Einfluss des Vanadiumgehalts von Ti - Al-V- Legi er u η gen

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Einfluss des Vanadiumgehalts von Ti - Al-V- Legi er u η gen

auf ZeLladhäsion und Biokompatibilität*

Für mechanisch hoch belastete orthopädische Implantate ist es wich- tig eine gute Verbindung zwischen Lagergewebe und Implantat zu er- zielen. Dies kann nur erreicht werden, wenn die Oberflächeneigen- schaften das Einwachsen und die Adhäsion der Lagergewebezellen begünstigen. Der Vanadiumgehalt in der Legierung TiAl6V4, die stan- dardmäßig für hoch belastete Implantate verwendet wird, ist als zytotoxisch bekannt. Trotzdem wird diese Legierung als biokompati- bel erachtet. Das Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es fest- zustellen, ob Vanadium einen Einfluss auf die Adhäsion, Proliferati- on, Viabilität und Morphologie von Zellen (Fibroblasten, Osteobla- sten, Epithelzellen) hat, die in direktem Kontakt auf vanadiumhalti- gen Substraten kultiviert wurden. Um herauszufinden, ob ein Ein- fluss des Vanadiumgehalts auf die Zelladhäsion besteht wurde ein

Strömungskanal konstruiert, der unter laminaren Strömungsbedin- gungen die Untersuchung der Zelladhäsion auf metallischen Proben ermöglicht.

E.Eisenbarth', J. Breme¹, H. HildebrancH

Schlagworte:

Titanlegierungen - Vanadiumgehalt - Zelladhäsion - Strömungskanal

Einleitung

Für den erfolgreichen Einsatz eines enossalen I m p l a n t a t s ist es sehr wichtig, ein gutes A d h ä s i o n s - u n d E i n w a c h s v e r h a l - ten des Lagergewebes an dem Biomaterial zu erzielen.

Eine u n z u r e i c h e n d e V e r a n k e r u n g des I m p l a n t a t s im u m l i e - g e n d e n Gewebe f ü h r t zu u n e r w ü n s c h t e n Relativbewegungen zwischen Implantat und Gewebe, die n i c h t - i n f e k t i ö s e Ent- z ü n d u n g e n u n d Kapselbildung [1] sowie bei Belastung des Implantats dessen Funktionsverlust mit sich bringen. Beim Einsatz d e n t a l e r I m p l a n t a t e muss das Infiltrieren des Kiefer- k n o c h e n s durch Bakterien aus dem M u n d v e r h i n d e r t w e r - den, da dies zum Versagen des I m p l a n t a t s f ü h r t [2],

Eine gute V e r b i n d u n g zwischen Implantat und u m l i e g e n d e m Gewebe k a n n n u r erreicht werden, w e n n die I m p l a n t a t o b e r - fläche der Zelladhäsion g u t e V o r a u s s e t z u n g e n bietet. Die Adhäsion v o n Zellen wird d u r c h die Oberflächenstruktur u n d die - Z u s a m m e n s e t z u n g beeinflusst [3],

Darüber h i n a u s wird die Zelladhäsion durch z y t o t o x i s c h e Effekte m i n d e r biokompatibler Substrate beeinträchtigt. Die Evaluation der V o r a u s s e t z u n g e n , die ein Biomaterial den Zellen bezüglich der A d h ä s i o n bietet k a n n n u r v o r g e n o m - men werden, w e n n der z y t o t o x i s c h e Einfluss des Biomateri- als auf k o n t a k t i e r e n d e Zellen b e k a n n t ist.

Seit einigen J a h r e n v e r s u c h e n verschiedene F o r s c h e r g r u p - pen, die Zelladhäsion a n I m p l a n t a t e n durch Modifizierung der I m p l a n t a t o b e r f l ä c h e zu verbessern. Dabei w u r d e e n t w e - der die O b e r f l ä c h e n t o p o g r a p h i e d a h i n g e h e n d verändert, dass ein Einwachsen der Lagergewebezellen in die Oberflächen- strukturen b e g ü n s t i g t wird, oder die O b e r f l ä c h e n z u s a m m e n - s e t z u n g w u r d e durch B e s c h i c h t u n g des I m p l a n t a t s mit S u b - stanzen wie Hydroxylapatit, Bioglas, Fibronektin, Kollagen

* Zum 80. Geburtstag von Prof. Zwicker

203

oder Vitronektin [4-8], die die Zelladhäsion verbessern, v e r - ä n d e r t . Diese Studien v e r n a c h l ä s s i g e n den Einfluss der Ober- f l ä c h e n z u s a m m e n s e t z u n g des S u b s t r a t m a t e r i a l s auf die Zel- ladhäsion. U n t e r s u c h u n g e n zu dem Einfluss der Legierungs- e l e m e n t e auf die Zelladhäsion sind selten. Metallische Bio- materialien werden oft mit z y t o t o x i s c h e n oder w e n i g bio- k o m p a t i b l e n Elementen, die zugesetzt werden, um die m e - c h a n i s c h e n E i g e n s c h a f t e n des Implantats den A n f o r d e r u n - gen u n t e r physiologischen B e d i n g u n g e n a n z u p a s s e n [9], le- giert. Ein Beispiel d a f ü r ist die Legierung TiA16V4. A u f g r u n d ihrer h e r v o r r a g e n d e n m e c h a n i s c h e n Eigenschaften wird die Legierung TiA16V4, die f ü r den Einsatz in der L u f t - u n d R a u m f a h r t entwickelt wurde, weitverbreitet f ü r m e c h a n i s c h hoch belastete I m p l a n t a t e wie H ü f t g e l e n k s e n d o p r o t h e s e n u n d künstliche Kniegelenke eingesetzt.

Das Element V a n a d i u m , das in dieser Legierung e n t h a l t e n ist, ist f ü r seine z y t o t o x i s c h e n Eigenschaften b e k a n n t [ΙΟ-

Ι 2]. Dennoch wird diese Legierung als biokompatibel e i n g e - stuft, weil der V a n a d i u m g e h a l t g e r i n g ist u n d teilweise in fester Lösung in der ß - P h a s e vorliegt.

Mit a b n e h m e n d e r U m f o r m u n g s - u n d der W ä r m e b e h a n d - l u n g s t e m p e r a t u r k a n n der Anteil der ß - P h a s e g e r i n g sein ( W ä r m e b e h a n d l u n g im α + β - P h a s e n g e b i e t ) . Da V a n a d i u m ß - stabilisierend wirkt, k a n n d a d u r c h der V a n a d i u m g e h a l t lokal stark ansteigen [13].

Bei der Fertigung v o n geschmiedeten H ü f t g e l e n k p r o t h e s e n ist ein Auslagerungsprozess, der im Temperaturbereich v o n 3 5 0 - 5 5 0 ° C [14] v o r g e n o m m e n wird, um die Festigkeitsei- g e n s c h a f t e n einschließlich Ermüdungsfestigkeit zu steigern, üblich. Bei dieser W ä r m e b e h a n d l u n g k a n n der V a n a d i u m g e - halt lokal (in der ß - P h a s e ) auf m e h r als 15 °/o a n s t e i g e n . Sogar n a c h einem Glühprozess zum Verringern v o n Eigen-

1 Lehrstuhl fur metallische Werkstoffe, Universität des Saarlandes. Saarbrucken 2 Croupe de Recherche sur les ßiomateriaux, Universite de Line

BlOmaterialien 2 (4), 2001

ORIGINAL ARBEITEN

Spannungen (Spannungsarm-Glühcn bei 480 bis 595 °C) ist der Vanadiumgehait in der ß-Phase höher als 15 °/o.

Das Ziel dieser Untersuchungen war es, zu studieren, ob die Viabilität und das Adhäsionsvermögen verschiedener Zellty- pen durch den Vanadiumgehalt von Ti-Al-V-Legierungen be- einflusst wird. Der Vanadiumgehalt der Legierungen wurde variiert und entspricht der Zusammensetzung der ß-Phase nach Durchlaufen von Verformungs- und Wärmebehand- lungsprozessen bei unterschiedlichen Temperaturen im (a+ß)- Phasen-Gebiet.

Die Untersuchungen erstreckten sich auf Zelladhäsionstests, Proliferationsrate, Klonbildungstests zur Bestimmung der LC 50 von Ti-Al-V-Pulvern und der Zellmorphology verschie- dener Zelltypen in direktem Kontakt mit entsprechenden Substraten unter ln-vitro-Bedingungen.

Material und Untersuchungsmethoden

Herstellung der Proben mit unterschiedlichem Vanadiumgehalt

Sechs Legierungen mit unterschiedlichem Vanadiumgehalt wurden hergestellt: TiAll,5Vl,5; TiAll,5V3; TiAll,5V6;

TiAll,5V12 und TiAll,5V25. Titan technischer Reinheit grade 2 wurde als vanadiumfreier Referenzwerkstoff ver- wendet. Der Anteil von 1,5 °/o Aluminium entspricht dem Gehalt in der ß-Phase im (a+ß)-Gebiet. Der ansteigende Va- nadiumgehalt simuliert die lokalen Vanadiumkonzentratio- nen, die in der Legierung TiA16V4 bei Verringerung des Ver- formungsgrades und der Wärmebehandlungstemperatur auf- treten können. Ein Vanadiumgehalt von 18 °/o entspricht dem der ß-Phase nach einer Gliihung bei 500 ° C [13], Die Legierungen wurden in Form von zirka 200 g schweren Schmelzzigarren im elektrischen Lichtbogenofen unter Ar- gonatmosphäre erschmolzen. Die Homogenisierung erfolgte bei 1100° C, anschließend wurden die Zigarren in Wasser abgeschreckt, um eine homogene Verteilung des Vanadiums in den Proben zu erhalten. Von den Legierungen wurden drei Typen von Proben hergestellt.

Für die Proben (Passungen) für den Strömungskanal (Abb.

2) wurden die Legierungen bei 900° C zu Stangenmaterial ( 0 9 mm) warmgewalzt. Die Stangen wurden 5 min bei 1000° C geglüht und in Wasser abgeschreckt, um ein ß-Ge- füge zu erhalten. Von den gewalzten Stangen wurden die Passungen für den Strömungskanal abgedreht. Die Passun- gen wurden mit SiC-Papier der Körnung 2500 geschliffen und profilometrisch vermessen. Der Mittenrauwert der so strukturierten Passungen beträgt Ra = 0,213 pm. Die mit dem Profilometer aufgenommene Oberflächentopographie der Passungen ist in Abbildung 1 dargestellt. Anschließend wurden die Passungen in Alkohl und Aceton gewaschen, ge- trocknet und heißdampfsterilisiert. Die Besiedlung mit Zellen erfolgte in einer 12-well-plate.

Abb. I: Oberfläche einer Ti-Al-V-Probe nach

Schleifen mit SiC-Papier der Körnung 2500 ^8.00

6.00 4.00

E. Eisenbarth: Einfluss des Vanadiumgehalts von Ti-Al-V-Legierungen Die mit Zellen bewachsenen Passungen wurden in die Wand des Strömungskanals eingesetzt, um die Zelladhäsion zu messen.

Für die Bestimmung der Zellproliferation wurden polierte Plättchen der Werkstoffe benötigt. Die Schmelzzigarren wurden durch Flachwalzen auf 3 mm Stärke warmverformt und homogenisiert (1100° C). Aus dem Blech wurden Plätt- chen ( 0 20 mm χ 2 mm) hergestellt. Die Plättchen wurden mit SiC-Papier geschliffen und abschließend mit Al²0³-Sus- pension poliert.

Um den Einfluss des Vanadiumgehalts auf die Klonbildungs- rate und die Zellmorphologie zu ermitteln, wurde Metallpul- ver der Legierungen benötigt.

Die Erschmelzung der Legierungen erfolgte ebenfalls im elektrischen Lichtbogenofen in muldenförmigen Kokillen.

Die Schmelzknöpfe wurden wie bereits beschrieben homoge- nisiert, wärmbehandelt bei 1100 °C und in Wasser abge- schreckt. Die Pulverherstellung erfolgte im HDH-Prozess. In einer Wasserstoffatmosphäre im Temperaturbereich von 500 bis 600 °C nehmen die Legierungen Wasserstoff auf und verspröden dadurch. Die versprödeten Schmelzknöpfe wur- den in einer Kugelmühle zu Pulver der gewünschten Korn- größe gemahlen. Das Pulver wurde anschließend unter Va- kuum bei 300 bis 600 °C dehydriert. Die für die Zellversuche benötigte Fraktion von Pulverkörnern < 50 pm, wurde abge- siebt, gereinigt und autoklaviert.

Messung der Zelladhäsion

Die Versuchsanordnung zur Messung der Zelladhäsion mit Hilfe des Stömungskanals ist in Abbildung 2 dargestellt.

1 - PBS-Reservoir 2 - Heizelement 3 -Pumpe 4 -Transformator 5 - Strömungskanal

6 - Durchflußmeßgerät 7 - Meßstrecke 8 - Strömungseinlaß

- mediumführende Verbindungen

— = stromführende Verbindungen

Abb. 2: Versuchsanordnung mit dem Strömungskanal

Das Strömungsmedium (PBS) wird 30 Minuten vor Ver- suchsbeginn auf 37 °C erwärmt und wird während des Ver- suchs in dem Reservoir (1) durch das Wärmeelement (2) auf dieser Temperatur gehalten. Das Medium fließt vom Reser- voir zur Pumpe (3), deren Leistung mit einem Transformator (4) regelbar ist. Der Volumenstrom durch den Kanal (5) wird ständig gemessen und auf dem Durchflussmessgerät (6) an- gezeigt. Das Strömungsmedium läuft durch den Kanal mit der Messstrecke, in der sich die mit Zellen besiedelte Pas- sung befindet (7) und zurück zum Reservoir.

Die Konstruktion des Strömungskanals ermöglicht unter

2 0 4 ^BOm a t e r i a i i e n 2 w-^{2 0 0 1}

Ε. Eisenbarth: Einfluss des Vanadiumgehalts von Ti-A(-V-Legierungen

k o n s t a n t e n S t r ö m u n g s b e d i n g u n g e n eine m a x i m a l e W a n d - s c h e r s p a n n u n g v o n τ = 24 N/m2 bei einem V o l u m e n s t r o m v o n V = 248 ml/min, entsprechend einer S t r ö m u n g s g e - schwindigkeit von 2,1 m/s.

Um in der Messstrecke l a m i n a r e S t r ö m u n g s b e d i n g u n g e n si- cherzustellen muss die l a m i n a r e Anlaufstrecke v o n 44 mm zwischen Eintritt des Mediums in den Kanal (8) und Mess- strecke (7) eingehalten werden. Die Ü b e r p r ü f u n g der Strö- m u n g s q u a l i t ä t w u r d e durch Einspritzen von suspendiertem A l u m i n i u m p u l v e r in die S t r ö m u n g ermöglicht. Der Strö- m u n g s v e r l a u f wurde über den P a s s u n g e n in der Kanalwand der Messstrecke mit einer Videokamera bei verschiedenen Strömungsgeschwindigkeiten a u f g e z e i c h n e t u n d auf T u r b u - lenzen ü b e r p r ü f t .

Bei exakt eingesetzten P a s s u n g e n in der Kanalwand (nicht verkantet oder schräg angeschliffen) k o n n t e sichergestellt werden, dass in der Messstrecke bis zu einem V o l u m e n s t r o m v o n 150 ml/min keine Turbulenzen a u f t r e t e n . Unter der V o r a u s s e t z u n g laminarer S t r ö m u n g s b e d i n g u n g e n k a n n aus dem V o l u m e n s t r o m im Kanal die auf die Zellen wirkende W a n d s c h e r s p a n n u n g g e m ä ß Gleichung 1 ermittelt werden.

τ= W a n d s c h e r s p a n n u n g an der Kanalwand [N/m²] η = D y n a m i s c h e Viskosität

des Mediums [Pa • s]

V= V o l u m e n s t r o m [m3/s]

b= Kanalbreite [m]

h= d u r c h s t r ö m t e K a n a l h ö h e [m]

Für j e d e n Versuch werden sechs mit Zellen b e w a c h s e n e Pas- sungen benötigt. Drei v o n ihnen werden verwendet, um zu bestimmen, wie viele Zellen v o r dem S t r ö m u n g s v e r s u c h auf den Proben h a f t e n . Dazu werden die P a s s u n g e n dem well plate e n t n o m m e n und vorsichtig gewaschen, um nicht oder nur lose a n h e f t e n d e Zellen zu e n t f e r n e n . Anschließend w e r - den die Zellen trypsiniert, suspendiert in Medium u n d ge- zählt. Die drei verbleibenden P a s s u n g e n werden n a c h e i n a n - der in die Kanalwand eingesetzt, auf Passgenauigkeit ü b e r - p r ü f t und 40 sec einem voreingestellten V o l u m e n s t r o m a u s - gesetzt. Danach wird die Zellzahl auf den überströmten P a s - s u n g e n bestimmt. Das Ergebnis j e d e s Versuchs ist der Anteil a d h ä r e n t e r Zellen n a c h Uberströmen bezogen auf die Aus- gangszellzahl in A b h ä n g i g k e i t vom V o l u m e n s t r o m (und somit der W a n d s c h e r s p a n n u n g ) f ü r j e d e n Werkstoff. Für die Adhäsionstests w u r d e eine etablierte Kultur h u m a n e r e m - bryonaler Lungenepithelzellen (LI32) h e r a n g e z o g e n . Das Kulturmedium (M199) enthielt 5 % FKS, 100 p g / m l Penicil- lin, 100 p g / m l Streptomycin, 4 mmol/1 L - g l u t a m i n e (Alle Reagenzien: ICN).

Für die Versuche w u r d e n Zellen in der Log-Phase des W a c h s t u m s bei zirka 70 °/o Konfluenz trypsiniert, gezählt, mit Medium suspendiert u n d in der g e w ü n s c h t e n Dichte auf den P a s s u n g e n verteilt. Die Zellen w u r d e n sieben Tage auf den P a s s u n g e n kultiviert, das Medium w u r d e n nach drei Tagen gewechselt. Alle zwei Tage w u r d e der Zustand der Zellen und die Besiedlungsdichte ü b e r p r ü f t .

Zytotoxizität der vanadiumhaltigen Legierungen Zur Überprüfung, ob die v a n a d i u m h a l t i g e n Ti-Al-Legierun- gen einen toxischen Einfluss auf Zellen haben, w u r d e n v e r - schiedene Tests mit unterschiedlichen Zelltypen v o r g e n o m - men:

Die Bestimmung der Konzentration v o n Metallpulver im Medium, die zu einem Absterben v o n 50 °/o der Zellen (LC50) innerhalb v o n 6 Tagen Kultivierungszeit führt, w u r d e

0 RI G I N A L ^ ä ä ä a ä i ·

mit cp-Titan, TiAll,5V3 und mit T i A l l , 5 V 2 5 v o r g e n o m m e n . Für den Test w u r d e n L132-Zellen ( h u m a n e e m b r y o n a l e Lun- genepithelzellen) v e r w e n d e t . Die Kultivierung w u r d e wie b e - reits beschrieben d u r c h g e f ü h r t . Das Metallpulver (Korngröße

< 50 pm) w u r d e u n t e r UV-Licht sterilisiert u n d mit dem Me- dium gemischt. F o l g e n d e K o n z e n t r a t i o n e n des Metallpulvers im Kulturmedium der Zellen w u r d e n v e r w e n d e t : 0 (Refe- renz), 25, 50, 100, 2 0 0 u n d 4 0 0 p g / m l Z e l l k u l t u r m e d i u m . Die Zellen w u r d e n mit der Pulversuspension in Petrischalen kultiviert. Jeder V e r s u c h s a n s a t z w u r d e dreimal v o r g e n o m - men. Pro Petrischale w u r d e n 4 0 0 Zellen ausgesät, die n a c h sechs Tagen gut v o n e i n a n d e r g e t r e n n t e Klone bildeten. Die Anzahl der Klone w u r d e u n t e r dem Lichtmikroskop b e - stimmt.

Abb. 3: L! 32-Klone nach Kultivierung mit cp-Titan-Puiver

A b b i d l u n g 3 zeigt Klone v o n L132-Zellen n a c h der Kultivie- r u n g mit cp-Titan. Die Anzahl der Klone, die mit Metallpul- ver kultiviert w u r d e n , w u r d e verglichen mit der Referenz (ohne Pulverzugabe).

Die Zellproliferation auf den v a n a d i u m h a l t i g e n Proben w u r d e mit M C 3 T 3 - E l - o s t e o b l a s t o i d e n Zellen b e s t i m m t . Von j e d e r Legierung w u r d e n n e u n polierte Plättchen hergestellt,

die in drei Gruppen eingeteilt w u r d e n . Es w u r d e n drei v o n - e i n a n d e r u n a b h ä n g i g e Versuchsansätze mit j e drei Plättchen zur Z e l l z a h l b e s t i m m u n g v o r g e n o m m e n . Die Zellproliferation auf den v a n a d i u m h a l t i g e n Plättchen w u r d e auf cp-Titan als Referenz (100 °/o) bezogen.

Pro Plättchen w u r d e n 10 000 Zellen in einem 2 4 - w e l l - p l a t e kultiviert. Nach drei Tagen w u r d e die Zellzahl mit einem Coulter-Counter bestimmt.

Der Einfluss des V a n d i u m g e h a l t s der experimentellen Legie- r u n g e n auf die Zellmorphologie wurde verglichen zwischen Zellen dreier etablierter Zelllinien: L132 ( h u m a n e e m b r y o n a - le Lungenepithelzellen), NIH-3T3 (murine Fibroblasten) u n d MC3T3-E1 (murine osteoblastoide Zellen).

Die Zellen w u r d e n sechs Tage l a n g kultiviert mit 2 0 0 p g / m l Pulver der e x p e r i m e n t e l l e n Legierungen, mit c p - T i t a n p u l v e r und o h n e Pulver als Referenz.

Nach 6 Tagen w u r d e das pulverhaltige M e d i u m e n t f e r n t , und die Zellen m e h r m a l s mit PBS g e w a s c h e n . Die F ä r b u n g erfolgte mit Kristallviolett. Jeder Zelltyp zeigte typische Ä n - d e r u n g e n der M o r p h o l o g i e u n t e r dem Einfluss des Pulvers, die mit steigendem V a n a d i u m g e h a l t stärker a u s g e p r ä g t w u r - den.

Ergebnisse

Zelladhäsion

Von j e d e r Legierung w u r d e n 9 mit Zellen besiedelte P a s s u n - gen 40 sec einem V o l u m e n s t r o m v o n 60 m l / m i n ausgesetzt.

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"ARBEITEN

Die relative Zellzahl nach dem Test auf den Proben noch ad- härenter Zellen ist f ü r j e d e n Werkstoff in Abbildung 4 dar- gestellt.

Zelltyp: L132 Kult zeit 7 Tg Vol ström: 60 ml-'min.

Versuchsdauer: 40 sec n=9 r=0 9916

5 10 15 20 Vanadiumgehalt [Gew. %]

Abb. 4: Anteil adhärenter Zellen (LI32) in Abhängigkeit vom Vanadium- gehalt der Proben

Abbildung 4 zeigt, dass mit ansteigendem Vanadiumgehalt der Anteil adhärenter Zellen nach Überströmen exponentiell abnimmt. Die Ergebnisse werden relativ zum Anteil ad- härenter Zellen nach Überströmen der Proben auf cp-Titan- passungen (grade 2) dargestellt. In Vorversuchen wurde be- reits ermittelt, dass ein Aluminiumgehalt von 1,5 °/o keinen messbaren Einfluss auf die Adhäsion und die Viabilität von Zellen gegenüber cp-Titan als Substrat hat.

Um den Einfluss des Vanadiumgehalts der Substrate auf die Adhäsion von L132-Zellen zu quantifizieren war es nötig, v o n allen Proben den gleichen Anteil von Zellen durch A n - p a s s u n g des Volumenstroms abzulösen. Zu diesem Zweck w u r d e f ü r j e d e n Werkstoff der Volumenstrom bestimmt, der innerhalb von 40 sec. Strömungsdauer zur Ablösung von 50 o/o der Zellzahl auf den nicht überströmten Blindproben führt.

Gleichung 1 wird verwendet, um die W a n d s c h e r s p a n n u n g zu bestimmen, der die Zellen unter den beschriebenen Ver- suchsbedingungen ausgesetzt waren. Abbildung 5 zeigt den Einfluss des Vanadiumgehalts der Passungen auf den Volu-

50 45 40 ε ζ 35

α ο

=3 30

α Q _ 25

CL>

sz 20

TD

£= 15

10 10

0

Zefityp L132 Kultivierungszeit 7 days Strömungsdauer' 4 0 sec

menstrom, der zu einer Ablösung von 50 °/o der L132-Zellen bei 40 sec Strömungsdauer führt.

Der Volumenstrom, der zu einer 50%igen Ablösung der Zel- len auf den Substraten aus cp-Titan u n d T i A l l , 5 V l , 5 führt, musste aus den Messergebnissen mit niedrigerem Volumen- strom extrapoliert werden. Ähnlich wie in Abbildung 4 zeigt auch Abbildung 5, dass auch geringe Vanadiumgehalte zu einer Verringerung der Adhäsionskraft der Zellen führen.

Bei einem Anteil von 3 °/o Vanadium im Substrat ist der Un- terschied im Adhäsionsvermögen der Zellen signifikant im Vergleich zur Referenz aus cp-Titan. Gleichung 2 ermöglicht die Berechnung des Volumenstroms, der zur Ablösung von 50 % der L132-Zellen auf den Blindproben führt, aus dem Vanadiumgehalt im Substrat.

V = 4 5 + 4 5 7 - e Vx

L9 V = Volumenstrom [ml/min]

V^x = Vanadiumgehalt der Probe Zyto toxi ζ i tä ts- Tes ts

Bestimmung des LC50-Wertes

Die Überlebensrate der L132-Zellen, die mit cp-Titan-, TiAll,5V3- und TiAll,5V25-Pulver kultiviert wurden ist in Abhängigkeit von Pulverkonzentration im Medium in Abbil- d u n g 6 dargestellt. Für TiAll,5V25 entspricht der LC50-Wert einer Konzentration des Pulvers im Kulturmedium von 230 pg/ml.

100 80 60 40

20 X

_ . Av-

cp-Titan -*- TiAI1,5V3 -Hl·- TiAH ,5V25

100 200 300 400 Pulverkonzentration im Zellkulturmedium

10

Τ 1 1 Γ- ~~Γ"

20

Τ 1 1 Γ "

Vanadiumgehalt IGew. 96]

Abb. 5: Volumenstrom der zum Ablösen von 50 % der LI 32-Zellen er- forderlich ist in Abhängigkeit vom Vanadiumgehalt der Proben

Abb. 6: Versuchsanordnung mit dem Strömungskanal

Bestimmen der Proliferation von MC3T3-EI-Zellen Die Proliferation der Zellen auf den v a n a d i u m h a l - tigen Proben im Vergleich mit der Zellzahl auf cp- Titan und Polystyrol ist in Abbildung 7 dargestellt.

Die Verringerung der Zellzahl als Funktion des Va- nadiumgehalts des Substrats ist vergleichbar zu den Ergebnissen der A b n a h m e der Zelladhäsion von Passungen mit höherem V-Gehalt, die im Strömungskanal untersucht wurden. Nach dreitägi- ger Kultivierung ist bei den Proben mit einem V- Gehalt von 3 °/o die Zellzahl statistisch vermindert (α = 0,05) im Vergleich zu der Zellzahl von Proben aus cp-Titan.

Untersuchung der Zellmorphologie 1. L i 3 2 Epithelzellen

Nach einer Kultivierungszeit von 6 Tagen im Zellkulturme- dium mit 200 pg/ml cp-Titan-Pulver zeigten die Zellen das 500

450 400 350 c 350 300 j=

2M) ο F lyi 700 ^{C ( I i}

b 150 J >

100 50 0

2 0 6 B ,°m a t e r i a i i e n 2 w.2 0 0 1

ORIGINAL* ARBEITEN

Der Zellverband wirkt aufgelockert, und die ersten Vakuolen im Zytoplasma werden sichtbar (Abb. 9).

Die Zellen sehen im Vergleich zu den mit cp- Titan-Pulver kultivierten Zellen kleiner und runder aus. Mit zunehmendem Vanadiumgehalt nimmt die Besiedlungsdichte ab. Abbildung 10 zeigt einige L132-Zellen, die mit 2 0 0 pg/ml Pulver der Zusam- mensetzung T i A l l , 5 V 2 5 kultivert wurden. Der Zy- toplasma-Gehalt der Zellen ist deutlich reduziert, die Zellen sind klein und abgekugelt.

cp-Titan NAH ,5V1,5 TlAI1,5V3 TiAI1,5V6 TiAI1.5V12 TiAI1,5V18 TiAI1,5V25 E. Eisenbarth: Einfluss des Vanadiumgehalts von Ti-Al-V-Legierungen

Abb. 8: LI32-Zellen nach 6 Tagen Kultivierung mit 200 μ^ηι! cp-Ti-Pulver

Abb. 9: LI 32-Zellen nach sechs Tagen Kultivierung mit 200 μg/ml cp-Ti- Pulver

Abb. 7: Proliferation von MC3T3-EI Osteoblasten auf vanadiumhaltigen Ti-Al-Legierungen

normale Erscheinungsbild wie in Abbildung 8 dargestellt:

Die Zellen haben eine polygonale Grundform und liegen als dichter Monolayer vor. Einzeln liegende Zellen bilden an der Peripherie Ausläufer mit denen sie Nachbarzellen kontaktie- ren. Das Zytoplasma weist eine normale Granulierung ohne Vakuolenbildung auf. Die ersten Änderungen der Morpholo- gie können bei der Kultivierung der Zellen mit Metallpulver

ab einem Vandiumgehalt von 6 °/o beobachtet werden. Abb. I0: LI 32-Zellen nach sechs Tagen Kultivierung mit 200 μ^ΓΠΐ TiAl 1.5V6-Pulver

2. NIH-3T3-Fibroblasten

Die Fibroblasten reagieren mit zelltypspezifischen Änderun- gen der Morphologie auf den ansteigenden Vanadiumgehalt in den Pulvern, die sich von den morphologischen Änderun- gen der L132-Zellen unterscheiden.

Das normale Erscheinungsbild der Fibroblasten ist in Abbil- dung 11 nach sechstägiger Kultivierung unter den oben be- schriebenen Bedingungen mit cp-Titan-Pulver zu sehen.

Abb. 11: NIH-3T3-Fibroblasten nach sechs Tagen Kultivierung mit 200 μg/ml cp-Ti-Pulver

Die ersten morphologischen Änderungen der Zellen sind bei Kultivierung mit TiAl 1.5V6-Pulver zu erkennen (Abb. 12).

Mit zunehmendem Vanadiumgehalt der Pulver verstärken sich die folgenden Änderungen im Erscheinungsbild ge- genüber der normalen Form der NIH-3T3-Zellen. Der Zyto-

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'ARBEITEN

plasma-Anteil und die Ausbreitungsfläche der Zellen verrin- gert sich, in den Zellen zeigen sich Vakuolen, u n d die An- zahl der Zellen pro cm2 n i m m t ab. Die Länge und Anzahl der Zellausläufer nehmen ebenfalls ab.

Mit z u n e h m e n d e m Vanadiumgehalt im Pulver, mit dem die Zellen kultiviert wurden verstärken und häufen sich die morphologischischen Ä n d e r u n g e n der Zellen im Vergleich zu den NIH-3T3-Fibroblasten, die mit cp-Titanpulver glei- cher Konzentration im Medium kultiviert wurden. Die Ver- änderungen sind in Abbildung 12 und 13 dargestellt.

E. Eisenbarth: Einfluss des Vanadiumgehalts von ti-Al-V-Legierungen

vorwiegend den ektoplasmatischen Anteil des Zytoplasmas beim Zytoplasmaverlust unter Vanadiumeinfluss.

Abb. 12: NIH-3T3-Fibroblasten nach sechs Tagen Kultivierung mit 200 pg/ml TiAII-5V6-Pulver

Abb. 13: NIH-3T3-Fibroblasten nach sechs Tagen Kultivierung mit 200 μ^πηΙ ΤιΑΙ 1,5V25-Pulver

3. MC3T3-E1-Osteoblasten

Die normale Morphologie der MC3T3-E1-Osteoblasten ist in Abbildung 14 abgebildet.

Die ersten Änderungen im morphologischen Erscheinungs- bild sind ab 3 °/o V a n a d i u m im Metallpulver (TiAll,5V3) als Zusatz zum Kulturmedium der Zellen auszumachen. Die Zel- len entwickeln Vakuolen und verringern den Zytoplasma- Anteil im Verhältnis zur Kerngröße (Abb. 15). Dieser Zyto- plasma-Verlust ist vergleichbar mit dem der NIH-3T3-Zel- len, beginnt aber bei einem niedrigeren Vanadiumgehalt im Pulver mit dem die Zellen kultiviert wurden.

Bei den MC3T3-E1-Osteoblasten k a n n das Zytoplasma in Endo- und Ektoplasma eingeteilt werden und daraus ergibt sich eine zelltypspezifische Ä n d e r u n g der Morphologie mit steigendem Vandiumgehalt: Die Osteoblasten verringern

Abb. 14: MC3T3-EI Osteoblasten nach sechs Tagen Kultivierung mit 200 pg/ml cp-Ti-Pulver

Abb. 16: MC3T3-EI Osteoblasten nach sechs Tagen Kultivierung mit 200 g/ml TiAl 15V25-Pulver

Abb. 15: MC3T3-EI-Osteoblasten nach sechs Tagen Kultivierung mit 200 pg/m! TiAl 1,5V3-Pulver

Die Abbildung 16 zeigt MC3T3-E1-Zellen, die mit TiAll,5V25-Pulver kultiviert wurden mit starkem Ektoplas- ma-Verlust.

Die Ä n d e r u n g e n des morphologischen Erscheinungsbildes mit zunehmendem Vanadiumgehalt sind f ü r die verschiede- nen Zelltypen in Tabelle 1 zusammengefasst.

2 0 8 B ,om a t e r i a i i e n 2 w ·2 0 0 1

Ε. Eisenbarth: Einfluss des Vanadiumgehalts von Ti-Al-V-Legierungen

ORIGINAL· ARBEITEN

Zelltyp

Zellmorphologie LIB2 NIH-3T3 MC3T3-E1

Beginn der morphologischen Änderungen bei [%] Vandium in der Legierung 6 3 3

abgekugelte Form, Verringern der Ausläuferlänge ^{+ + +++ + + +}

Abbau des Zytoplasma-Anteils ^{+ +++ + + +}

Verringern der Besiedlungsdichte ^{+ + + + +}

Uneinheitliche Erscheinungsform der Zellen einer Kolonie ^{+ + + + + + +}

Vakuolenbildung ^{+ + + + + + +}

Verringern der Ausbreitungfläche ^{+ + + + + +}

Gesamte Empfindlichkeit des Zelltyps ^{+ + +++ + + + +}

+ nur eine geringe Anzahl von Zellen ist betroffen und oder schwache Ausprägung ++ erhöhte Anzahl von Zellen ist betroffen und i oder stärkere Ausprägung +++ mehr als 50 % der Zellen sind betroffen und oder deutliche Ausprägung ++*•+ fest alle Zellen sind betroffen und / oder sehr deutliche Ausprägung

Tab. I: Änderungen der Morphologie der verschiedenen Zelltypen aufgrund des steigenden Vanadiumgehalts in den Metallpulvern, mit denen die Zellen kultiviert wurden

Diskussion

In den meisten P u b l i k a t i o n e n , die sich mit der U n t e r s u c h u n g der Zelladhäsion b e s c h ä f t i g e n , werden Z y t o t o x i z i t ä t und A d h ä s i o n der Zellen im Kontakt mit Biomaterialien u n a b - h ä n g i g v o n e i n a n d e r betrachtet.

Das Aufrechterhalten der an der Zelladhäsion beteiligten Strukturen und die g e s a m t e Zelladhäsion ist ein d y n a m i - s c h e r Prozess im Fließgleichgewicht. Die beteiligten Struktu- ren werden ständig a u f - und a b g e b a u t , wie z.B. die Cytoske- lettelemente und die A n o r d n u n g der F o k a l k o n t a k t e . Dieser d y n a m i s c h e Prozess des U m b a u s der beteiligten U n t e r e i n h e i - ten, der zur physiologischen A n h e f t u n g der Zelle führt ist e n e r g i e a b h ä n g i g . Das A d h ä s i o n s v e r m ö g e n der Zelle und die Belastbarkeit der H a f t v e r b i n d u n g der Zelle zum Substrat ist (unter anderem) v o m Zustand der S t o f f w e c h s e l p r o z e s s e in der Zelle a b h ä n g i g .

Das Herabsetzen der Zellvitalität - verursacht durch t o x i - s c h e K o m p o n e n t e n im I m p l a n t a t w e r k s t o f f - beeinträchtigt die Möglichkeit der Zellen am Implantat zu haften. Um e i n e gute Adhäsion der Zellen des L a g e r g e w e b e s am I m p l a n t a t - w e r k s t o f f zu erzielen, ist es sehr wichtig, die Z u s a m m e n s e t - z u n g der Oberfläche zu optimieren, mit der die Zellen in K o n t a k t treten.

Die t e c h n i s c h e Legierung T i A l 6 V 4 , die als I m p l a t a t w e r k s t o f f verwendet wird, hat eine Duplex-Mikrostruktur. Das A n l a s - sen der Proben bei 5 0 0 ° C führt zu einer teilweisen T r a n s - formation der ß - P h a s e mit einem härtenden Effekt, so dass der h o h e V a n a d i u m g e h a l t nur lokal in der verbleibenden ß - P h a s e auftritt.

Das k ö n n t e der Grund dafür sein, dass unter I n - v i v o - B e d i n - g u n g e n keine negativen A u s w i r k u n g e n des V a n a d i u m s in der Legierung T i A l 6 V 4 bisher b e k a n n t wurden, o b w o h l mit den hier vorgestellten I n - v i t r o - T e s t s ein statistisch signifi- k a n t e r (α = 0 , 0 5 ) n e g a t i v e r Einfluss des V a n a d i u m s in der Z u s a m m e n s e t z u n g der ß - P h a s e a u f die Zelladhäsion und die Viabilität n a c h w e i s b a r ist. Der V a n a d i u m g e h a l t in den für die Tests verwendeten Proben w a r g l e i c h m ä ß i g im g e s a m t e n W e r k s t o f f verteilt.

V e r s c h i e d e n e Zelltypen zeigen unterschiedliche Ä n d e r u n g e n ihres m o r p h o l o g i s c h e n Erscheinungsbilds a u f den v a n d i u m - haltigen Legierungen. A m e m p f i n d l i c h s t e n reagierten die M C 3 T 3 - E l - Z e l l e n , die s c h o n bei e i n e m V a n a d i u m g e h a l t v o n 3 % in den T i - A l - V - L e g i e r u n g e n m o r p h o l o g i s c h e V e r ä n d e -

rungen zeigten. Die N I H - 3 T 3 - und die L 1 3 2 - Z e l l e n d a g e g e n reagieren a u f das V a n a d i u m erst ab einem Gehalt 6 °/o in den Legierungen.

Die T i t a n l e g i e r u n g e n h a b e n eine T i 0²- 0 b e r f l ä c h e n s c h i c h t , die sich i n n e r h a l b w e n i g e r Millisekunden im Kontakt mit Luft ausbildet. Dieses A r g u m e n t wird häufig a n g e b r a c h t , u m zu erklären, w a r u m das z y t o t o x i s c h wirkende V a n a d i u m in der Legierung T i A l 6 V 4 die Zellen mit K o n t a k t zu diesem B i o m a t e r i a l nicht beeinträchtigt würden. Die c h e m i s c h e n Ei- g e n s c h a f t e n der O x i d s c h i c h t werden durch ihre Z u s a m m e n - setzung b e s t i m m t [15, 16]. P h o t o e l e k t r o n e n - S p e k t r o s k o p i e - U n t e r s u c h e n an T i A l l , 5 V 2 5 [17] und A u g e r E l e k t r o n e n - S p e k t r o s k o p i e an T i A l 6 V 4 [18] zeigten, dass die n a t ü r l i c h e O x i d s c h i c h t dieser Legierung V a n d i u m enthält.

Die T a t s a c h e , dass trotz dieser A r g u m e n t e keine K o m p l i k a - t i o n e n bisher beim Einsatz v o n T i A l 6 V 4 als I m p l a n t a t w e r k - s t o f f b e k a n n t wurden zeigt, dass der W e r k s t o f f b i o k o m p a - tible E i g e n s c h a f t e n hat. Trotzdem sollten b e v o r z u g t Legie- r u n g e n eingesetzt werden, die speziell für m e d i z i s c h e Z w e c k e e n t w i c k e l t wurden wie T i A l 5 F e 2 , 5 [19] und T i A l 6 N b 7 [20], da sie bei vergleichbaren m e c h a n i s c h e n Ei- g e n s c h a f t e n wie T i A l 6 V 4 kein V a n a d i u m e n t h a l t e n , dessen z y t o x i s c h e s V e r h a l t e n in diesem Artikel klar belegt wurde.

Abstract

F o r load b e a r i n g b i o m e d i c a l devices it is very i m p o r t a n t to a c h i e v e a g o o d c o n n e c t i o n b e t w e e n the s u r r o u n d i n g tissue and the implant. This c a n be a c h i e v e d o n l y b y m e e t i n g the requirements for g o o d cellular adhesion with t h e s u r f a c e properties. T h e v a n a d i u m c o n t e n t in the alloy T i 6 A l 4 V which is prevalently used for highly loaded implants is k n o w n to be c y t o t o x i c . Nevertheless, this alloy is considered to b e b i o c o m p a t i b l e .

T h e aim o f this study was to investigate w h e t h e r v a n a d i u m has a n y i n f l u e n c e on the adhesion, and the viability o f cells g r o w i n g on substrates c o n t a i n i n g this e l e m e n t .

In order to study w h e t h e r there is such an i n f l u e n c e on the cellular a d h e r e n c e , a flow c h a m b e r was c o n s t r u c t e d which m a d e it possible to e x a m i n e cellular a d h e r e n c e o n metallic substrates u n d e r the c o n d i t i o n s o f l a m i n a r flow. T h e b i o - c o m p a t i b i l i t y o f substrates c o n t a i n i n g v a n a d i u m w a s e x a m i - ned by testing the cell adhesion, the L C 5 0 (tested with L I 3 2 epithelial cells), the proliferation (tested with M C 3 T 3 - E 1 -

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"ARBEITEN

osteoblasts), a n d t h e cell m o r p h o l o g y ( c o m p a r e d w i t h NIH- 3 T 3 - f i b r o b l a s t s , MC3T3-E1 -cells a n d L132-cells). T h e c o m - p o s i t i o n of t h e s u b s t r a t e s w i t h w h i c h t h e cells were i n c u b a - ted w a s : Til.5A11.5V, T i l . 5 A l 3 V , T i l . 5 A l 6 V , Til.5A112V, T i l . 5 A 1 1 8 V a n d T i l . 5 A l 2 5 V . The results s h o w e d clearly t h a t w i t h i n c r e a s i n g v a n a d i u m c o n t e n t t h e c e l l u l a r a d h e s i o n a n d t h e b i o c o m p a t i b i l i t y of t h e s u b s t r a t e s d e c r e a s e s . The critical v a n a d i u m c o n t e n t w h i c h l e a d s to a d e c r e a s e of cell v ia b ility d e p e n d s o n t h e cell t y p e . E.g. f o r t h e MC3T3-E1 o s t e o b l a s t - like cells it a m o u n t s t o o n l y 3 wt °/o.

E. Eisenbarth

K o r r e s p o n d e n z a n s c h r i f t : Dr. Eva E i s e n b a r t h U n i v e r s i t ä t des S a a r l a n d e s L e h r s t u h l f ü r m e t a l l i s c h e W e r k s t o f f e

Im S t a d t w a l d 6 6 0 4 1 S a a r b r ü c k e n T e l e f o n : 0 6 8 1 - 3 0 2 32 78 F a x : 0 6 8 1 - 3 0 2 4 3 8 5 E - M a i l : e . e i s e n b a r t h @ m x . u n i - s a a r l a n d . d e

Akademischer Lebenslauf 1 9 8 9 - 1 9 9 4 :

1997 seit 1994

S t u d i u m d e r Biologie a n d e r U n i v e r s i t ä t des S a a r l a n d e s

P r o m o t i o n bei P r o f . Dr. J ü r g e n B r e m e u n d P r o f . Dr. W . N a c h t i g a l l

Wiss. M i t a r b e i t e r i n a n d e r U n i v e r s i t ä t des S a a r l a n d e s , A r b e i t s g r u p p e B i o m a t e r i a l i e n , P r o f . Dr. J. B r e m e

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Dissertation a m Lehrstuhl f ü r m e t a l l i s c h e W e r k s t o f f e der U n i v e r s i t ä t des S a a r l a n d e s , S a a r b r ü c k e n , J. Breme, 1997 [10] D a f n i s E., S a b a t i n t i S.: B i o c h e m i s t r y a n d p a t h o p h y s i o - logy of V a n a d i u m . N e p h r o n , 69 ( l ) : 3 4 - 4 0 (1994)

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