Material und Methoden - Abschlussarbeit Postgradualstudium Toxikologie der Universität Leipzig

2.1) Material

2.1.1) Chemikalien

- Ameisensäure Fluka

- Ammoniumformiat Roth

- Bicin Sigma

- Spermidin Sigma

- Dithiothreitol (DTT) Sigma

- Magnesiumchlorid Sigma

- Natriumdihydrogenphosphatdihydrat Fluka

- ³²P-ATP ICN

- Polynukleotidkinase(PNK) Amersham

- NP-1 Roche

- Zinkchlorid Sigma

- Micrococcusnuclease (MN) Sigma

- Kalbsthymusphosphodiesterase (SPDE) Sigma

- DNA-Isolierungskit Macherey-Nagel

- DC-Platten mit Polyethylenimincellulose als fester Phase Machery-Nagel

Puffer Laufrichtung D1: Ammoniumformiatpuffer (1,7 M; pH 3,5) aus 850 ml Ammoniumformiatstammlösung (5 M)

+ 180 ml Ameisensäure + 750 ml Wasser

Puffer Laufrichtung D2: Natriumdihydrogenphosphat (2,7 M; pH 3,8) aus 842,4 g Natriumdihydrogenphosphatdihydrat gelöst in 2 l Wasser (bi-dest)

Puffer für die DNA-Isolierung

Zur DNA-Isolierung wurden die im DNA-Isolierungskit der Firma Machery-Nagel enthaltenen Puffer verwendet:

G2-Puffer: 800 mM GuHCl, 30 mM EDTA, 30 mM Tris/HCl, 5% Tween-20, 0,5% Triton X-100, pH 8.0

N2-Puffer: 100 mM Tris/H3PO4,, 15% Ethanol, 900 mM KCl, pH 6,3, 0,15% Tri-ton X-100

N3-Puffer: 100 mM Tris/H3PO4 , 15% Ethanol, 1150 mM KCl, pH 6,3 N5-Puffer:: 100 mM Tris/H3PO4, 15% Ethanol, 1000 mM KCl, pH 8,5 Puffer für den DNA-Verdau

Der MN/SPDE Puffer (100 mM Natriumsuccinat (wasserfrei), 50 mM CaCl2

(Dihydrat) pH 6,0) für den DNA-Verdau wurde wie folgt angesetzt: 1 mmol Natriumsuccinat und 0,5 mmol CaCl2 wurden in 10 ml Wasser gelöst und je-weils 1 ml in Eppendorff-Reaktionsgefäßen aliquotiert und bei - 90°C aufbe-wahrt.

2.1.1) Geräte

InstantImager Packard

Spektrophotometer Shimadzu

Pipetten (10 µl, 20 µl, 100 µl, 2000 µl und 2500 µl) Eppendorff

2.2) Methodik des ³²P Postlabelling

Beim ³²P-Postlabelling Verfahren wird die DNA des zu untersuchenden Gewebes zu-nächst isoliert. Anschließend wird sie mittels nukleinsäurespaltenden Enzymen (Mikro-kokkus Nuklease und Kalbsmilzphosphodiesterase) zu den sogenannten 3´-Monophosphaten abgebaut. Diese Spaltprodukte werden nun mit Hilfe von radioakti-vem ³²P markiertem Phosphat an ihrer 5´-OH-Gruppe markiert. Das Phosphat wird aus γ-³²P-ATP abgespalten und auf die 5´-OH-Gruppe des 3´-Monophosphats übertragen, diese Reaktion wird durch das Enzym Polynukleotidkinase katalysiert. Da die DNA-Addukte im Gegensatz zu den „normalen“ DNA-Basen nur in Spuren vorhanden sind (im Extremfall nur ein Addukt / 10⁹ Basen) müssen diese angereichert werden [2]. Bei der vorliegenden Arbeit wurde dies mit Hilfe der NP1 Reaktion bewerkstelligt. Die Nuklease P1 ist ein Enzym, welches die Abspaltung der 3´-Phosphatgruppe aus den beim DNA-Verdau gebildeten 3´-Monophosphaten katalysiert, diese ist aber für die Polynukleotidkinase erforderlich, damit dieses Enzym sein Substrat erkennt. Diese Reaktion läuft vorwiegend an den unveränderten Nukleotiden ab, die adduktierten Nukleotide des Hydroxynonenals werden von der NP1 nicht angegriffen, so dass bei der anschließenden Postlabelling-Reaktion vorwiegend die DNA-Addukte mit ³²P mar-kiert werden; Abb. 7 fasst die Vorgehensweise beim Postlabelling zusammen:

DNA

3'-dXMP + 3'-dNMP

vor allem 3'-dXMP (+ 3'-dNMP)

3',5'-dXBP

Hydrolyse durch Micrococcus Nuklease und Milz-Phosphodiesterase

Anreicherung durch Nuklease P1/S1, Chromatographie oder Butanol

Postlabelling mit [ γ-³²P]-ATP und T4 Polynukleotidkinase

Identifizierung, Quantifizierung

mehrdirektionale Dünnschicht- chromatographie oder HPLC

Abb. 7: Vorgehensweise beim Postlabelling von DNA-Addukten (Bem.:Butanol bedeutet Extrak-tion mit Butanol!)

2.2.1) DNA-Isolierung

Die DNA wurde aus Leber- bzw. Nierengewebe mit Hilfe eines DNA-Isolierungskits der Fa. Machery-Nagel gewonnen. Dazu wurde zunächst ein Stück des betreffenden Or-gans abgeschnitten und in G2-Puffer homogenisiert bis eine klare Lösung entstand.

Diese Lösung wurde mit 100 µl einer Proteinase K Lösung versetzt und 2 h bei 50°C im Wasserbad inkubiert. Anschliessend wurde diese Lösung auf eine bereits mit N2-Puffer äquillibrierte Säule AX 100 aufgetragen und mittels Schwerkraft durchlaufen.

Das Gewebelysat wurde vorher ebenfalls mit N2-Puffer äquillibriert. Bei diesem Schritt wird die zu isolierende Nukleinsäure auf der Säule immobillisiert. Um alle anderen

Verunreinigungen abzutrennen wurde die Säule dreimal mit je 4 ml Waschpuffer N3 gespült. Danach wurde die DNA mit Hilfe von jeweils 5 ml N5 Elutionspuffer von der Säule eluiert und mit Isopropanol bei Raumtemperatur aus dem Eluat ausgefällt. Zur Trennung von Nukleinsäure und Überstand wurde 15 min. bei 4°C und 10.000 rpm zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Nukleinsäurepellet mit 70% Ethanol gewa-schen und erneut abzentrifugiert. Die so gereinigte DNA wurde in kleinere Eppendorff-Reaktionsgefäße überführt, das überschüssige Ethanol im Hochvakuum abgezogen und die DNA Pellets in 1/100 SSC-Puffer gelöst; je nach isolierter DNA-Menge muss-ten zum Lösen 100 bis 300 µl SSC-Puffer eingesetzt werden.

Zur Quantifizierung wurde die Absorption eines verdünnten Aliquots der DNA-Lösung bei 260 und 280 nm bestimmt. Bei 260 nm haben die Nukleinsäuren ihr Absorptions-maximum d.h. die DNA Menge kann bei dieser Wellenlänge erfasst werden; bei 280 nm haben die Proteine ihr Absorptionsmaximum d.h. bei dieser Wellenlänge können Proteinverunreinigungen erfasst werden. Bildet man den Quotienten A260/280 kann man eine Aussage über die Reinheit der isolierten Nukleinsäure machen; für die reine DNA liegt dieser Wert bei 1,8. Ist der Quotient größer als 1,8 liegen noch geringe Men-gen RNA VerunreinigunMen-gen vor, ist er kleiner als 1,8 so lieMen-gen Proteinverunreinigun-gen vor. ProteinverunreinigunProteinverunreinigun-gen sollten beim Postlabelling vermieden werden, da Proteine ebenfalls phosphoryliert (z.B. an den freien OH-Gruppen der Aminosäuren Serin oder Tyrosin) werden können, so dass die DNA-Addukte in geringerem Ausmaß gelabelt werden, was ihre Quantifizierung erschwert.

2.2.2) DNA-Verdau

Für den DNA-Verdau wurde ein Gemisch aus zwei DNA-spaltenden Enzymen (Mikro-kokkus Nuclease (MN) und Kalbsthymusphosphodiesterase (SPDE) in einem Puffer in einem Eppendorff Reaktionsgefäß vorgelegt. Für den Verdau von 10 µg DNA wurden die im folgenden genannten Enzymaktivitäten pipettiert. Von den Leberproben wurden 10 µg DNA, von den Nierenproben wurden 20 µg DNA zum Verdau eingesetzt.

375 mU Mikrokokkus Nuklease (MN) 50 mU Kalbsthymus Phosphodiesterase

Jeder Ansatz wurde 4 h bei 37°C inkubiert und anschliessend lyophyllisiert. Die ver-dauten DNA-Proben wurden in jeweils 10 µl Wasser aufgenommen.

2.2.3) Anreicherung der DNA-Addukte

Zur Durchführung dieser Reaktion wurde für jede Probe folgender Reaktionsansatz pipettiert:

3,0 µl Natriumacetat-Puffer (300 mM; pH 5,3) 1,8 µl Zinkchlorid-Lösung (0,3 mM)

9,7 µl NP-1 Lösung (8 U)

Das Reaktionsgemisch wurde zunächst für alle Proben in einem Eppendorff-Reaktionsgefäß zusammengemischt und anschließend auf die einzelnen Reaktions-ansätze verteilt. Alle Ansätze wurden 45 min bei 37°C inkubiert, die Reaktion an-schließend mit Tris-Puffer abgestoppt und lyophyllisiert. Die Rückstände wurden dann in jeweils 10 µl Wasser aufgenommen.

2.2.4) Vorgehensweise beim Postlabelling der DNA-Proben

Die in Wasser gelösten Rückstände aus der NP-1 Reaktion wurden mit je 2 µl eines sogenannten Kinasepuffers versetzt, welcher sich wie folgt zusammensetzt (für jede Probe wurden pipettiert):

2,75 µl Bicin (800 mM) 0,75 µl Spermidin (50 mM) 0,75 µl DTT (400 mM) 0,75 µl MgCl2

32P-ATP (wobei sich die verwendete Menge nach dem Referenzdatum und nach der eingesetzten Radioaktivität –zwischen 50 und 100 µCi richtete)

0,2 µl PNK

Wie bereits bei der NP-1 Reaktion beschrieben wurde der Reaktionsmix zunächst für alle Proben in einem Eppendorff-Reaktionsgefäß vorgemischt und anschließend auf die Proben verteilt. Die Ansätze wurden 45 min bei RT inkubiert und dann auf bereits vorbereitete Dünnschichtchromatographie Platten mit Polyethylenimincellulose als fes-ter Phase aufgetragen. Bei der Postlabelling-Reaktion wird die 5´-OH-Gruppe der 3´-Monophosphate mit einem Phosphatrest verestert. Diese Reaktion wird durch das En-zym PNK katalysiert. Von den Addukten werden also die 3´,5´-Bisphosphate gebildet und später auch detektiert.

2.2.5) Chromatographische Trennung der 3´,5´-Bisphosphate der DNA-Addukte Die mit den Proben behandelten DC-Platten wurden in zwei Richtungen chroma-topgraphiert. Für die erste Richtung wurden 150 ml eines Laufmittels aus Ammoniumformiat-Puffer (1,7 M; pH 3,5) verwendet. Nach Abschluss der Chromatographie in D1 Richtung wurden der Papierwick und der untere Teil der Platte abgetrennt und das Chromatogramm 4 min in einem Wasserbad mit fliessendem Wasser gewaschen. Anschließend wurden die Chromatogramme mit Hilfe eines Föns getrocknet, um 90° gedreht, ein neuer 6 x 5 cm Papierwick angeheftet und über Nacht in das Laufmittel für die 2. Richtung (D2) gestellt (s. Abb. 8).

Beim Laufmittel in zweiter Richtung handelt es sich um Natriumdihydrogen-phosphatpuffer (2,7 M; pH 3,8). Die Chromatographie in D2 Richtung hat den Zweck die Adduktspots aufgrund ihrer Lipophilie zu trennen. Dazu verwendet man einen hochmolaren Natriumdihydrogenphosphatpuffer, der die kationischen Stellen auf der Polyethylenimincelluloseplatte absättigt, so dass die Adduktspots nur noch aufgrund ihrer Lipophilie von der festen Phase adsorbiert werden.

Nach der chromatographischen Trennung über Nacht wurden die Papierwicks von den Chromatogrammen abgetrennt und die DC-Platten anschließend mit Hilfe eines Föns getrocknet, da der wässrige Puffer in der Platte das radioaktive Signal stark

vermin-ausgewertet werden. Abb. 8 zeigt zusammenfassend die Vorgehensweise bei der chromatographischen Trennung der HNE-dG Addukte.

20 cm

16 cm

Paperwick 3,2 cm #1

D2 über Nacht

Paperwick 6 cm #1

1,7 M AF pH 3,5

2,7 M SP pH ca. 3,8

Abb. 8: Chromatographische Trennung der HNE-dG Addukte

2.2.6) Auswertung der Chromatogramme im InstantImager

Die getrockneten Chromatogramme wurden in einer Filmkassette in eine durchsichtige Klarsichtfolie eingepackt und in den InstantImager eingelegt. Beim InstantImager ha

delt es sich um eine Art Geigerzähler, der es ermöglicht punktuelle Radioaktivität also z.B. die Adduktspots auf den o.g. Dünnschicht-Chromatogrammen in Echtzeit auf ei-nem Computerbildschirm sichtbar zu machen und quantitativ zu erfassen. Abb. 10 zeigt das Dünnschichtchromatogramm einer DNA-Probe aus der Rattenleber.

Sowohl die Identifizierung als auch die Quantifizierung der Adduktspots erfolgte mit Hilfe von HNE-dG und Hexenal-dG Adduktstandards. Für diesen Zweck wurden bei jedem Versuch Kalbsthymus-DNA Standards vermessen, welche mit HNE-dG gespi-ked waren. Dazu wurden Kalbsthymus-DNA Proben mit einer steigenden Menge an synthetischem HNE-dG (1,6; 3,2; 4,8; und 6,4 fmol HNE-dG) versetzt. Zudem wurden zu jeder DNA Probe 50 fmol Hexenal-dG pipettiert. Das Hexenal-dG diente als interner Standard! Der interne Standard ermöglicht die Quantifizierung der HNE-dG Ad-duktspiegel in den DNA-Proben aus Leber- bzw. Nierengewebe mit geringer analyti-scher Variation. Mit dem internen Standard wurden also alle Werte normiert. Die HNE-dG Adduktmenge [fmol] wurden mit Hilfe der Geradengleichung der Kalibriergeraden ermittelt und zur eingesetzten DNA-Menge ins Verhältnis gesetzt. Auf diese Weise erhält man die Adduktspiegel HNE-dG in Addukten / 10⁹ Basen.

1050

Abb. 9: Beispiel für eine Kalibriergerade von HNE-dG mit der Geradengleichung: y = 465x + 500

Abb. 10: Dünnschichtchromatogramm einer untersuchten DNA-Probe aus der Leber. Die Spots zur Hintergrundmessung dienen der Ermittlung der unspezifisch gebundenen Radioaktivität, welche vom Signal des HNE-dG abgezogen werden müssen.

Alle für eine Tiergruppe bestimmten HNE-dG Adduktspiegel wurden zunächst durch Bildung von MW, SD und VK als einzelner Zahlenwert widergegeben. Mittels einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) wurde untersucht ob zwischen den Addukt -spiegeln einzelner Tiergruppen mit gleicher Fett- aber unterschiedlicher Antioxidan-tienversorgung ein signifikanter Unterschied besteht oder nicht.

2.3) Kontrollexperimente zum ³²P-Postlabelling

Zur Kontrolle der vor dem eigentlichen Postlabelling-Vorgang durchgeführten Schritte DNA-Verdau und NP-1 Anreicherung wurden die beiden folgenden Kontrollversuche durchgeführt.

2.3.1) Verdaukontrolle

Vor der NP-1 Anreicherungsreaktion wurde dem Reaktionsansatz jeweils ein Aliquot von 2µg DNA-Verdau entnommen und später in einem separaten Versuch mittels

γ-32P-ATP gelabelt; hierfür wurden nur 60% der Mengen von Kinasepuffer und ³²P-ATP eingesetzt. Nach 45 min Inkubation wurde die Reaktion mit jeweils 800µl 1x TE-Puffer abgestoppt und auf eine gesondert vorbereitete DC-Platte aufgetragen. Das Chroma-togramm wurde eindimensional in AS/SP-Puffer (250 mM AS, 40 mM SP; pH4,4) ent-wickelt und anschließend im InstantImager ausgewertet.

Abb. 11: Verdaukontroll unten ATP darüber die „normalen“ Nukleotide Adenosin, Guanosin, Thymidin, Cytidin

2.3.2) ATP-Überschusskontrolle

Zur Kontrolle ob die Anreicherung der adduktierten Basen gegenüber den „norma-len“ Basen erfolgreich verlaufen ist, d.h. primär HNE-dG und Hex-dG Addukte

ge-kontrolle durchgeführt. Das bedeutet, dass zum Reaktionsrückstand der Postlabel-ling-Ansätze jeweils 800µl 1x TE-Puffer gegeben wurden, davon wurden anschließend je 10µl auf eine entsprechend vorbereitete DC-Platte aufgetragen.

Das Chromatogramm wurde in AS/SP-Puffer entwickelt und im InstantImager sichtbar gemacht. Abb. 12 zeigt ein solches Chromatogramm.

Abb. 12: ATP-Überschußkontrolle

Die Spots auf der unteren Seite von Abb. 12 zeigen den ATP-Überschuß, am obe-ren Ende der Abbildung befinden sich einige schwächere Spots, sie zeigen freies radioaktives Phosphat. Im Gegensatz zu Abb. 11 befinden sich zwischen den ATP-Spots und den Phosphatspots keine weiteren ATP-Spots, die normale d.h. nicht modifi-zierte Basen anzeigen würden. Dies ist ein Indiz dafür, dass die NP-1 Anreiche-rungsreaktion erfolgreich verlaufen ist.

2.4) Tierversuch

Alle im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Proben stammten aus einem Tierver-such mit weiblichen Fischer 344 Ratten, der zwischen April und Juni 2001 am

Insti-ATP

P

tut für Toxikologie der Universität Würzburg durchgeführt wurde. Das Versuchde-sign war wie folgt:

Jeweils 10 Tiere (Gruppe 2-5) wurden mit vier verschiedenen Speiseölen (Kokosöl, Olivenöl, Rapsöl und Sonnenblumenöl) behandelt. Eine weitere Gruppe (Gruppe 1) von ebenfalls 10 Tieren diente als Kontrollgruppe und erhielt fettarme Nahrung.

Von den verschiedenen Speiseölen wurden an 5 Tagen / Woche jeweils 1ml / Tier und Tag oral per Schlundsonde verabreicht. Jede 10er Gruppe wurde in zwei Teil-gruppen unterteilt, wobei je fünf Tiere eine Standarddiät mit normalem Vitamin E und Selengehalt und dem jeweiligen Speiseöl erhielten, die anderen 5 Tiere erhiel-ten dagegen eine Vitamin E- und Selenarme Sonderdiät, ebenfalls mit dem ent-sprechenden Speiseöl kombiniert. Tabelle 1 fasst den Tierversuch als Übersicht zusammen:

Tabelle 1: Tierernährung

Gruppe Ernährung normale Vitamin E

und Selenversorgung

Sonnenblumenöl enthält zu ca. 60% Linolsäure, Rapsöl zu 22%, Olivenöl zu 9 % und Kokosöl zu 1%. Die Linolensäure (ω-3 Fettsäure) ist zu 0,5% in Sonnenblumenöl und zu 9,5% in Rapsöl enthalten. Der Energieinhalt ist bei allen Speisefetten in etwa gleich und liegt zwischen 875 und 882 kcal/kg Futtereinwaage.

3) Ergebnisse

Im nun folgenden Kapitel sollen die Ergebnisse der HNE-dG Adduktspiegel-bestimmungen in Leber- und Nierengewebe von weiblichen F344 Ratten zusammen-gefasst werden.

3.1) HNE-dG Adduktspiegel in der Leber von weiblichen F 344 Ratten

In Tabelle 2 sind die Ergebnisse der HNE-dG Adduktspiegelbestimmungen in der Le-ber von weiblichen F 344 Ratten dargestellt:

Tabelle 2: HNE-dG Adduktspiegel in der Leber von F 344 Ratten

Gruppe Ernährung

Betrachtet man die HNE-dG Adduktspiegel in den Lebern derjenigen Tiere, die mit der Nahrung eine normale Vitamin E und Selenversorgung erhielten, so sieht man, dass diese bei den Tiergruppen 2 bis 5 im Vergleich zur Kontrolle deutlich erhöht sind. Bei Gruppe zwei um Faktor zwei, bei Gruppe drei um Faktor 1,6, bei Gruppe vier um Faktor 1,7 und bei Gruppe fünf um Faktor 2,3. Alle Gruppen mit Vitamin E- und Selendefizienter Diät zeigen ebenfalls sowohl im Vergleich zur Kontrolle als auch im Vergleich zu den Tieren mit normaler Vitamin E- und Selen-Versorgung deutlich erhöhte HNE-dG Adduktspiegel. Am deutlichsten fällt der Unterschied in den Adduktspiegeln zwischen Vitamin E- und Selenmangel und Normaldiät bei den

Tieren der Kontrollgruppe und den Tieren der Gruppe 3 (Olivenöl) auf. Bei diesen Tiergruppen mit Vitamin E- und Selenarmer Diät sind die HNE-dG Adduktspiegel im Vergleich zu den Tieren, welche eine normale Vitamin E- und Selenversorgung aufweisen um Faktor zwei erhöht. Dieser Unterschied ist in beiden Fällen auch sta-tistisch signifikant, wie man an dem P-Wert, der weit unter 0,01 liegt, sehen kann.

Bei den Gruppen 2 und 5 zeigt sich dagegen bezüglich der HNE-dG Adduktspiegel kaum ein Unterschied zwischen Vitamin E- und Selenarmer Diät und der Normaldi-ät. Bei Gruppe 2 kann man lediglich eine Tendenz zu einem höheren HNE-dG Ad-duktspiegel bei der Mangeldiät erkennen.

0 50 100 150 200 250 300

Kontrolle Kokosöl Olivenöl Rapsöl Sonnenblumenöl

Addukt/10 Nukleotide

Kontrolldiät Selenarme Diät p=0,006

p=0,219 p<0,001

p=0,537

Abb.13: Ergebnisse der HNE-dG Adduktspiegelbestimmungen in der Leber von F344 Ratten

3.2) HNE-dG Adduktspiegel in der Niere von weiblichen F 344 Ratten

In Tabelle 3 sind die Ergebnisse der HNE-dG Adduktmessungen in der Niere von weiblichen F 344 Ratten zusammen mit deren Ernährungsweise dargestellt.

Tabelle 3: HNE-dG Adduktspiegel in der Niere von F 344 Ratten

Gruppe Ernährung

Die HNE-dG Adduktspiegel in den Kontrollgruppe unterscheiden sich kaum voneina n-der, wenn man die Tier mit normaler Selen- und Vitamin E Versorgung mit der Selen- und Vitamin E Mangelgruppe vergleicht. Auffällig ist die hohe SD bei den Gruppen zwei und drei mit normaler Antioxidantienversorgung. Sie wurde verursacht durch eine Nieren DNA-Probe, die einen sehr hohen HNE-dG Adduktspiegel aufwies. Diese Pro-be wurde Pro-bei der Bestimmung des Mittelwerts Pro-berücksichtigt, da nicht ausgeschlossen werden kann, dass in einem Individuum eine Lipidperoxidation in größerem Ausmaß stattgefunden hat. Bei den Tieren der Kontrollgruppe mit Antioxidantienmangel kann ein leichter Anstieg der HNE-dG Adduktspiegel beobachtet werden, der statistisch al-lerdings nicht signifikant ist.

Betrachtet man die HNE-dG Adduktspiegel der mit Kokosöl behandelten Tiere, so zeigt sich, dass diese bei den Proben aus den Ratten mit normaler Selen- und Vitamin E Versorgung höher liegen im Vergleich zu jenen Tieren, welche die entsprechende

Mangeldiät erhielten. Allerdings ist dieser Unterschied statistisch ebenfalls nicht signifi-kant, da die SD in dieser Gruppe ebenfalls sehr hoch ist, der Variationskoeffizient liegt hier bei 60 %.

Verglichen mit den Adduktspiegeln der Kontrollgruppe sind diese Adduktspiegel aber deutlich erhöht und zwar um den Faktor drei bei den Tieren mit Selen- und Vitamin E-Mangel und um Faktor zehn bei den Tieren mit guter Antioxidantienversorgung.

Die HNE-dG Adduktspiegel in den Proben von Tieren, die oral mit Olivenöl beha ndelt wurden sind im Vergleich mit den Kontrolltieren etwa um Faktor 11 erhöht. Ein Unter-schied zwischen den Tieren mit Antioxidantiendiät und jenen mit normaler Selen- und Vitamin E Versorgung kann hier nicht gefunden werden.

Die mit Rapsöl behandelten Ratten zeigen in ihren Nieren im Vergleich zur Kontroll-gruppe ebenfalls leicht erhöhte HNE-dG Adduktspiegel. Diese liegen bei Faktor drei bei den Tieren mit normaler Vitamin E- und Selenversorgung und bei Faktor zwei bei den Tieren mit der entsprechenden Mangeldiät. In dieser Gruppe sind die HNE-dG Werte also bei weitem nicht so stark erhöht, wie das bei den Tieren der Fall war, die mit Kokosöl behandelt wurden. Der Variationskoeffizient liegt bei diesen Proben mit 32% bzw. 34% in einem Bereich, der für in vivo Versuche üblich ist.

Die mit Sonnenblumenöl behandelten Tiere zeigen im Vergleich mit den entspreche n-den Kontrolltieren erhöhte HNE-dG Adduktspiegel. Die Variationskoeffizienten liegen mit 20% (Selen-/Vitamin E Normalversorgung) und 13% (Selen-/Vitamin E Mangel) erstaunlich niedrig für in vivo Verhältnisse. Ein signifikanter Unterschied zwischen den Tieren mit normaler und jenen mit defizienter Selen- und Vitamin Ernährung kann hier nicht gefunden werden.

0 20 40 60 80 100 120

Kontrolle Kokusöl Olivenöl Rapsöl Sonnenblumenöl

Addukte/10 Nukleotide

HNE-dG Adduktspiegel bei normaler Vitamin E und Selenversorgung

HNE-dG Adduktspiegel bei Vitamin E und Selenmangel

Abb.14 Ergebnisse der HNE-dG Adduktspiegelbestimmung in der Niere von F344 Ratten

30 4) Diskussion

4.1) ³²P-Postlabelling zur quantitativen Detektion von DNA-Schäden

Das Postlabelling Verfahren zur Detektion von DNA Schäden wurde von Gupta und Randerath entwickelt. [7]. Seine Stärke besteht v.a. darin, dass durch den Einsatz von Radioaktivität geringste Konzentrationen eines DNA-Addukts (im fmol-Bereich) ermittelt werden können. Voraussetzung für die Anwendung dieses Verfahrens ist allerdings, dass die chemische Struktur des gesuchten Addukts bekannt ist und ein synthetischer Standard desselben zwecks Identifikation zur Verfügung steht. Mög-lich ist aber auch eine qualitative Analyse von DNA-Proben im Hinblick auf eventu-ell gebildete Addukte, man bezeichnet dies dann als relatives Adduktlabeventu-elling. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe von synthetischem HNE-dG und Hex-dG die Adduktspots im Chromatogramm identifiziert und über eine Kalibriergerade quantifiziert.

Um die analytische Variabilität möglichst gering zu halten, wurde bei den Experi-menten synthetisches Hex-dG als interner Standard mitgeführt, der ebenfalls alle beschriebenen analytischen Schritte vom DNA-Verdau bis zur Postlabelling-Reaktion durchläuft. Dies zeigt einerseits, ob der Versuch ordnungsgemäß abge-laufen ist und ermöglicht eine Korrektur des HNE-dG Signals mit Hilfe des Hex-dG Signals. Ergänzend wurden je eine Verdaukontrolle und je eine ATP-Überschußkontrolle durchgeführt. Hex-dG ist dem eigentlichen Analyten HNE-dG chemisch ähnlich und chromatographiert mit den verwendeten Fließmitteln zu-sammen auf der Dünnschichtplatte. Die Verwendung eines internen Standards er-höht die Reproduzierbarkeit der Postlabelling-Methode. Sie zeigt ob die Ver- esterung der 5´OH Gruppe im Desoxyriboseanteil des gesuchten HNE-dG Addukts in der Probe mit ³²P markiert in befriedigender Weise erfolgt ist.

4.2) Ziele des Tierversuchs

Das Ziel des in Kapitel 2.6 beschriebenen Tierversuchs, war eine Selendepletion in den Zielorganen der einzelnen Tiere zu erreichen, die Selen- und Vitamin E-arm ernährt wurden. Selen ist unter anderem ein Bestandteil von

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