Abbildung 5.3: Die Genauigkeit und
Stabi-litatderPositionierungdesFokusinder
Pro-be, gemessen mit den scannereigenen
kapazi-tiven Sensoren. Die Stabilitat des Fokus bei
einer Position (statisch)und die angefahrene
Position nach einem Sprung um 10m
(ge-sprungen)
uber zahlreiche
aufeinanderfolgen-de Messungen zeigen Oset und Gau'sche
Verbreiterung.
gemessen. Auch jetzt ist die gemessene Position Gau-verteilt mit einer
Standardabwei-chungvon22nmundeinemOsetvon{2,6nm(Abb.5.3). DerOsetvariiertvon
Messsit-zungzu Messsitzung um bis zu 5nmundentsteht durch denKalibrierungsalgorithmus
beimProgrammstart.
Eine Standardabweichung von 22nm gehort zu einer optischen Winkelungenauigkeit
von 24rad. Dies entspricht den Herstellerangaben von 12rad (mechanisch, Tab. 4.1),
diePositionierungenauigkeitgeht also inersterLinie aufdie Scannerzuruck.
5.2.4 Auosung und Transmissionsprol
Um denEinuss desScanners auf das transmittierte Licht unddas Fokusvolumen zu
be-stimmen,wurdedasFCS-ModulohneScanningeinheitandasMikroskopangeschlossenund
dieJustageuberpr uft.AneineAutokorrelationsmessungeinerAlexa488-Losung(9nM)bei
einer Zahlrate von 76,64,2kHz konnte die Modellfunktion, Gl. (4.3), miteiner Spezies
der Diusionszeit 42,60,9s und einem Strukturfaktor von 4,2 angepasst werden.
An-schlieend wurde die Scanningeinheit eingefugt, die gesamte Justage durchgefuhrt und
beigleicherLaserleistung inder gleichenProbe erneuteine Autokorrelationsfunktion
auf-genommen. Die Zahlrate betrug jetzt 49,32,9kHz und die Diusionszeit bei gleichem
Strukturfaktor 35,60,9s. Durch die Scanningeinheit verringert sich also das
Fluores-zenzsignalumetwaein Drittel,unddasAuosungsvermogenwird nicht verschlechtert.
Abb. 5.4 zeigt die Autokorrelation einer Alexa488-Losung (20nM), gemessen mit der
Scanningeinheit auf der optischen Achse mit den Objektkoordinaten (0; 0). Es kann die
Modellfunktion miteiner Speziesund einem Triplettzustand angepasst werden kann. Die
systematischeAbweichung imBereichum0,1{1msist bereits inFCS-Messungenohnedie
Scanningeinheit beobachtet worden [152 ] und kann mit einer zweiten Komponente mit
einem Anteil von ca. 2% und einer Diusionszeit um 0,3ms beschrieben werden. Sie ist
wahrscheinlich auf Abweichungen des Fokusvolumens von der dreidimensionalen
Gau-funktionzuruckzufuhren[125 ](Abb.3.2).GemitteltausmehrerenMessungenergebensich
eine Diusionszeit
di
=35,60,6s und ein Strukturfaktor =4,170,14. Aus
verglei-chendenFCS-Messungen von FluoresceinundAlexa488 sowie demDiusionskoeÆzienten
von Fluorescein inWasser D
0
=(2,600,26)10 10
m 2
/s[149]ergibtsich ein
Diusionsko-eÆzient von Alexa488 in Wasser D
0
=(2,090,21)10 10
m 2
/s. Mit Gl.(3.14) und (3.33)
konnen dann der laterale und der axiale Radius sowie das Volumen des Fokus berechnet
0.0 0.1 0.2
G( τ )
0.001 0.01 0.1 1 10
-0.004 0.000 0.004
R esi due n
τ [ms]
Abbildung 5.4: Autokorrelation
einer Alexa488-Probe, gemessen
auf der optischen Achse (dick)
und die angepasste
Modellfunkti-on (dunn) sowie die zugehorigen
Residuen (unten). Aus der
An-passung ergebensichfolgende
Pa-rameter:
trip
=0; 13 0; 02,
trip
=5 2s,
N =4; 8 0; 1,
di
=352s,
=4; 3.
und mit den theoretisch erwarteten Werten aus Gl. (3.12) und (3.14) verglichen werden
(Tab.5.2).Danachist derFokusexperimentellbestimmtetwasgroeralsmitdemAnsatz
der korrigierten
Uberbeleuchtung vorhergesagt. Die theoretischen Werte liegen allerdings
innerhalb der jeweiligen Standardabweichung, und das gemessene Achsenverhaltnis bzw.
derStrukturfaktor stimmt mitderVorhersage uberein.
Groe in experimentell theoretisch
w
0
=2 p
D
0
di
nm 17210 164
z
0
=w
0
nm 71747 685
V
focus
= 4
3 w
2
0 z
0
al 8912 77
Tabelle 5.2: Experimentell bestimmte und theoretisch erwartete geometrische Parameter
des Fokusvolumens.
DieScanningeinheiterlaubtdiePositionierungdesFokusimObjektauchauerhalbder
optischenAchse. DadieScanlinsenichtintelezentrischerGeometriezuverwendenist und
auch moderne Mikroskope nicht frei von optischenFehlern derKomponenten und
Abwei-chungenvomidealenStrahlengangsind,kann dieAuslenkungdesFokus ausderoptischen
Achse dieGroe des Fokus beeinussenundzu weiteren Verlusten desdetektierten
Fluo-reszenzsignalsfuhren.Die Abhangigkeit deslateralenFokusradiusvon der Positioninder
Probe 10muberdem Deckglas zeigt Abb. 5.5a:An dendargestellten Positionenwurde
dieKorrelationderAlexa488-ProbegemessenundmiteinerKomponenteundeinem
Struk-turfaktorvon4,2angepasst.Darauskonntew
0
berechnetwerden.DieStandardabweichung
jeder Messung betragt 10nm, so dass
ubereinen groen Bereich die Schwankungendiese
Grenze nicht
uberschreiten. Allerdings zeigt das Prol einen signikant asymmetrischen
Verlaufinx-Richtung, was auf diebezuglicheinerAuslenkung inx unsymmetrischeLage
desStrahlteilersim Mikroskop zuruckgefuhrtwerdenkann (Abb. 4.1).
Abb.5.5bstelltdas zugehorigeFluoreszenzsignaldar: Esistein deutlicher
radialsym-metrischerAbfallzuerkennen,jedochfalltdasSignalinnerhalbeinesRadiusvonca.35m
nicht unter80%des Maximums von etwa 95.
PositioniertmandenLaseranverschiedenenPunktenaufderoptischenAchseund
wie--40 -20 0 20 40 -40
-20 0 20
40 160
170 180
190 200
y [ µ m]
w 0 [nm]
x [ µ m]
(a)
-40 -20
0 20
40
-40 -20
0 20
40
0 20 40 60 80 100
Intensit ät [w. E.]
y [ µ m]
x [ µ m]
(b)
Abbildung5.5:LateralesProl(a)derFokusgroeund(b)desFluoreszenzsignals,bestimmt
mit ortsaufgelosten Autokorrelationsmessungen in einer Alexa488-Probe 10m
uber dem
-1 0 1 2 3 4 0 40 80 120
(b)
F lu o reszen zin ten sit ät [ w . E. ]
z [ µ m]
-1 0 1 2 3 4
40 80 120 (a)
τ dif f [ µ s]
z [ µ m]
Abbildung 5.6: Axiales Prol von (a) Diusionszeit und (b) Fluoreszenzsignal, bestimmt
mit ortsaufgelosten Autokorrelationsmessungen in einerAlexa488-Probeauf der optischen
Achse. DieNull entsprichtderPosition desDeckglases,die allerdingsnurauf etwa0,5m
genau bestimmt werden konnte.
Die Diusionszeit steigt an, und das Fluoreszenzsignal fallt ab. Insbesondere der nur
geringe Einuss auf die Diusionszeit erlaubt FCS-Messungen in adherent wachsenden
Zellennaheder Glasoberache.
Damit erweistsich FCS als geeignete Methode, dasFokusvolumen zu vermessen bzw.
denVerlaufderDetektionswahrscheinlichkeitzubestimmen.Diesistinsbesonderenutzlich
furdieAnwendungvon Dekonvolutionsverfahren aufkonfokaleBilder.
Intrazellulare Diusionsmessungen
Die Experimentezur Beweglichkeit konzentrierensich auf denEinuss,den intrazellulare
Strukturen auf die Mobilitat von inerten Molekulen verschiedener Groe besitzen. Die
ausfuhrlicheren Untersuchungen an EGFP- und EGFP--Galactosidase-exprimierenden
undanmitAlexa568inkubiertenZellenwurdenvorderFertigstellungderScanningeinheit
mit dem Schrittmotor-getriebenen Probentisch durchgefuhrt. Die Mobilitat der
Dextra-ne und desDsRed konnten bereits mitkombinierter konfokaler Mikroskopie und
ortsauf-gelosterFCSuntersucht werdenunderfordernnochweitereExperimente.Daranschlossen
sich erste Experimente miteinem funktionellen Protein an: Am Beispieldes
Transkripti-onsterminationsfaktorsTTF-Iwurde BindungundBeweglichkeit in vivo untersucht.
6.1 Beweglichkeit inerter Molekule im Zellkern
UmdenEinussderdreidimensionalenStrukturinderZelleundinsbesonderedes
Chroma-tinsimZellkernaufdieBeweglichkeitvonMolekulenverschiedenerGroenuntersuchenzu
konnen, benotigt man inerte Molekule,die keinerlei Bindungen eingehen. Daruberhinaus
solltensiekeine toxische Wirkung zeigenundsoindie Zelleneingebracht werden konnen,
dassderenLebensfahigkeit moglichstwenigbeeinusstwird.IndiesenExperimenten
wur-denentwederZelllinienverwendet,dieautouoreszente Proteineexprimieren,oderes
wur-den synthetische Molekule durch moglichst schonende Inkubation oder Mikroinjektionin
dieZellengebracht.
6.1.1 EGFP und EGFP--Galactosidase in COS-7- und AT-1-Zellen
Material und Methoden
AT-1 isteine etablierte Zelllinie,die einemProstatakarzinom vonRatten entstammt, und
COS-7-Zellen sindauf SV40-transformierte Aennierenzellen zuruckzufuhren. Zellen
bei-der Linien wurden von G. Muller undW. Waldeck (Abt. Biophysik der Makromolekule,
DeutschesKrebsforschungszentrum,Heidelberg)mitVektorenentwederfurEGFP(27kDa,
Clontech, Heidelberg) oder fur das EGFP--Galactosidase-Fusionsprotein (EGFP--gal,
81kDa, Abb. 6.1) durch Fusion der Zellmembran mit Liposomen (Lipofectamin)
trans-ziert. Die Inkubation derZellen erfolgteunter 5%iger CO
2
-Atmosphare bei37 Æ
C in
phe-nolrotfreiemRPMI-Medium(LifeTechnologies,Karlsruhe)mit10%fotalemKalberserum.
VorFCS-Messungen wurdendie Zellen inmitKunststokammern beklebtenDeckglasern