelle oxidativem Streß ausgesetzt ist. Unter oxidativem Streß versteht man ein Überangebot von ra- dikalischen Sauerstoffspezies in der Zelle; man stellt sich diese Situation wie folgt vor:

Sauerstoff wird bekanntlich von tierischen und pflanzlichen Zellen zur Energiegewin- nung über die Atmungskette benötigt. Aus dem Sauerstoffmolekül, einem Diradikal, entsteht durch Aufnahme von zwei Elektronen das zweifach negativ geladene Sauer- stoffanion, welches zusammen mit zwei Protonen Wasser bildet. Die bei dieser kon- trollierten Knallgasreaktion freigesetzte Energie wird in Form von ATP gespeichert und kann von der Zelle z.B. für biosynthetische Aufgaben verwendet werden.

ein Elektron vom Sauerstoffmolekül aufgenommen wird, es entsteht ein Superoxidradi- kalanion. Die Superoxidradikalanionen sind starke Basen und Reduktionsmittel in ei- nem. Als Basen können sie Protonen aus anderen Verbindungen abspalten und Hydroxylradikale sowie Wasserstoffperoxid bilden. Als Reduktionsmittel können sie Übergangsmetallkationen wie Cu²⁺ oder Fe³⁺ in ihre reduzierten Formen (Cu⁺ und Fe²⁺) überführen. Das Fe²⁺ Kation führt ebenfalls zur Bildung der bereits erwähnten Hydroxylradikale aus Wasserstoffperoxid, diese Reaktion wird auch als Fenton- Reaktion bezeichnet:

Fe²⁺ + H2O2 Fe³⁺ + OH^. + OH^- Fenton-Reaktion

Die Hydroxylradikale sind starke Oxidationsmittel und können mit organischen Molekü- len schnell reagieren. So können Hydroxylradikale z.B. Wasserstoffatome aus C-H Bindungen abstrahieren und sich an aromatische Ringsysteme addieren. Das bedeu- tet, dass zelleigene Strukturen durch diese Radikale leicht zerstört werden können ([2]

S. 95 ff.). Die Bildung von Sauerstoffradikalen ist nicht ausschließlich pathologischer Natur; zur unspezifischen Abwehr von Krankheitserregern durch Makrophagen ist die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies durchaus als physiologischer Vorgang anzu- sehen. Zum Schutz vor solchen aggressiven chemischen Spezies stehen der Zelle antioxidative Schutzsysteme zur Verfügung. Man unterscheidet dabei zwischen enzy- matischen und nichtenzymatischen Schutzmechanismen.

Zu den enzymatischen Schutzmechanismen zählt man die Superoxiddismutase (SOD), die Katalase und die Glutathionperoxidasen. Die SOD bildet aus Superoxidan- ionradikalen durch eine Disproportionierungsreaktion Wasserstoffperoxid und Wasser.

Die Katalase katalysiert die Spaltung von Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauer- stoff. Die Glutathionperoxidasen katalysieren die Reduktion von Radikalen durch das Tripeptid Glutathion. Das Glutathion (GSH) wird dabei zum Dimer GSSG umgesetzt.

ROOH + 2 GSH ROH + H2O + GSSG

Zu den nichtenzymatischen Schutzmechanismen zählt man die Vitamine A, C und E (Carotinoide, Ascorbinsäure und Tocopherol) sowie Glutathion und die Harnsäure.

Neben dem antioxidativen Schutz gibt es auch die Möglichkeit DNA-Addukte zu repa- rieren und so eine Mutation zu verhindern. Es besteht daher immer ein Gleichgewicht zwischen Adduktbildung und Reparatur, allerdings wird nicht jedes DNA-Addukt gleich gut repariert. Die nicht reparierten DNA-Schäden können nach einer erneuten Zelltei- lung letztendlich zu Mutationen in der Erbinformation führen. Das im Rahmen dieser

10

Arbeit bestimmte HNE-dG, ist ein DNA-Addukt, welches nicht durch Basenexcisions- reparatur und nur schlecht durch Nukleotidexcisionsreparatur [10] beseitigt werden kann.

Bei der Zerstörung von Lipiden der Zellmembran durch radikalische Sauerstoffspezies entsteht aus ω-6-ungesättigten Fettsäuren neben Malondialdehyd auch HNE. Diese Verbindung bindet durch Michael-Addition an die exozyklische Aminogruppe des Gua- nins. Nach anschließendem Ringschluß entsteht das 1,N²-propanodesoxyguanosin- addukt des HNE (Abb. 6; [6]). Diese DNA-Addukte sind promutagen und können so- fern sie nicht repariert werden zu Mutationen führen, bei denen die Base Guanin ge- gen Adenin augetauscht wird, man bezeichnet dies auch als eine G-C / A-T Transition [9]. Diese Addukte sind hochspezifisch für DNA-Schäden, die durch Lipidperoxidation induziert werden, da sie noch die gesamte Seitenkette des HNE enthalten und nur durch dieses gebildet werden können [4], d.h. eine endogene Bildung von HNE ist bis- her nicht bekannt.

1

2

3 4

C₅H₁₁

O OH

O N

H N

N N N

H₂

O

OH O H

O N

N

N N O

OH O

H NH

3

2 1

4

C₅H₁₁ O H

OH

+

Abb. 6: Bildung von HNE-dG aus Desoxyguanosin und HNE (nach [6])

1.5) Fragestellung und Ziel der vorliegenden Arbeit

Im Vordergrund der vorliegenden Arbeit stand die Frage, wie sich die HNE-dG Ad- duktspiegel in verschiedenen Organen von Versuchstieren in Abhängigkeit von deren

verschiedenen Speiseölen in Gegenwart und Abwesenheit von Antioxidantien (Selen und Vitamin E) behandelt (s. Kapitel 2.6)

Die Ernährung mit unterschiedlichen Speiseölen, welche einen unterschiedlichen Ge- halt an ω -3 und ω-6 Fettsäuren aufwiesen, sollte zeigen, ob diese zu unterschied- lichen HNE-dG Adduktspiegeln in der Leber oder der Niere führen.

Ziel der Selenmangeldiät war es, eine Reduktion des Selengehalts in den zu untersu- chenden Organen der Tiere zu erreichen. Selen ist Bestandteil der in Kapitel 1.4 be- schriebenen Glutathionperoxidasen, also Enzymen, die ebenso wie Vitamin E an der Inaktivierung radikalischer Sauerstoffspezies in der Säugerzelle beteiligt sind. Es sollte untersucht werden, wie die Abwesenheit von Antioxidantien und die Herabsetzung der Aktivität antioxidativer Enzyme die HNE-dG Spiegel in Leber und Niere beeinflussen.

12

2) Material und Methoden

2.1) Material

2.1.1) Chemikalien

- Ameisensäure Fluka

- Ammoniumformiat Roth

- Bicin Sigma

- Spermidin Sigma

- Dithiothreitol (DTT) Sigma

- Magnesiumchlorid Sigma

- Natriumdihydrogenphosphatdihydrat Fluka

- ³²P-ATP ICN

- Polynukleotidkinase(PNK) Amersham

- NP-1 Roche

- Zinkchlorid Sigma

- Micrococcusnuclease (MN) Sigma

- Kalbsthymusphosphodiesterase (SPDE) Sigma

- DNA-Isolierungskit Macherey-Nagel

- DC-Platten mit Polyethylenimincellulose als fester Phase Machery-Nagel

Puffer Laufrichtung D1: Ammoniumformiatpuffer (1,7 M; pH 3,5) aus 850 ml Ammoniumformiatstammlösung (5 M)

+ 180 ml Ameisensäure + 750 ml Wasser

Puffer Laufrichtung D2: Natriumdihydrogenphosphat (2,7 M; pH 3,8) aus 842,4 g Natriumdihydrogenphosphatdihydrat gelöst in 2 l Wasser (bi- dest)

Puffer für die DNA-Isolierung

Zur DNA-Isolierung wurden die im DNA-Isolierungskit der Firma Machery- Nagel enthaltenen Puffer verwendet:

G2-Puffer: 800 mM GuHCl, 30 mM EDTA, 30 mM Tris/HCl, 5% Tween-20, 0,5% Triton X-100, pH 8.0

N2-Puffer: 100 mM Tris/H3PO4,, 15% Ethanol, 900 mM KCl, pH 6,3, 0,15% Tri- ton X-100

N3-Puffer: 100 mM Tris/H3PO4 , 15% Ethanol, 1150 mM KCl, pH 6,3 N5-Puffer:: 100 mM Tris/H3PO4, 15% Ethanol, 1000 mM KCl, pH 8,5 Puffer für den DNA-Verdau

Der MN/SPDE Puffer (100 mM Natriumsuccinat (wasserfrei), 50 mM CaCl2

(Dihydrat) pH 6,0) für den DNA-Verdau wurde wie folgt angesetzt: 1 mmol Natriumsuccinat und 0,5 mmol CaCl2 wurden in 10 ml Wasser gelöst und je- weils 1 ml in Eppendorff-Reaktionsgefäßen aliquotiert und bei - 90°C aufbe- wahrt.

14

2.1.1) Geräte

InstantImager Packard

Spektrophotometer Shimadzu

Pipetten (10 µl, 20 µl, 100 µl, 2000 µl und 2500 µl) Eppendorff

2.2) Methodik des ³²P Postlabelling

Beim ³²P-Postlabelling Verfahren wird die DNA des zu untersuchenden Gewebes zu- nächst isoliert. Anschließend wird sie mittels nukleinsäurespaltenden Enzymen (Mikro- kokkus Nuklease und Kalbsmilzphosphodiesterase) zu den sogenannten 3´- Monophosphaten abgebaut. Diese Spaltprodukte werden nun mit Hilfe von radioakti- vem ³²P markiertem Phosphat an ihrer 5´-OH-Gruppe markiert. Das Phosphat wird aus γ-³²P-ATP abgespalten und auf die 5´-OH-Gruppe des 3´-Monophosphats übertragen, diese Reaktion wird durch das Enzym Polynukleotidkinase katalysiert. Da die DNA- Addukte im Gegensatz zu den „normalen“ DNA-Basen nur in Spuren vorhanden sind (im Extremfall nur ein Addukt / 10⁹ Basen) müssen diese angereichert werden [2]. Bei der vorliegenden Arbeit wurde dies mit Hilfe der NP1 Reaktion bewerkstelligt. Die Nuklease P1 ist ein Enzym, welches die Abspaltung der 3´-Phosphatgruppe aus den beim DNA-Verdau gebildeten 3´-Monophosphaten katalysiert, diese ist aber für die Polynukleotidkinase erforderlich, damit dieses Enzym sein Substrat erkennt. Diese Reaktion läuft vorwiegend an den unveränderten Nukleotiden ab, die adduktierten Nukleotide des Hydroxynonenals werden von der NP1 nicht angegriffen, so dass bei der anschließenden Postlabelling-Reaktion vorwiegend die DNA-Addukte mit ³²P mar- kiert werden; Abb. 7 fasst die Vorgehensweise beim Postlabelling zusammen:

DNA

3'-dXMP + 3'-dNMP

vor allem 3'-dXMP (+ 3'-dNMP)

3',5'-dXBP

Hydrolyse durch Micrococcus Nuklease und Milz-Phosphodiesterase

Anreicherung durch Nuklease P1/S1, Chromatographie oder Butanol

Postlabelling mit [ γ-³²P]-ATP und T4 Polynukleotidkinase

Identifizierung, Quantifizierung

mehrdirektionale Dünnschicht- chromatographie oder HPLC

Abb. 7: Vorgehensweise beim Postlabelling von DNA-Addukten (Bem.:Butanol bedeutet Extrak- tion mit Butanol!)

2.2.1) DNA-Isolierung

Die DNA wurde aus Leber- bzw. Nierengewebe mit Hilfe eines DNA-Isolierungskits der Fa. Machery-Nagel gewonnen. Dazu wurde zunächst ein Stück des betreffenden Or- gans abgeschnitten und in G2-Puffer homogenisiert bis eine klare Lösung entstand.

Diese Lösung wurde mit 100 µl einer Proteinase K Lösung versetzt und 2 h bei 50°C im Wasserbad inkubiert. Anschliessend wurde diese Lösung auf eine bereits mit N2- Puffer äquillibrierte Säule AX 100 aufgetragen und mittels Schwerkraft durchlaufen.

Das Gewebelysat wurde vorher ebenfalls mit N2-Puffer äquillibriert. Bei diesem Schritt wird die zu isolierende Nukleinsäure auf der Säule immobillisiert. Um alle anderen

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Verunreinigungen abzutrennen wurde die Säule dreimal mit je 4 ml Waschpuffer N3 gespült. Danach wurde die DNA mit Hilfe von jeweils 5 ml N5 Elutionspuffer von der Säule eluiert und mit Isopropanol bei Raumtemperatur aus dem Eluat ausgefällt. Zur Trennung von Nukleinsäure und Überstand wurde 15 min. bei 4°C und 10.000 rpm zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Nukleinsäurepellet mit 70% Ethanol gewa- schen und erneut abzentrifugiert. Die so gereinigte DNA wurde in kleinere Eppendorff- Reaktionsgefäße überführt, das überschüssige Ethanol im Hochvakuum abgezogen und die DNA Pellets in 1/100 SSC-Puffer gelöst; je nach isolierter DNA-Menge muss- ten zum Lösen 100 bis 300 µl SSC-Puffer eingesetzt werden.

Zur Quantifizierung wurde die Absorption eines verdünnten Aliquots der DNA-Lösung bei 260 und 280 nm bestimmt. Bei 260 nm haben die Nukleinsäuren ihr Absorptions- maximum d.h. die DNA Menge kann bei dieser Wellenlänge erfasst werden; bei 280 nm haben die Proteine ihr Absorptionsmaximum d.h. bei dieser Wellenlänge können Proteinverunreinigungen erfasst werden. Bildet man den Quotienten A260/280 kann man eine Aussage über die Reinheit der isolierten Nukleinsäure machen; für die reine DNA liegt dieser Wert bei 1,8. Ist der Quotient größer als 1,8 liegen noch geringe Men- gen RNA Verunreinigungen vor, ist er kleiner als 1,8 so liegen Proteinverunreinigun- gen vor. Proteinverunreinigungen sollten beim Postlabelling vermieden werden, da Proteine ebenfalls phosphoryliert (z.B. an den freien OH-Gruppen der Aminosäuren Serin oder Tyrosin) werden können, so dass die DNA-Addukte in geringerem Ausmaß gelabelt werden, was ihre Quantifizierung erschwert.

2.2.2) DNA-Verdau

Für den DNA-Verdau wurde ein Gemisch aus zwei DNA-spaltenden Enzymen (Mikro- kokkus Nuclease (MN) und Kalbsthymusphosphodiesterase (SPDE) in einem Puffer in einem Eppendorff Reaktionsgefäß vorgelegt. Für den Verdau von 10 µg DNA wurden die im folgenden genannten Enzymaktivitäten pipettiert. Von den Leberproben wurden 10 µg DNA, von den Nierenproben wurden 20 µg DNA zum Verdau eingesetzt.

375 mU Mikrokokkus Nuklease (MN) 50 mU Kalbsthymus Phosphodiesterase

Jeder Ansatz wurde 4 h bei 37°C inkubiert und anschliessend lyophyllisiert. Die ver- dauten DNA-Proben wurden in jeweils 10 µl Wasser aufgenommen.

2.2.3) Anreicherung der DNA-Addukte

Zur Durchführung dieser Reaktion wurde für jede Probe folgender Reaktionsansatz pipettiert:

3,0 µl Natriumacetat-Puffer (300 mM; pH 5,3) 1,8 µl Zinkchlorid-Lösung (0,3 mM)

9,7 µl NP-1 Lösung (8 U)

Das Reaktionsgemisch wurde zunächst für alle Proben in einem Eppendorff- Reaktionsgefäß zusammengemischt und anschließend auf die einzelnen Reaktions- ansätze verteilt. Alle Ansätze wurden 45 min bei 37°C inkubiert, die Reaktion an- schließend mit Tris-Puffer abgestoppt und lyophyllisiert. Die Rückstände wurden dann in jeweils 10 µl Wasser aufgenommen.

2.2.4) Vorgehensweise beim Postlabelling der DNA-Proben

Die in Wasser gelösten Rückstände aus der NP-1 Reaktion wurden mit je 2 µl eines sogenannten Kinasepuffers versetzt, welcher sich wie folgt zusammensetzt (für jede Probe wurden pipettiert):

2,75 µl Bicin (800 mM) 0,75 µl Spermidin (50 mM) 0,75 µl DTT (400 mM) 0,75 µl MgCl2

18

32P-ATP (wobei sich die verwendete Menge nach dem Referenzdatum und nach der eingesetzten Radioaktivität –zwischen 50 und 100 µCi richtete)

0,2 µl PNK

Wie bereits bei der NP-1 Reaktion beschrieben wurde der Reaktionsmix zunächst für alle Proben in einem Eppendorff-Reaktionsgefäß vorgemischt und anschließend auf die Proben verteilt. Die Ansätze wurden 45 min bei RT inkubiert und dann auf bereits vorbereitete Dünnschichtchromatographie Platten mit Polyethylenimincellulose als fes- ter Phase aufgetragen. Bei der Postlabelling-Reaktion wird die 5´-OH-Gruppe der 3´- Monophosphate mit einem Phosphatrest verestert. Diese Reaktion wird durch das En- zym PNK katalysiert. Von den Addukten werden also die 3´,5´-Bisphosphate gebildet und später auch detektiert.

2.2.5) Chromatographische Trennung der 3´,5´-Bisphosphate der DNA-Addukte Die mit den Proben behandelten DC-Platten wurden in zwei Richtungen chroma- topgraphiert. Für die erste Richtung wurden 150 ml eines Laufmittels aus Ammoniumformiat-Puffer (1,7 M; pH 3,5) verwendet. Nach Abschluss der Chromatographie in D1 Richtung wurden der Papierwick und der untere Teil der Platte abgetrennt und das Chromatogramm 4 min in einem Wasserbad mit fliessendem Wasser gewaschen. Anschließend wurden die Chromatogramme mit Hilfe eines Föns getrocknet, um 90° gedreht, ein neuer 6 x 5 cm Papierwick angeheftet und über Nacht in das Laufmittel für die 2. Richtung (D2) gestellt (s. Abb. 8).

Beim Laufmittel in zweiter Richtung handelt es sich um Natriumdihydrogen- phosphatpuffer (2,7 M; pH 3,8). Die Chromatographie in D2 Richtung hat den Zweck die Adduktspots aufgrund ihrer Lipophilie zu trennen. Dazu verwendet man einen hochmolaren Natriumdihydrogenphosphatpuffer, der die kationischen Stellen auf der Polyethylenimincelluloseplatte absättigt, so dass die Adduktspots nur noch aufgrund ihrer Lipophilie von der festen Phase adsorbiert werden.

Nach der chromatographischen Trennung über Nacht wurden die Papierwicks von den Chromatogrammen abgetrennt und die DC-Platten anschließend mit Hilfe eines Föns getrocknet, da der wässrige Puffer in der Platte das radioaktive Signal stark vermin-

ausgewertet werden. Abb. 8 zeigt zusammenfassend die Vorgehensweise bei der chromatographischen Trennung der HNE-dG Addukte.

X

20 cm

16 cm

D1

Paperwick 3,2 cm #1

D2 über Nacht

Paperwick 6 cm #1

1,7 M AF pH 3,5

2,7 M SP pH ca. 3,8

Abb. 8: Chromatographische Trennung der HNE-dG Addukte

2.2.6) Auswertung der Chromatogramme im InstantImager

Die getrockneten Chromatogramme wurden in einer Filmkassette in eine durchsichtige Klarsichtfolie eingepackt und in den InstantImager eingelegt. Beim InstantImager ha n-

20

delt es sich um eine Art Geigerzähler, der es ermöglicht punktuelle Radioaktivität also z.B. die Adduktspots auf den o.g. Dünnschicht-Chromatogrammen in Echtzeit auf ei- nem Computerbildschirm sichtbar zu machen und quantitativ zu erfassen. Abb. 10 zeigt das Dünnschichtchromatogramm einer DNA-Probe aus der Rattenleber.

Sowohl die Identifizierung als auch die Quantifizierung der Adduktspots erfolgte mit Hilfe von HNE-dG und Hexenal-dG Adduktstandards. Für diesen Zweck wurden bei jedem Versuch Kalbsthymus-DNA Standards vermessen, welche mit HNE-dG gespi- ked waren. Dazu wurden Kalbsthymus-DNA Proben mit einer steigenden Menge an synthetischem HNE-dG (1,6; 3,2; 4,8; und 6,4 fmol HNE-dG) versetzt. Zudem wurden zu jeder DNA Probe 50 fmol Hexenal-dG pipettiert. Das Hexenal-dG diente als interner Standard! Der interne Standard ermöglicht die Quantifizierung der HNE-dG Ad- duktspiegel in den DNA-Proben aus Leber- bzw. Nierengewebe mit geringer analyti- scher Variation. Mit dem internen Standard wurden also alle Werte normiert. Die HNE- dG Adduktmenge [fmol] wurden mit Hilfe der Geradengleichung der Kalibriergeraden ermittelt und zur eingesetzten DNA-Menge ins Verhältnis gesetzt. Auf diese Weise erhält man die Adduktspiegel HNE-dG in Addukten / 10⁹ Basen.

1050

3283

1998

2689

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

0 1 2 3 4 5 6 7

HNE-dG [fmol]

cpm HNE-dG

Abb. 9: Beispiel für eine Kalibriergerade von HNE-dG mit der Geradengleichung: y = 465x + 500

Abb. 10: Dünnschichtchromatogramm einer untersuchten DNA-Probe aus der Leber. Die Spots zur Hintergrundmessung dienen der Ermittlung der unspezifisch gebundenen Radioaktivität, welche vom Signal des HNE-dG abgezogen werden müssen.

Alle für eine Tiergruppe bestimmten HNE-dG Adduktspiegel wurden zunächst durch Bildung von MW, SD und VK als einzelner Zahlenwert widergegeben. Mittels einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) wurde untersucht ob zwischen den Addukt - spiegeln einzelner Tiergruppen mit gleicher Fett- aber unterschiedlicher Antioxidan- tienversorgung ein signifikanter Unterschied besteht oder nicht.

22

2.3) Kontrollexperimente zum ³²P-Postlabelling

Zur Kontrolle der vor dem eigentlichen Postlabelling-Vorgang durchgeführten Schritte DNA-Verdau und NP-1 Anreicherung wurden die beiden folgenden Kontrollversuche durchgeführt.

2.3.1) Verdaukontrolle

Vor der NP-1 Anreicherungsreaktion wurde dem Reaktionsansatz jeweils ein Aliquot von 2µg DNA-Verdau entnommen und später in einem separaten Versuch mittels γ-

32P-ATP gelabelt; hierfür wurden nur 60% der Mengen von Kinasepuffer und ³²P-ATP eingesetzt. Nach 45 min Inkubation wurde die Reaktion mit jeweils 800µl 1x TE-Puffer abgestoppt und auf eine gesondert vorbereitete DC-Platte aufgetragen. Das Chroma- togramm wurde eindimensional in AS/SP-Puffer (250 mM AS, 40 mM SP; pH4,4) ent- wickelt und anschließend im InstantImager ausgewertet.

Abb. 11: Verdaukontroll unten ATP darüber die „normalen“ Nukleotide Adenosin, Guanosin, Thymidin, Cytidin

2.3.2) ATP-Überschusskontrolle

Zur Kontrolle ob die Anreicherung der adduktierten Basen gegenüber den „norma- len“ Basen erfolgreich verlaufen ist, d.h. primär HNE-dG und Hex-dG Addukte ge-

kontrolle durchgeführt. Das bedeutet, dass zum Reaktionsrückstand der Postlabel- ling-Ansätze jeweils 800µl 1x TE-Puffer gegeben wurden, davon wurden anschließend je 10µl auf eine entsprechend vorbereitete DC-Platte aufgetragen.

Das Chromatogramm wurde in AS/SP-Puffer entwickelt und im InstantImager sichtbar gemacht. Abb. 12 zeigt ein solches Chromatogramm.

Abb. 12: ATP-Überschußkontrolle

Die Spots auf der unteren Seite von Abb. 12 zeigen den ATP-Überschuß, am obe- ren Ende der Abbildung befinden sich einige schwächere Spots, sie zeigen freies radioaktives Phosphat. Im Gegensatz zu Abb. 11 befinden sich zwischen den ATP- Spots und den Phosphatspots keine weiteren Spots, die normale d.h. nicht modifi- zierte Basen anzeigen würden. Dies ist ein Indiz dafür, dass die NP-1 Anreiche- rungsreaktion erfolgreich verlaufen ist.

2.4) Tierversuch

Alle im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Proben stammten aus einem Tierver- such mit weiblichen Fischer 344 Ratten, der zwischen April und Juni 2001 am Insti-

ATP

P

24

tut für Toxikologie der Universität Würzburg durchgeführt wurde. Das Versuchde- sign war wie folgt:

Jeweils 10 Tiere (Gruppe 2-5) wurden mit vier verschiedenen Speiseölen (Kokosöl, Olivenöl, Rapsöl und Sonnenblumenöl) behandelt. Eine weitere Gruppe (Gruppe 1) von ebenfalls 10 Tieren diente als Kontrollgruppe und erhielt fettarme Nahrung.

Von den verschiedenen Speiseölen wurden an 5 Tagen / Woche jeweils 1ml / Tier und Tag oral per Schlundsonde verabreicht. Jede 10er Gruppe wurde in zwei Teil- gruppen unterteilt, wobei je fünf Tiere eine Standarddiät mit normalem Vitamin E und Selengehalt und dem jeweiligen Speiseöl erhielten, die anderen 5 Tiere erhiel- ten dagegen eine Vitamin E- und Selenarme Sonderdiät, ebenfalls mit dem ent- sprechenden Speiseöl kombiniert. Tabelle 1 fasst den Tierversuch als Übersicht zusammen:

Tabelle 1: Tierernährung

Gruppe Ernährung normale Vitamin E

und Selenversorgung

Vitamin E und Se- lenmangel

1 Kontrolle (fettarm) 5 Tiere 5 Tiere

2 Kokosöl 5 Tiere 5 Tiere

3 Olivenöl 5 Tiere 5 Tiere

4 Rapsöl 5 Tiere 5 Tiere

5 Sonnenblumenöl 5 Tiere 5 Tiere

Sonnenblumenöl enthält zu ca. 60% Linolsäure, Rapsöl zu 22%, Olivenöl zu 9 % und Kokosöl zu 1%. Die Linolensäure (ω-3 Fettsäure) ist zu 0,5% in Sonnenblumenöl und zu 9,5% in Rapsöl enthalten. Der Energieinhalt ist bei allen Speisefetten in etwa gleich und liegt zwischen 875 und 882 kcal/kg Futtereinwaage.

3) Ergebnisse

Im nun folgenden Kapitel sollen die Ergebnisse der HNE-dG Adduktspiegel- bestimmungen in Leber- und Nierengewebe von weiblichen F344 Ratten zusammen- gefasst werden.

3.1) HNE-dG Adduktspiegel in der Leber von weiblichen F 344 Ratten

In Tabelle 2 sind die Ergebnisse der HNE-dG Adduktspiegelbestimmungen in der Le- ber von weiblichen F 344 Ratten dargestellt:

Tabelle 2: HNE-dG Adduktspiegel in der Leber von F 344 Ratten

Gruppe Ernährung

HNE-dG Spiegel bei normaler Vitamin E

und Selen- Versorgung

HNE-dG Spiegel bei Vitamin E und Se-

lenmangel

P-Wert

1 Kontrolle 67,0±21,2 133,8±33,9 0,00574

2 Kokosöl 127,6±48,9 143,8±27,4 0,53672

3 Olivenöl 106,8±16,4 196,6±31,1 0,00044

4 Rapsöl 115,2±31,8 167,6±81,8 0,2189

5 Sonnenblu-

menöl 151,6±61,9 156,4±39,4 0,8873

Betrachtet man die HNE-dG Adduktspiegel in den Lebern derjenigen Tiere, die mit der Nahrung eine normale Vitamin E und Selenversorgung erhielten, so sieht man, dass diese bei den Tiergruppen 2 bis 5 im Vergleich zur Kontrolle deutlich erhöht sind. Bei Gruppe zwei um Faktor zwei, bei Gruppe drei um Faktor 1,6, bei Gruppe vier um Faktor 1,7 und bei Gruppe fünf um Faktor 2,3. Alle Gruppen mit Vitamin E- und Selendefizienter Diät zeigen ebenfalls sowohl im Vergleich zur Kontrolle als auch im Vergleich zu den Tieren mit normaler Vitamin E- und Selen-Versorgung deutlich erhöhte HNE-dG Adduktspiegel. Am deutlichsten fällt der Unterschied in den Adduktspiegeln zwischen Vitamin E- und Selenmangel und Normaldiät bei den

26

Tieren der Kontrollgruppe und den Tieren der Gruppe 3 (Olivenöl) auf. Bei diesen Tiergruppen mit Vitamin E- und Selenarmer Diät sind die HNE-dG Adduktspiegel im Vergleich zu den Tieren, welche eine normale Vitamin E- und Selenversorgung aufweisen um Faktor zwei erhöht. Dieser Unterschied ist in beiden Fällen auch sta- tistisch signifikant, wie man an dem P-Wert, der weit unter 0,01 liegt, sehen kann.

Bei den Gruppen 2 und 5 zeigt sich dagegen bezüglich der HNE-dG Adduktspiegel kaum ein Unterschied zwischen Vitamin E- und Selenarmer Diät und der Normaldi- ät. Bei Gruppe 2 kann man lediglich eine Tendenz zu einem höheren HNE-dG Ad- duktspiegel bei der Mangeldiät erkennen.

0 50 100 150 200 250 300

Kontrolle Kokosöl Olivenöl Rapsöl Sonnenblumenöl

Addukt/10 Nukleotide

Kontrolldiät Selenarme Diät p=0,006

p=0,219 p<0,001

p=0,537

Abb.13: Ergebnisse der HNE-dG Adduktspiegelbestimmungen in der Leber von F344 Ratten

3.2) HNE-dG Adduktspiegel in der Niere von weiblichen F 344 Ratten

In Tabelle 3 sind die Ergebnisse der HNE-dG Adduktmessungen in der Niere von weiblichen F 344 Ratten zusammen mit deren Ernährungsweise dargestellt.

Tabelle 3: HNE-dG Adduktspiegel in der Niere von F 344 Ratten

Gruppe Ernährung

HNE-dG Adduktspie- gel bei normaler Vita-

min. E und Selenversorgung

HNE-dG Adduktspie- gel bei Vitamin E und

Selenmangel

P-Wert

1 Kontrolle 6,8±3,6 9,4±3,2 0,13

2 Kokosöl 73,0±43,9 28,2±14,3 0,06

3 Olivenöl 80,0±33,3 78,0±13,0 0,91

4 Rapsöl 23,0±7,4 14,4±4,8 0,06

5 Sonnenblu-

menöl 16,2±3,3 13,4±1,8 0,13

Die HNE-dG Adduktspiegel in den Kontrollgruppe unterscheiden sich kaum voneina n- der, wenn man die Tier mit normaler Selen- und Vitamin E Versorgung mit der Selen- und Vitamin E Mangelgruppe vergleicht. Auffällig ist die hohe SD bei den Gruppen zwei und drei mit normaler Antioxidantienversorgung. Sie wurde verursacht durch eine Nieren DNA-Probe, die einen sehr hohen HNE-dG Adduktspiegel aufwies. Diese Pro- be wurde bei der Bestimmung des Mittelwerts berücksichtigt, da nicht ausgeschlossen werden kann, dass in einem Individuum eine Lipidperoxidation in größerem Ausmaß stattgefunden hat. Bei den Tieren der Kontrollgruppe mit Antioxidantienmangel kann ein leichter Anstieg der HNE-dG Adduktspiegel beobachtet werden, der statistisch al- lerdings nicht signifikant ist.

Betrachtet man die HNE-dG Adduktspiegel der mit Kokosöl behandelten Tiere, so zeigt sich, dass diese bei den Proben aus den Ratten mit normaler Selen- und Vitamin E Versorgung höher liegen im Vergleich zu jenen Tieren, welche die entsprechende

28

Mangeldiät erhielten. Allerdings ist dieser Unterschied statistisch ebenfalls nicht signifi- kant, da die SD in dieser Gruppe ebenfalls sehr hoch ist, der Variationskoeffizient liegt hier bei 60 %.

Verglichen mit den Adduktspiegeln der Kontrollgruppe sind diese Adduktspiegel aber deutlich erhöht und zwar um den Faktor drei bei den Tieren mit Selen- und Vitamin E- Mangel und um Faktor zehn bei den Tieren mit guter Antioxidantienversorgung.

Die HNE-dG Adduktspiegel in den Proben von Tieren, die oral mit Olivenöl beha ndelt wurden sind im Vergleich mit den Kontrolltieren etwa um Faktor 11 erhöht. Ein Unter- schied zwischen den Tieren mit Antioxidantiendiät und jenen mit normaler Selen- und Vitamin E Versorgung kann hier nicht gefunden werden.

Die mit Rapsöl behandelten Ratten zeigen in ihren Nieren im Vergleich zur Kontroll- gruppe ebenfalls leicht erhöhte HNE-dG Adduktspiegel. Diese liegen bei Faktor drei bei den Tieren mit normaler Vitamin E- und Selenversorgung und bei Faktor zwei bei den Tieren mit der entsprechenden Mangeldiät. In dieser Gruppe sind die HNE-dG Werte also bei weitem nicht so stark erhöht, wie das bei den Tieren der Fall war, die mit Kokosöl behandelt wurden. Der Variationskoeffizient liegt bei diesen Proben mit 32% bzw. 34% in einem Bereich, der für in vivo Versuche üblich ist.

Die mit Sonnenblumenöl behandelten Tiere zeigen im Vergleich mit den entspreche n- den Kontrolltieren erhöhte HNE-dG Adduktspiegel. Die Variationskoeffizienten liegen mit 20% (Selen-/Vitamin E Normalversorgung) und 13% (Selen-/Vitamin E Mangel) erstaunlich niedrig für in vivo Verhältnisse. Ein signifikanter Unterschied zwischen den Tieren mit normaler und jenen mit defizienter Selen- und Vitamin Ernährung kann hier nicht gefunden werden.

0 20 40 60 80 100 120

Kontrolle Kokusöl Olivenöl Rapsöl Sonnenblumenöl

Addukte/10 Nukleotide

HNE-dG Adduktspiegel bei normaler Vitamin E und Selenversorgung

HNE-dG Adduktspiegel bei Vitamin E und Selenmangel

Abb.14 Ergebnisse der HNE-dG Adduktspiegelbestimmung in der Niere von F344 Ratten

30 4) Diskussion

4.1) ³²P-Postlabelling zur quantitativen Detektion von DNA-Schäden

Das Postlabelling Verfahren zur Detektion von DNA Schäden wurde von Gupta und Randerath entwickelt. [7]. Seine Stärke besteht v.a. darin, dass durch den Einsatz von Radioaktivität geringste Konzentrationen eines DNA-Addukts (im fmol-Bereich) ermittelt werden können. Voraussetzung für die Anwendung dieses Verfahrens ist allerdings, dass die chemische Struktur des gesuchten Addukts bekannt ist und ein synthetischer Standard desselben zwecks Identifikation zur Verfügung steht. Mög- lich ist aber auch eine qualitative Analyse von DNA-Proben im Hinblick auf eventu- ell gebildete Addukte, man bezeichnet dies dann als relatives Adduktlabelling. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe von synthetischem HNE-dG und Hex-dG die Adduktspots im Chromatogramm identifiziert und über eine Kalibriergerade quantifiziert.

Um die analytische Variabilität möglichst gering zu halten, wurde bei den Experi- menten synthetisches Hex-dG als interner Standard mitgeführt, der ebenfalls alle beschriebenen analytischen Schritte vom DNA-Verdau bis zur Postlabelling- Reaktion durchläuft. Dies zeigt einerseits, ob der Versuch ordnungsgemäß abge- laufen ist und ermöglicht eine Korrektur des HNE-dG Signals mit Hilfe des Hex-dG Signals. Ergänzend wurden je eine Verdaukontrolle und je eine ATP- Überschußkontrolle durchgeführt. Hex-dG ist dem eigentlichen Analyten HNE-dG chemisch ähnlich und chromatographiert mit den verwendeten Fließmitteln zu- sammen auf der Dünnschichtplatte. Die Verwendung eines internen Standards er- höht die Reproduzierbarkeit der Postlabelling-Methode. Sie zeigt ob die Ver- esterung der 5´OH Gruppe im Desoxyriboseanteil des gesuchten HNE-dG Addukts in der Probe mit ³²P markiert in befriedigender Weise erfolgt ist.

4.2) Ziele des Tierversuchs

Das Ziel des in Kapitel 2.6 beschriebenen Tierversuchs, war eine Selendepletion in den Zielorganen der einzelnen Tiere zu erreichen, die Selen- und Vitamin E-arm ernährt wurden. Selen ist unter anderem ein Bestandteil von Glutathionperoxida- sen, denjenigen Enzymen also, welche die Reduktion von Sauerstoffradikalen un- ter Verbrauch von Glutathion katalysieren (s. auch Kapitel 1.4). Der Nachweis der

des Selengehalts und der spezifischen Enzymaktivitäten der Glutathionperoxidase in den Leberproben der untersuchten Tiere, der durch die Arbeitsgruppe Köhrle an der Universität Würzburg durchgeführt wurde, bestätigt werden. Die beiden folgen- den Abbildungen zeigen die Ergebnisse dieser Messungen:

Selengehalt in Rattenlebern

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 1,00

µg/g FW

Normaldiät Selenarme Diät Normaldiät Selenarme Diät Normaldiät Selenarme Diät Normaldiät Selenarme Diät Normaldiät Selenarme Diät

Abb. 15: Selengehalt in den untersuchten Rattenlebern

GPx-Aktivität

0 500 1000 1500 2000 2500

nmol NADPH/min/mg Protein

A-Normaldiät B-Selenenarme Diät C-Normaldiät D-Selenarme Diät E-Normaldiät F-Selenarme Diät G-Normaldiät H-Selenarme Diät I-Normal Diät J-Selenarme Diät

32

Abb.16: Aktivität des Enzyms Glutathionperoxidase in den untersuchten Rattenlebern

An beiden Abbildungen kann man erkennen welche Unterschiede im Selengehalt und bei den Enzymaktivitäten durch die selenarme Diät hervorgerufen wurde. So- wohl der Selengehalt als auch die Aktivität der cytosolischen Glutathionperoxidase wurde durch die selenarme Ernährung deutlich reduziert. Das Ziel der Selendeple- tion wurde also erreicht.

Für die Niere konnte eine solche Bestimmung von Selengehalt und Glutathion- peroxidaseaktivität nicht mehr durchgeführt werden, da sich die Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Köhrle nach dessen Weggang aus Würzburg aufgelöst hat.

4.3) HNE-dG Adduktspiegel in Leber und Niere in Abhängigkeit von der Ernährung

In den Lebern der Tiere kann man eine Abhängigkeit der HNE-dG Adduktspiegel von der Versorgung der Zellen mit Antioxidantien beobachten. Bei niedrigen Vita- min E und Selenspiegeln findet man in der Leber erhöhte HNE-dG Adduktspiegel.

Es besteht also eine Korrelation zwischen HNE-dG Adduktspiegel und Glutathion- peroxidasaktivität, die signifikant ist (Abb. 17).

Dies spricht für die Theorie, dass in der Leber bei Selen- und Vitamin E Mangel die Lipidperoxidation in verstärktem Maße abläuft d.h. mehr HNE-dG in den Zellen ent- steht und dadurch entsprechend mehr HNE-dG Addukte in der Leber DNA gefun- den werden. Im Falle der Rattenleber kann die Frage, ob Antioxidantien zu einer verringerten Lipidperoxidation und damit zu weniger HNE-dG Addukten führt mit ja beantwortet werden.

Abb. 17: HNE-dG Addukte in Abhängigkeit vom Selengehalt der untersuchten Leberproben.

Abszisse: Glutathionperoxidaseaktivität [nmol/min]; Ordinate: HNE-dG Adduktspiegel. Die beiden Punkte im Diagramm entsprechen dem Mittelwert an HNE-dG / 10⁹ Ba- sen aus jeweils 25 Leberproben von n=25 Individuen. Bei den Tieren mit geringer Glutathionperoxidaseaktivität sind die HNE-dG Adduktspiegel signifikant erhöht (p = 0,03), wenn man sie mit denjenigen Werten vergleicht, welche die Tiere mit hoher Glutathionperoxidaseaktivität aufweisen.

34

Bei der Niere kann man aufgrund der hier ermittelten Ergebnisse eine solche Ein- schätzung nicht treffen. Die Gruppen mit normaler Haltungsdiät und Selen- Vitamin E- Mangeldiät zeigen, abgesehen von den Tieren der Gruppe 2 (Kokosöl), ähnliche HNE- dG Adduktspiegel. Bei Gruppe 2 scheint sogar eine negative Korrelation von HNE-dG Addukten und Vitamin E und Selenmangelernährung zu bestehen d.h. bei der Man- geldiät findet man die niedrigeren Adduktspiegel im Vergleich zur Normaldiät. Dieser Effekt ist allerdings wegen der starken Streuung der gefundenen HNE-dG Adduktspie- gel statistisch nicht signifikant Auffällig ist, dass die Gruppe 3, die mit Olivenöl ernähr- ten Tiere, sehr hohe HNE-dG Adduktspiegel aufweisen. Sie sind im Vergleich zur Kontrollgruppe etwa um Faktor 11 erhöht. Eine solche Erhöhung wurde bei den bishe- rigen HNE-dG Adduktspiegelbestimmungen nicht gefunden.

Dies zeigt, dass unterschiedliche Organe unterschiedlich hohe Adduktspiegel aufwei- sen können, von gut nachweisbar wie im Fall der Leber bis schwierig nachzuweisen, wie im Fall der Niere. Man kann auch erkennen, dass Prozesse wie die Lipid- peroxidation in einzelnen Organen auch in unterschiedlichem Ausmaß abla ufen. Die Leber ist von Lipidperoxidation und der damit verbundenen HNE-dG Adduktbildung wesentlich stärker betroffen wie die Niere.

4.4) Zusammenfassung und Ausblick

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass in der Leber offenbar ein Zu- sammenhang besteht zwischen der Versorgung der Tiere mit Antioxidantien und den gefundenen HNE-dG Adduktspiegeln. In der Niere ließ sich ein solcher Zusammen- hang nicht nachweisen.

Ziel der künftigen Arbeiten wird es sein weitere Korrelationen zwischen HNE-dG Ad- duktspiegeln und anderen Parametern (Glutathionperoxidase-Aktivitäten, DNA- Strangbrüchen, Mutationen) zu finden, die durch oxidativen Streß beeinflusst werden.

Außerdem soll untersucht werden, ob HNE-dG Addukte tatsächlich auch in denjenigen Genen zu Mutationen führen kann, die für die Regulation des Zellwachstums verant- wortlich sind. Hinweise für ein solches Verhalten von HNE sind in der Literatur bereits beschrieben, so konnten Hu et al. in vitro zeigen, dass HNE in stark von Mutationen betroffenen Bereichen des p53 Gens bindet [8]. Die Mutation selbst konnte aber noch nicht nachgewiesen werden.

krebserregend zu bezeichnen, dieses Kriterium ist notwendig aber nicht hinreichend.

Es muss eine Mutation sein, die z.B. in einem Tumorsupressorgen wie p53 stattfindet, was zu einer Veränderung des Wachstumsverhaltens der Zellen in einem Gewebe führt. Wenn es möglich ist eine solche Mutation nachzuweisen, muss den HNE-dG Addukten eine große Bedeutung bei der Initiation von Krebszellen beigemessen wer- den. Das gleiche gilt für deren Nachweis mittels der in dieser Arbeit beschriebenen Postlabelling-Methode.

36 LITERATURVERZEICHNIS

[1] Dekant / Vamvakas Toxikologie für Chemiker und Biologen, Spektrum Verlag [2] Markwardt/ Schäfer Lehrbuch der Toxikologie

[3] H.G. Neumann Skriptum zur Vorlesung Biomonitoring

[4] E. Eder DNA-Addukte krebserregender Stoffe in der Umwelt und am Arbeitsplatz: Bildung Nachweis und Bedeutung in Umweltmed. Forsch. Prax. 4 (6) 323-334 (1999)

[5] Rindgen D., S. Lee, M. Nakajuma und I. Blair (2000) Formation of a substituted 1 N6 etheno 2`

deoxyguanosineadduct by lipidhydroperoxide mediated generation of 4-oxo-2-nonenal; Chem. Res.

Toxicol. 13, 846-852

[6] Winter, C.K, H.Segal und W.F. Haddon (1986) Formation of cyclic adducts of deoxyguanosine with aldehydes trans-4-hydroxy-2-hexenal and trans-4-hydroxy-2-nonenal in vitro; Cancer Res. 46, 5682-5686

[7] Gupta 32-P Postlabelling for detection of DNA adducts In: Pfeifer G. editor Technologies for detection of DNA-damage and mutattion

[8] Wenwei Hu, Zhaohui Feng, Jamie Eveleigh, Ganesh Iyer, Jishen Pan, Shantu Amin, Fung-Lung Chung Moon-Shong Tang: The major lipid peroxidation product, trans-4-hydroxy-2-nonenal pref- erentially forms DNA adducts at codon 249 of human p53 gene, a unique mutational hotspot in hepatocellular carcinoma; Carcinogenasis vol. 23 no. 11 pp.1781-1789, 2002

[9] Plum G.E., A.P. Grollmann, F. Johnson und K.J. Bresslauer (1992): Influence of an exocyclic guanine adduct on the thermal stability, conformation and melting thermodynamics of a DNA duplex. Biochemistry 31: 12096-12102

[10] Wacker M., Schuler D., Wanek P., Eder E.: Development of a 32 P-postlabelling method for the detection of 1N2-propanodesoxyguanosine adducts of trans-4-hydroxy-2-nonenal in vivo Chem. Res. Toxicol 2000; 13 (11): 1165-1173

4

6

6 NDEX