0.0 0.4 0.8
(e)
c n c
m
ρ 2
-10 -5 0 5
0.0 0.5 1.0 1.5
(f) N focus , rel
laterale Position [ µ m]
-6 -4 -2 0
2.0 2.6 3.2
n
(c)
d w
laterale Position [ µ m]
n c
m
0.5 1.0 (d) 1.5
N focus , rel
2 4 6 (g)
d w
c n c
m
-10 -5 0 5
0.0 0.5 1.0 1.5
(h)
N focus , rel
laterale Position [ µ m]
Abbildung 6.8: FCS-Scan durch eine EGFP--gal-exprimierende AT-1-Zelle: (a) Anteil
der langsamen Komponente und (b) relative Teilchenzahl im Zwei-Komponenten-Modell,
(c) Anomalieparameter und (d) relativeTeilchenzahl im Modell der behinderten Diusion
als Funktion derPosition in der Zelle.(e{h) Ergebnisse der Wiederholung desFCS-Scans
entlang der gleichen Linie, jetzt durch die gesamte Zelle ({Æ{), verglichen mit dem Scan
aus (a{d) ({).
Daruberhinaus wurden Zellen verworfen, in denen es wahrend der FCS-Messungen
zu wahrnehmbarenSchwankungendes Fluoreszenzsignalsim Sekundenbereichkam. Diese
konnen internen und globalen zellularen Bewegungen zugeordnet werden und fuhren zu
unzuverlassigen Ortsinformationen.
Beide Interpretationsmoglichkeiten der Daten erlauben eine Aussage
uber den
Diu-sionskoeÆzienten, den das Molekul in freier Losung mit der gleichen Viskositat wie im
0.0 0.3 0.6 (a)
n c
ρ 2
-2 0 2 4
0.4 0.8 1.2 1.6 (b)
N focus , rel
laterale Position [ µ m]
2.0 2.5 3.0 (c)
d w
n c
-2 0 2 4
0.4 0.8 1.2 (d) 1.6
N focus , rel
laterale Position [ µ m]
Abbildung6.9: FCS-Scan durch eine EGFP--gal-exprimierende COS-7-Zelle: (a) Anteil
der langsamen Komponente und (b) relative Teilchenzahl im Zwei-Komponenten-Modell,
(c) Anomalieparameter und (d) relative Teilchenzahlim Modell der behinderten Diusion
als Funktion derPosition in der Zelle.
Zytosol hatte. Aus dem Vergleich der Diusionszeiten bzw. -koeÆzienten von EGFP in
wassriger Losung mit den intrazellularen Werten kann daher eine zytosolische Viskositat
angegeben werden,die etwa 5fach hoher als inWasser ist (Tab.6.1). ZurBerechnung der
Werte sinddieintrazellularenDiusionszeitenuber zahlreichePositioneninmehreren
Zel-len gemittelt worden. Das Verhaltnis der Diusionszeiten bzw. -koeÆzienten von EGFP
unddemFusionsproteinbetragtca.1,4,entsprechenddemMassenverhaltnisvon3,dasbei
globularenProteinen zueinem Verhaltnis derDiusionskoeÆzientenvon 3 p
31,4 fuhrt.
zweiKomponenten behinderteDiusion Zellen
D
mono;aq
=D
mono;cell
5,30,6 5,50,6 9
AT-1
D
mono;cell
=D
fusion;cell
1,40,2 1,50,4 6
D
momo;aq
=D
mono;cell
4,70,5 4,50,7 8
COS-7
D
momo;cell
=D
fusion;cell
1,20,1 1,30,3 4
Tabelle 6.1: Verhaltnis der DiusionskoeÆzienten von EGFP (mono) in vivo (cell) und
in wassriger Losung (aq) sowie das Verhaltnis der DiusionskoeÆzienten von EGFPund
EGFP--gal (fusion). Die Referenz ist der DiusionskoeÆzient von EGFP in wassriger
Losung D =8; 7 10 11
m 2
s 1
.
FCS-Linescans von EGFP-exprimierenden AT-1- und COS-7-Zellen wurden mit der
Scanningeinheit wiederholt. Dazu wurden konfokale Fluoreszenzbilder der Zellen
aufge-nommen unddieLinien furdie Linescans im Bildausgewahlt. Nach denFCS-Messungen
wurdeerneuteinBilderstellt,umdenVerlustanFluoreszenzintensitatsichtbarzumachen
undeventuelle Bewegungen der Zelle zu erkennen. Sowohl die ermittelten intrazellularen
Viskositaten als auch die typischen Werte des Anomalieparameters konnten quantitativ
bestatigt werden.Die OrientierungindenZellenerwies sich alssehr viel einfacher.
Diskussion
DieErgebnissezeigenzusammenmiteinerzunehmendenAnzahlweitererArbeiten[11 ,17 ,
118 , 138 ], dass FCS eine geeignete Methode zur Untersuchung der Beweglichkeit inerter
MolekuleinlebendenZellenist.
Umsicherzustellen,dass dieintrazellulareFluoreszenzvonEGFPemittiertwordenist,
sinddie Fluoreszenzspektren,deren pH-Abhangigkeit undintramolekulare Fluktuationen
untersuchtundquantitativbeschriebenworden.DieErgebnissesindinguter
Ubereinstim-mungmitveroentlichtenUntersuchungen[151 ,24 ,149 ,16 ,150,54 ,98 ,154]underlauben
daruberhinauseine Aussage
uberdieKinetik molekularerKonformationen.
UntersuchungenzurintrazellularenViskositat[61 ,79 ,77 ,78 ,149 ,150 ,141,104 ]zeigen,
dass diese 2,6- bis 10fach groer als in Wasser ist. Dies ist mit den FCS-Messungen mit
beidenInterpretationsmoglichkeitenbestatigtworden,insbesonderehatsichherausgestellt,
dass im Zellkerndie Viskositat fur Proteine von durchschnittlicherGroe ca. 4-bis 6fach
groer ist [141, 118 ] und nicht signikant von den zyotosolischen Werten abweicht. Da
typischeeukaryotischeZellenca.70%(w/w)Wasserenthalten[34 ],kanneinBildentwickelt
werden,nachdemeingroerAnteildesKernvolumenseindemZytosolahnlichesNukleosol
enthalt.DarinbendensichMakromolekuleundgroereKomplexeineinerussigenPhase.
SiealletrageninverschiedenemMaezurViskositatbei,jenachGroederMolekule,deren
Beweglichkeit untersucht wird[61].
DerverbleibendeRaum ist mitChromatin,assoziierten Molekulen undEinschlussk
or-pern (Speckles, Nukleoli etc.) erfullt, die nahezu immobile Hindernisse dar- und m
ogli-cheBindungsstellenbereitstellen.DieInterpretationderFCS-Messungenim
Zwei-Kompo-nenten-Modell erfordert eine sehr inhomogene Verteilung undhohe Konzentration dieser
Hindernisse, umdieEntstehung von Fallenetc. zu ermoglichen(Abschnitt3.3.3). Im
Mo-dell derbehindertenDiusion hingegen (Abschnitt 3.3.1) ist bereits mit relativhomogen
verteilten Hindernissen geringerer Dichte eine deutliche Abweichung von freier Diusion
zu erwarten. Auerdem erfasst es den Einuss von strenger organisierten Strukturen wie
Grenzachen, KanalenundFallenzumindest qualitativ.Der Anomalieparameterd
w kann
in einen theoretischen Bezug zu Groen wie der fraktalen Dimension der behindernden
Strukturen gebracht werden [20 ], die aus strukturellenUntersuchungen oder
Polymermo-dellendesZellkernsgewonnenwerdenkonnen(Abschnitt2.1.2).DahererscheintdasModell
deranomalenDiusionalsdiegeeignetereInterpretationderFCS-Messungen.InSystemen
mit mehreren realen Komponenten und behinderter Diusion [97 , 118 ] ist eventuell eine
gleichzeitige Beobachung der interessierenden Spezies undinerter Testmolekule
erforder-lich.
Die erwartete Abhangigkeit der Diusionseigenschaften von der Groe der Molekule,
ihr Zusammenhangmitder Chromatinstruktursowieder Einussvon unspezischenund
spezischenBindungen sollteninweiteren Experimenten genauer untersucht werden. Die
KombinationderFCSmitCLSMvereinfacht eineOrientierunginderZelleundermoglicht
erst diegleichzeitigeCharakterisierungvon DiusionunddreidimensionalerOrganisation.
6.1.2 Dextrane in HeLa-Zellen
Vermutlich hangt die Behinderungder Diusion durch diedreidimensionale Strukturdes
Zellkerns,wie sie im vorhergehenden Abschnittbeobachtet wurde, deutlich von der T
eil-chengroeab.SynthetischeMolekulewieDextranelassensicheinfachindeniertenGroen
z.B. durchMikroinjektioninZelleneinbringen,umdieBeweglichkeit zu untersuchen.Mit
anderenMethodenwie FRAPist diesschon durchgefuhrt worden [80 ],jedoch bestehtbei
FRAPdieGefahr,behinderteDiusionalsgroerenimmobilisiertenAnteilundlangsamere
freieDiusionzuinterpretieren[93 ,104 ].Daruberhinauswurdebeobachtet,dasssichkleine
DextranmolekulesehrhomogenimZellkernverteilen,groehingegendeutliche
Konzentra-tionsschwankungen zeigen, die mit der Dichteverteilung von Chromatin in Bezug gesetzt
werden konnen(P.Verschure, Swammerdam InstituteforLife Sciences, Amsterdam,
Nie-derlande, pers. Mitteilung). Die folgenden Experimente wurden in Zusammenarbeit mit
P.Verschuredurchgefuhrt.
Material und Methoden
HeLa ist eine Zelllinie,die einem humanenCervixkarzinomentstammt. HeLa-Zellen
wur-deninKammerdeckglasern unterdengleichenBedingungenwieimvoherhergehenden
Ab-schnittbeschriebenfurmindestens24 Stunden kultiviert.Dextrane sindhydrophile
Poly-saccharide,diesichdurchsehrguteWasserloslichkeit,geringeToxizitatundguteResistenz
gegenAbbaudurchzelleigendeGlycosidasenauszeichnen.VonmitdemFarbstoAlexa568
markierten Dextranmolekulen (Molecular Probes) mit einem durchschnittlichen
Moleku-largewicht von 10 und 70kDa wurden jeweils Stammlosungen von ca. 40M angelegt.
Verdunnungenvonetwa 1:10wurdenbei14000U/minfur10{15 minzentrifugiertundder
UberstandanschlieendinKernevonHeLa-Zellenmikroinjiziert.DieMikroinjektionwurde
vonR.Fischer(Abt.BiomedizinischeStrukturanalyse,DeutschesKrebsforschungszentrum,
Heidelberg) mit dem halbautomatischen System AIS der Firma Zeiss durchgefuhrt. Das
injizierteVolumenbetrug dabeitypischerweise5%des Kernvolumens. Einsolches
Vorge-hen gewahrleistet eine hohe
Uberlebenswahrscheinlichkeit der Zellen (P. Verschure, pers.
Mitteilung). Die Zellenwurden noch einmal eine Stundelang in denKammerdeckglasern
inkubiert,bevordiesezu mikroskopischenAufnahmenundFCS-Messungenbei
Raumtem-peraturauf dem Probentisch befestigt wurden.ZurKontrolle wurdenauch nichtinjizierte
Zellenverwendet.
DieBilderundFCS-MessungendiesesAbschnittswurdenindembeschriebenenAufbau
mitderScanningeinheitunddemObjektivUPlanApo 60/1.2Waufgenommen.
Dextrane in Losung
ZurCharakterisierung derhydrodynamischenEigenschaften wurdedie Diusion der
uo-reszenzmarkierten Dextrane in wassriger Losung untersucht. Mit FCS-Messungen einer
EichlosungvonAlexa488undvon1:10000-VerdunnungenderDextranstammlosungen
konn-tenderenKonzentrationenauf 40Mbestimmt werden.MitKenntnisdes
Diusionsko-eÆzienten von Alexa488, D = 2; 110 10
m 2
s 1
, konnen die DiusionskoeÆzienten und
hydrodynamischenRadienderDextraneausdenDiusionszeiten durchdenFokus
berech-netwerden:
D
10
= (8; 51;1)10 11
m 2
s 1
;
R = 2; 60; 3nm;
D
70
= (2; 700; 35)10 11
m 2
s 1
;
R
h;70
= 8; 11; 0nm: (6.3)
DieAbhangigkeitderRadienvonderMasse ergibtdamitungefahrR
h /m
1=2
.Einsolches
Verhalten ist einer elongierten, nicht-spharischen Form zuzuschreiben. Der
Diusionsko-eÆzient der 10kDa-Dextrane in wassriger Losung ist dem von EGFP sehr
ahnlich und
erlaubteinen Vergleich desDiusionsverhaltensin vivo.
FCS-Linescans in Zellen