Abbildung3.14: Das Prinzip des konfokalen Laserscanningmikroskops: Zwischen die
kon-fokale Optik und das Mikroskop sind apertur- und brennweitenangepasst ein Kollimator,
Galvanometerscanner mit Spiegeln undeine F-Theta-Linse eingefugt.Diesewandelt einen
Verkipp des Strahls in einen lateralen Versatz in der Zwischenbildebene des Mikroskops
um, dessen Optik in einen Versatz in der Probe. Aus Grunden der Anschaulichkeit ist
der Detektionsstrahlengang weggelassen, und die Scannerachsen sind beide senkrecht zur
Bildebene dargestellt.
Der in Abschnitt 3.1.1 skizzierte Aufbau zur konfokalen Fluoreszenzanregung und
-detektion ist zur Aufnahme von Bildern um eine Scanvorrichtung zu erweitern, wie in
Abb. 3.14 gezeigt und in [144 ] vorgeschlagen: Der anregende Laserstrahl undder
Detek-tionsstrahlengang werden mit Hilfe eines dichroitischenSpiegels zusammengefuhrt { dies
gewahrleistet bereits Konfokalitat { unddahinter kollimiert.Der jetzt parallele
Strahlen-gang wird
uber zwei Spiegel geleitet, die um zwei senkrecht zueinander stehende Achsen
durch Galvanometerscanner gedreht und zum zweidimensionalen Positionieren und
Ra-stern verwendet werden konnen. Die Achsen benden sich idealerweise in telezentrischer
Anordnung zu einem F-Theta-Objektiv, das den verkippten Strahl in einen in der
Zwi-schenbildebenedesMikroskopssenkrechtzuroptischenAchseverschobenenFokusabbildet.
AbbildungsmastabundVergoerungdesSystemsausKollimator-undF-Theta-Linsesind
imIdealfalleins.DasMikroskop
ubertragtdannentsprechendderAbbildungseigenschaften
dielaterale Verschiebunginder Zwischenbildebenein dieObjektebene.
Telezentrischer Strahlengang
Die telezentrische Beleuchtung eineridealen Linsemitparallelen Lichtstrahlen unterdem
WinkelzuroptischenAchsezeigt Abb.3.15a.WennderzentraleStrahldeskollimierten
Lichts stets durch den Brennpunkt lauft (Brennpunkt als
"
Drehpunkt\), steht die
Sym-metrieachse des konvergenten Strahlenbundels immer senkrecht auf der Fokalebene, der
zugehorige
Onungswinkelistkonstant undderFokuspunktsymmetrisch beleuchtet.
Θ
y
F 1 F 2
Θ
y
F 1 F 2
(a) (b)
Abbildung3.15:TelezentrischeBeleuchtung(a)eineridealenLinseund(b)eines
F-Theta-Objektivs. Die einfallenden Strahlen verlaufen durch den gegenstandsseitigen Brennpunkt
F
1
und werden in derbildseitigen Fokalache F
2
fokussiert.
F-Theta-Objektiv
EineLinse derBrennweite f wandeltdie Schwenkung einesparallelen Strahlbundelsin
eine Versetzung y des zugehorigen konvergenten um:
y=ftan: (3.128)
Spharische Fehler typischer Linsen fuhren fur groere Auslenkungen oft noch zu einer
gekrummtenFokalache.
Elektromechanisch lassen sich besonders einfach Drehbewegungen erzeugen. Um die
Drehbewegungeneines Lichtstrahlsineine lineareBewegung umzuwandeln,benotigt man
mindestenseineLinse.DamitmaneinenzumSchwenkwinkelproportionalenVersatzerhalt,
sindsogenannte F-Theta-Objektiveentwickeltworden(Abb.3.15b),dieeinesolchelineare
Beziehung
y=f (3.129)
(daher derName)undeinesehr ebeneFokalache kennzeichnet. Bendetdiesesichinder
ZwischenbildebeneeinesMikroskops,wirdderStrahlversatzineinendem
Abbildungsma-stabentsprechenden Versatzinder Fokalebene desObjektivstransformiert.
Galvanometerscanner
Diebesondershaugundauchhierverwendeten Galvanometerscanner [94 ]sindfurkleine
Spiegel,kleineWinkelundhoheGeschwindigkeitenmiteinerDrehspuleaufgebaut,odersie
besitzeneinendrehbarenEisenkernalsRotorfurgroeSpiegel,groeWinkelundmittlere
Geschwindigkeiten. Die Scanner sindi.a.tordiert undpermanentmagnetisch vorgespannt
undgedampft.DeutlichunterhalbderResonanzverhaltsichderScanneranalog-linear,d.h.
die Spiegelposition folgt beliebigem Eingangssignal bezuglich Frequenz, Amplitude und
Kurvenform. Eine Positions-Ruckmeldung erfolgt i.a. kapazitiv mit geeignet zum Rotor
angeordneten Elektroden.
Im Idealfallbenden sich die Achsen beider Scannertelezentrisch im Brennpunkt des
Objektivs.Nebenderspeziellen Konstruktionvon mechanischgekoppeltenScannernoder
derVerwendungvon Zwischenoptikenkann mansich aber auch behelfen,indemman eine
Achseetwas vorunddieandere etwashinterdem Brennpunktpositioniert.Der Fehlerist
beigeeigneterKonstruktion vernachlassigbar[144].
Das konfokale
Fluoreszenzuktuationsmikroskop
In denersten FCS-Experimenten wurdeder erforderliche konfokale Strahlengang mit
op-tischen Elementen wie Parabolspiegeln und einfachen Linsen aufgebaut [81 , 82 ], jedoch
sind in einer solchen Geometrie aufgrund des groen Fokusvolumens bei hohem
Unter-grunddieTeilchenzahluktuationensehrklein.InfolgedessenhatsichdieVerwendungvon
kommerziell erhaltlichen Labormikroskopen durchgesetzt, die auch fur konfokale
Laser-scanningmikroskopie verwendet werden undsich durch ein wesentlich kleineres
Beobach-tungsvolumenundbessereStreulichtunterdruckungauszeichnen.
Insbesondere fur in vivo-Messungen sindinverse Mikroskope mit auf unendlich
korri-giertenObjektivenbesondersgeeignet,dadieProbevonuntenbeobachtetwird.
Bauartbe-dingt minimiertdieinverse Geometrieauerdem die RelativbewegungdesObjektivs zum
Objektdurchauere Erschutterungen imLaborbetrieb.
InzahlreichenMikroskop-basiertenFCS-ExperimentenwirddieFluoreszenzlampedurch
eine Lasereinkopplung mit Anpassungsoptik ersetzt und teilweise die Filter und
Strahl-teiler, die fur Epiuoreszenzmikroskopie benotigt werden, auch jetzt zur Trennung des
Anregungs-vom Fluoreszenzlicht verwendet. Raumlich weit getrennt davon benden sich
dieDetektoren,dieauerhalbeinesKameraausgangs positioniertsind[137,15 ,166 ]. Auch
daserstekommerziellerhaltliche FCS-Gerat Confocor1 derFirmenZeiss, Jena,und
Evo-tec,Hamburg, beruhte aufdiesem Konzept.
AufgrundderraumlichenTrennung der Zwischenbildebenenvon Beleuchtung und
De-tektion gestalten sich die konfokale Justage und deren Stabilitat schwierig, daher hat es
sichalserfolgreichherausgestellt,Beleuchtungs-undDetektionsstrahlengang
ubereinen
ge-meinsamenEinganginsbzw.ausdemMikroskopzufuhren[17 ],wieesauchbeim
kommer-ziellenNachfolgemodellConfocor2 realisiertwurde.Auerdem kann dasGerat gleichzeitig
im Epiuoreszenzbetrieb z.B. zur Orientierung in Zellen genutzt werden. Der
bestehen-de Aufbau, der im Rahmen dieser Arbeit erweitert wurde, basiert ebenfalls auf diesem
Konzept.
DieIntegrationeinerLaserscanningeinheitindenauchfurFCSgenutztenStrahlengang
istdanndernachsteSchritt,umFCSmitkonfokalerFluoreszenzmikroskopiezuverbinden
undinsbesondereeinehohe raumliche Auosung furintrazellulareMessungen zu erm
ogli-chen[11,10 , 46].
ZahlreicheMessungendieserArbeitsindmitdembestehendenFCS-Modulin
Kombina-tion miteinemSchrittmotor-getriebenenProbentischundeiner Epiuoreszenzeinrichtung
durchgefuhrt worden. Dabei haben sich die zuverlassige Positionierung des Lasers in der
ZelleunddieZuordnungdesDiusionsverhaltenszuintrazellularenStrukturenals
auerst
schwierigundaufwandigherausgestellt.ImRahmen dieserArbeit istderbestehende
Auf-bau mit einer integrierten, Galvanometer-getriebenen Scanningeinheit erweitert worden,
um FCS und CLSM zu vereinen undintrazellulare Diusionsmessungen deutlich zu
ver-bessernundzu vereinfachen.
4.1 Anforderungsprol
Der bestehende Aufbau zur FCS-Messung wurde von Michael Tewes im Rahmen seiner
Dissertationkonzipiert,entworfenundgebaut[152].ErrealisiertdasinAbb.3.1skizzierte
konfokale Prinzipund die dort angedeutete Modularitat: Ein kompaktes Modul, dasalle
erforderlichen Komponenten enthalt, wird seitlich am Kameraausgang eines Mikroskops
montiert. EserfulltfolgendeAnforderungen:
gleichzeitigeMessungderAuto- bzw.Kreuzkorrelationsfunktionen zweiermit
unter-schiedlichenFluorophoren markiertenSpezies,
Nachweisgrenzefureinfach markierteMolekulevon wenigerals 1pM,
Messungenvon inPuergelosten Probenebensowie inlebendenZellen,
Kombination mitEpiuoreszenzmikroskopie,
beugungsbegrenzterFokus,
mechanische Langzeitstabilitat, so dass eine Nachjustage weder durch T
emperatur-schwankungen noch durch im Laborbetrieb unvermeidliche Erschutterungen
erfor-derlichwerden,
Modularitat, die einfaches Wechseln von Laserlinien, Filtern und Detektoren oder
desgesamten Modulserlaubt.
Ziel der Erweiterung des Moduls um eine Scanningeinheit ist eine Verbesserung von
An-wendungen in vivo, insbesonderewirdfolgendes angestrebt:
exakte,schnelle undreproduzierbare raumlichePositionierbarkeitinZellen,
Automatisierungvon FCS-Messungen inZellen,
Moglichkeit zurAufnahme von konfokalen Fluoreszenzbildernin mitkommerziellen
Geraten vergleichbarer Qualitat,
Erweiterbarkeit auf weitere Methoden in vivo und in vitro (PCH, scanning FCS,
FRAP/FLIP, FRET bzw. uorescence resonant energy transfer an einzelnen
Mo-lekulen,siehe Abschnitt3.5),
Bewahrung der Modularitat, insbesondere einfacher Umbau zwischen
konventionel-4.2 Konzeption des optischen Strahlengangs
Diegesamte konfokaleOptikist bereitsindasFCS-Modulintegriert, sodass zwischendas
Modul unddas Mikroskop eine Scanningeinheit eingepasstwerden konnte(Abb. 4.2), die
diefurein CLSMerforderlichenundinAbb.3.14 skizziertenKomponentenaufnimmt.
Abb.4.1zeigtschematischdenStrahlengangvonMikroskop,Scanningeinheitund
FCS-Modul.DashierverwendeteinverseMikroskopIX70derFirmaOlympus,Hamburg,besitzt
einenseitlichenoptischenAusgangAzumAnschlussvonCCD-Kameras oder
Diskussions-einrichtungen,derauchhierverwendetwird.DerStrahlteilerwurfelSWleitet80%desvom
ObjektivOBuberdieTubuslinseTLkommenden LichtszumseitlichenAusgangund20%
uberdenSpiegel SOzum OkularOK.
Die ZwischenbildebeneZ1liegt im Tubusvordem Ausgang Aundfalltmitder F
okal-ebenederScanlinseSLzusammen.BildseitigliegtdietelezentrischeEbeneTEderScanlinse
zwischenden Spiegeln der Galvanometerscanner SCX undSCY. Der leichteVerkipp von
SCY minimiert dabei die Entfernung der beiden Scannerspiegel voneinander und damit
ihren jeweiligen Abstand von der telezentrischen Ebene. Bei Drehung der Scannerspiegel
wandertderFokusinderZwischenbildebeneZ1sowieinderObjektebenedesMikroskops.
DieKollimations-oderDescanlinseDLfokussiertdasLicht aufdie ZwischenbildebeneZ2,
der Aperturwinkel ist dabei der gleiche wie der des bei A aus dem Mikroskop tretenden
Lichts. DieseAperturanpassungerlaubt,dieScanningeinheit,bestehend ausTubus,
Scan-linse,ScannernundDescanlinse,zwischenAundBausdemStrahlengangauszubauenund
dasFCS-Modul direkt an denAusgang A anzuschlieenoderbeiB eine anderekonfokale
Optikandie Scanningeinheitzu montieren.
ImFCS-ModulmussendurchdendichroitischenStrahlteilerST1zweikonjugierte
Zwi-schenbildebenenZ2erzeugtwerden,dasichLichtquelleundDetektornichtraumlich
uber-lagernkonnen.ST1reektiertdasAnregungslicht undlasst daslangerwellige
Fluoreszenz-licht passieren. Das Licht des Lasers, das
uber die Faser F eingekoppelt wird, wird mit
HilfedesKollimatorsKundderLinseL1mitangepassterAperturindie
Zwischenbildebe-neZ2fokussiertunddurchdenAnregungslterF1geleitet.Die StrahltailleinZ2dient als
Lichtquelle. DasFluoreszenzlichtwird durch diedieKonfokalitat herstellendeLochblende
(Pinhole) P in derEbene Z2 hindurchgeleitetund mit dem Strahlteiler ST2 spektral auf
die beiden Detektoren D1 und D2 aufgeteilt. Der kurzwellige Anteil wird reektiert und
durchdenEmissionslterF2unddieDetektionslinseL2auf D1abgebildet.Derlangwellige
Anteilwirduber denSpiegelS unddenFilterF3von derLinseL3 auf D2abgebildet.
Die lichtempndlicheFlache derDetektorenhattypischerweiseeinenDurchmesservon
200m, so dass die Linsen L2 und L3 lateral justierbar sind, um die richtige Abbildung
derLochblende einstellenzu konnen. Damit deniert dieraumlich feste Blendeeinen
Be-zugspunkt fur die Justage. Die Linse L1 wird axial und lateral so verschoben, dass
La-serstrahltailleundLochblendekonjugiert konfokal angeordnet sind.Auchdie Descanlinse
DL ist lateral justierbar, damit der dahinter parallele Strahl auch parallel zur und auf
deroptischenAchse verlauft. Das gesamte FCS-Modulist mitdem KreuztischKTlateral
bezuglichderScanningeinheitverstellbar,umdiebeidenoptischenAchsenzurDeckung zu
bringen.
Abbildung4.1: (a) Schematischer Strahlengang von
Mikro-skop, Scanningeinheit und FCS-Modul (Modul nach [152 ])
in Seitenansicht und (b) in Frontalansicht; (c) linearisierte
mastabliche Darstellung, die Strahldurchmesser in
Klam-mern sind zweifach
uberhoht im Vergleich zur axialen
Posi-tion(Maein mm,soweitnichtanders angegeben). Weitere
Erlauterungen im Text.