kus Fok k
(a)
z
x Spalt
(b)
z
x anal Ka a
(c)
z
x e Fallee
(d)
Abbildung3.7: Grenzachen, die dieDiusionbeeinussen: (a)Einfache Grenzache,(b)
Spalt, (c)Kanal, (d) Falle.
3.3.3 Einuss von Grenzachen
Einfache Grenzachen
Ein weiterer Grund fur die Behinderung der Beweglichkeit ist die Anwesenheit von
un-durchlassigen Grenzachen, z.B. MembranenvonZellkompartimenten.AktiverTransport
oderDiusiondurchMembranenisti.a.viellangsameralsfreieDiusion,unddieMembran
ist auf derfurFCSrelevanten Zeitskala nahezuundurchlassig. Nimmt man vereinfachend
an, dass die Membran parallel zur optischen (z-) Achse und senkrecht zur x-Achse des
verwendeten optischenSystemsbeix=0 liegt(Abb.3.7), sobeschreibtfurfreieDiusion
ohneBleachingoderchemischeBindungdieDiusionsgleichung(3.24)mitder
Randbedin-gung
@c(r;t)
@x
=0 bei x=0 (3.72)
das Verhalten. Einem Versatz des Fokusmittelpunktes zur Membran wird mit p
k 6= 0
Rechnunggetragen, sieheGl.(3.27).Folgt mandemLosungsansatzaus[39,6 ,46 ],sosind
Dierenzialgleichung undKonzentrationeiner Fouriertransformationzu unterziehen:
@~c (k;t)
@t
= D
0 k
2
~ c(k;t)
~
c(k;t) = 1
(2) 3=2
Z
1
1 dx
Z
1
1 dy
Z
1
1
dzcos (k
x x)e
i(kyy+kzz)
c(r;t): (3.73)
DabeiistobigeRandbedingungdurchdieBeschrankungaufcos-Termeinx-Richtungschon
erfullt. Die
Ubergangswahrscheinlichkeit P
D (r
2
;jr
1
;0) { Gl. (3.25) { ergibt sich dann
durchdie Rucktransformation, nachdem mandie jetzt lineareDierenzialgleichung erster
Ordnung mitderBedingung c(r;0)=Æ(r) gelost hat:
P
Jetzt kann der Beitrag zur Autokorrelationsfunktion furdie von der Membran
beein-ussteDiusionsrichtung, x,berechnet werden:
g
Dabei ist b
x
= 0, wenn sich nur auf einer Seite der Membran, bei x 0, uoreszierende
Molekule benden, und b
x
! 1, wenn sie
uberall sind. Ausfuhren der Integrationen
ergibt
) dienormierte Errorfunktion[19 ]. Um die
dreidimen-sionale Korrelationsfunktionzu erhalten, multipliziert man Gl. (3.76) mit den Beitragen
deranderenRaumrichtungen.
Abb. 3.8 zeigt den Verlauf der Korrelationsfunktion fur verschiedene Parameter mit
FluorophorenaufbeidenSeitensowiedieAnpassungandasModellderbehinderten
Diu-sion,Gl.(3.65).DerVerlaufderKurvenfurb
x
! 1undfurb
x
=0istnahezuidentisch.
Sehrnaheanundsehrweitentferntvon Grenzachenweicht dieDiusionnichtsehr
deut-lich von unbehindertem Verhalten ab, insbesondere fur p
k
= 0 erhalt man eine
"
freie\
KorrelationsfunktionmitdoppelterAmplitude.InunendlichweiterEntfernung
verschwin-det der Einuss der Membran, unddie Korrelationsfunktion geht in Gl. (3.33) uber. Bei
AbstandenaufderSkaladesFokusradiusistdieAbweichungjedochdeutlich,undauchdie
0.001 0.1 10 1000
Abbildung 3.8:
Korrelationsfunktio-nen fur verschiedene Abstande p
k;x in
x-Richtung von einer beidseitig von
Fluorophoren umgebenen Grenzache
(durchgezogen) und fur p
k;x
= w
k fur
eine einseitig von Fluorophoren
um-gebene Grenzache (gestrichelt;
Para-meter wie in Abb. 3.6): Der Grad
der Behinderung ist fur groe und
kleine Abstande vernachlassigbar, bei
Abstanden auf der Skala des F
okusra-dius jedoch deutlich.
Kanale und Spalte
Neben Grenzachen existieren in Zellen auch ein- oder zweidimensionale Strukturen in
Form von Kanalen oder Spalten, deren Inneresebenso wie die Umgebung diundierende
Molekuleenthalten (Abb. 3.7). Wenn dieGroe dieser Strukturen
ahnlich derdes F
okus-volumensist,d.h.wennderAbstandbegrenzenderFlachengroerodergleichdemhalben
FokusradiusinderentsprechendenRaumrichtungist,kanndieDiusionalsein-bzw.
zwei-dimensionalerProzessangesehen werden.Die Autokorrelationsfunktionen ergeben sich zu
G
wenn der Kanal oder der Spalt senkrecht zur z-Achse verlauft. Ist der Abstand der
be-grenzenden Flachenwesentlichkleinerals dieFokusradien,soistdie Korrelationsfunktion
in Anwesenheit eines Kanals in guter Naherung eine Summe von Gl. (3.77) undder
un-behinderten Korrelationsfunktion Gl. (3.33). Die Diusion in einem schmalen Spalt und
auerhalbderbegrenzendenFlachenmanifestiertsichineinemFCS-Experimentdurcheine
Summevon Gl. (3.77) und(3.76).
AuchKorrelationsfunktionen von ein- undzweidimensionalenDiusionsprozessen,
sie-he Gl. (3.77) undAbb. 3.9, konnen miteinem dreidimensionalenModellder behinderten
Diusion angepasstwerdenundzeigeneine wesentliche Abweichung von freier
dreidimen-sionalerBeweglichkeit.
Fallen { corralling
Wirdein Raumbereich indreiDimensionen begrenzt(Abb. 3.7), entsteht eine Kavitat,in
dereinbestimmterAnteilderuntersuchtenTeilchengefangenbzw.eingepferchtist(Caging
bzw.Corralling).OftbestehteinekleineWahrscheinlichkeitzurFluchtausdieserFalle,die
eine charakteristische Fluchtzeit
esc
deniert.Die KorrelationslangederKavitat deniert
denRadiusR fureine spharischeNaherung.
FurRw
k
beobachtetmanineinemFCS-ExperimentzweiKomponenten,eine
schnel-le dernicht gefangenen Molekulemitder freienDiusionszeit
di
undeinelangsame von
gefangenen MolekulenmitdermittlerenAufenthaltsdauer + .
WennR dieGroenordnung desFokusradius hat, ist dieDiusionsgleichungin
radial-symmetrischerForm mitgeeigneten Randbedingungen aufzustellen:
@c(r;t)
der Mittelpunkt liegt dabei im Ursprung, und h charakterisiert die Durchlassigkeit der
Grenzache.Die zugehorige
UbergangswahrscheinlichkeitlautetmitdenBesselfunktionen
J
dieKoeÆzienten
n
sinddie positivenLosungenvon
hR J
0
(R ) R J
1
(R )=0: (3.80)
Damitergibt sicheine AutokorrelationsfunktionderForm
G
also die Nullstellenvon J
1
(x), und aus einem
multiex-ponenziellen Fit an die gemessene Korrelationsfunktion lasst sich die Korrelationslange
derKavitatbestimmen,wennmanD
0
kennt. AlsSummevonExponenzialfunktionenfallt
Gl.(3.81) schnelleralsdieunbehinderteKorrelationsfunktionGl.(3.33) ab,daherfuhrt
ei-neAnpassungandasModellderanomalenDiusionzueinemAnomalieparameterd
w
<2.
3.3.4 Harmonisches Potenzial
In komplexen Systemen wie einer lebenden Zelle kommt es neben freier und geometrisch
behinderterDiusionvonMolekulenauchzu ihrerBindunganimmobilisierteStrukturen.
Dazu gehort auch der gerichtete Transport mit Hilfevon Motorproteinen, der wesentlich
langsamervorsichgeht alsdieBrown'scheBewegung[160].WenndieseStrukturenjedoch
selber beweglich sindund beispielsweiseals Teil eines Polymernetzwerks eingeschrankter
0.001 0.1 10 1000
0.0
Abbildung 3.9: Ein- und
zweidimen-sionale Korrelationsfunktionen
(Para-meterwiein Abb.3.6):Sielassen sich
andas Modellderbehinderten
Diusi-on anpassen, die Abweichungvon
frei-erDiusionistim
zweidimensionalen-Fall gering, im eindimensionalen Fall
jedoch markant.
Diusionunterliegen,konnenmitdiesenStrukturenassoziierteFluorophoreFluktuationen
ineinem FCS-Experiment hervorrufen.
Imeinfachsten Fall ndet die Brown'sche Bewegung in einemharmonischenPotenzial
derForm
mit einem Minimum bei r
c
statt. Der Parameter
^
K ist der Tensor der Federkonstanten,
derineinem isotropen System eineKonstantek ist.Mitdem Tensor
^
der
Reibungskoef-zienten, dersich ineinemisotropen Systemauf eine Konstante reduzierenlasst,ergibt
sichdie Bewegungs-oderLangevin-Gleichung
m
Die statistischenKrafteF
stoch
(t)bewirken eine zufallige AuslenkungausderRuhelage.
In einemoben beschriebenenbiologischen System kommt esneben Isotropie meist zu
uberkritischerDampfung [122, 121, 59 ], so dass der Tragheitsterm vernachlassigt werden
kann:
DarausresultierteinzusatzlicherTeilchenussj=cv= c=rU,unddaszweiteFick'sche
GesetzGl.(3.24) wirderweitertzurSmoluchowski-oderFokker-Planck-Gleichungder
Dif-fusionineinemPotenzial
@c(r;t)
Die Losung dieser Dierenzialgleichung fur ein Teilchen mitder Randbedingung, dass es
sich zur Zeit = 0 am Ort r
) {, beschreibt den
sogenanntenOrnstein-Uhlenbeck-Prozess 5
undist die
Gl.(3.86) gehtfureinverschwindendesPotenzial (k=!0)inGl.(3.25)uber, unddie
stationare Gleichgewichtsverteilunglautet
W
Der Ornstein-Uhlenbeck-Prozessstellt den einfachsten Fall eines stationaren Markow-Prozesses dar,
DieGroe k=ist diecharakteristische Relaxationskonstante des
uberkritischgedampften
Oszillators.Das VerhaltnisderAufenthaltsdauer imFokusim Fallefreier Diusion
di
zurRelaxationszeitstatistischerAuslenkungen
relax
undumsogroer, je starkerdasPotenzial ist.
In Analogie zu Abschnitt3.2.2 kann dieAutokorrelationsfunktion faktorisiert werden.
Setzt manGl.(3.86) und(3.87) ein,ergeben sich
g
die Verschiebung von
PotenzialminimumundFokusmittelpunkt. Gl.(3.28) wird zu
G
Da ein solcherdiundierenderOszillator immer wiederin denFokus zuruckkehrt und
sich deutlich langsamer bewegt als ein freies Brown'sches Teilchen, ist Photobleaching zu
berucksichtigen. NurwennAustausch zwischenstrukturgebundenen undfreien
uoreszie-rendenMolekulenstattndet,stelltsicheinGleichgewichtein,undderBleichprozesskann
als reversibel analog zur Besetzung der Triplettzustande betrachtet werden. Genahert ist
also Gl.(3.90) miteinem exponenziellen Korrekturfaktorzu versehen:
exp
Gl.(3.90) mit(3.91) beschreibtfurN =1eine punktformigediundierendeStruktur.
Der andere Grenzfall ist ein in q homogen verteiltes Ensemble unabhangiger, gleich
heller Oszillatoren, diejeweils als einzelneSpeziesbetrachtet werdenkonnen. Wie in
Ab-schnitt 3.2.7 beschrieben, wird die Korrelationsfunktion dann als Summe von
Korrelati-onsfunktionenGl. (3.90) einzelnerSpeziesberechnet,gewichtet mitderrelativen
Konzen-tration { indiesem Fall 1=V { unddem Quadrat derHelligkeit.Die Summe geht
d.h. der zeitabhangige undder -unabhangige Summand, die sich aus Gl. (3.90) ergeben,
konnen getrennt faktorisiertundberechnet werden.Gl. (3.92) wirdzu
G
0.001 0.1 10 1000
Abbildung 3.10: Korr
elati-onsfunktionen fur
verschie-dene Verhaltnisse von freier
Diusions- zu Relaxationszeit mit
D
undwirdbestimmtdurchdiemittlereZahlderTeilchenimFokuscV
e
,dieRelaxationszeit
=k und deren Verhaltnis zur
"
freien\ Aufenthaltsdauer im Fokus w 2
0
=4D
0
. Auch fur
eine Verteilung diundierenderOszillatoren kann Photobleaching genahert mitGl. (3.91)
berucksichtigt werden.
InsbesonderegehtGl.(3.93)inGl.(3.33)
uber,wenndasPotenzialverschwindet(k=!
0).Die Korrelationbrichtzusammenbzw.G
kk
()!0,wenndasPotenzial growirdund
die Bewegungen einfrieren (siehe auch Abb. 3.10). Daruberhinaus stimmt Gl. (3.93) mit
(3.90)fureinelateraleVerschiebungvon(q 2
undeineaxialevonq
z
=z
0
uber-ein.EineAnpassungderKorrelationsfunktionennachdem ModellderanomalenDiusion
fuhrt zu einem Anomalieparameter d
w
< 2 und kleineren anscheinenden Diusionszeiten
(Abb. 3.10),da eine gerichtete Bewegungdiestatistische
uberlagert.Die mittlere
quadra-tische Verschiebung verlauft also fur ausreichend kleineZeiten miteiner Potenz derZeit,
diegroer alseinsist.
DerParameterd
w
erlaubtsomiteineUnterscheidungzwischenfreier(d
w
>2) undraumlicheingeschrankter Diusion(d
w
<2).
3.4 UntersuchungvonintramolekularenFluktuationen inder
FCS
3.4.1 Nichtstrahlende Zustande am Beispiel EGFP
Wie in Abschnitt 2.2.2 gesehen, kommt es zu Fluktuationen des Protonierungs- bzw.
Io-nisationszustandes des Chromophors von EGFP (der F64L-S65T-Mutante von
Wildtyp-GFP). Nur inder anionischenKonformationB (bzw. im Intermediarzustand I, Abb. 2.7)
emittiertEGFPFluoreszenzoberhalbvon500nmbeiAnregungmit488nm.Mogliche
Me-chanismen der Protonierung sind der Konformationsubergang in die quasineutrale Form
A oder die Bindung eines H +
-Ions aus dem Losungsmittel. Ein vereinfachtes
Termsche-ma zur Beschreibung der Fluoreszenz sieht dann wie in Abb. 3.11 aus [54, 158 ]: Da die
Protonierungsreaktionennichtphotoinduziertsind,sindsiedeutlichlangsameralsdie
uo-reszierenden
Ubergange[24,30 ].EsstelltsichsehrschnelleinGleichgewichtzwischenBund
B*ein,dieFluoreszenzintensitatistalso proportionalzurBesetzung vonB:F
k
(t)/B(t).
DasweitereVorgehen
ahneltderBerucksichtigungderTriplettbesetzung:Die zeitliche
Entwicklung der Besetzungswahrscheinlichkeiten fur die drei Zustande A, B (eigentlich
- O
Abbildung 3.11: Vereinfachtes Termschema des Protonierungsgleichgewichts des
EGFP-Chromophors (Abb. 2.7). Es ist P=B{H.
B+B*) undP=B{H beschreiben diefolgendengekoppelten Ratengleichungen
d
ZurKorrelationsfunktiontragennurMolekule bei,diezur Zeitt=0ein Photonemittiert
habenundsich inBbenden:
0
Es stelltsich ein Protonierungsgleichgewicht ein.Mit dieser Randbedingungkann der
zeitliche VerlaufderBesetzung von Banalytischangegeben werden:
B(t)=(1
dabeiergibtsich furdieAmplitudenundZeitkonstanten derexponenziellen Zerfalle
Nimmt man weiter an, dass die
Ubergangsraten nicht von der Beleuchtungsintensitat
abhangen{diestritallerdingsnurfurkleineIntensitatenzu[54 ,139 ]{unddasssiekleiner
alsdieDiusionsrate1=
di
sind,kanndenFluoreszenzuktuationenaufgrunddessich
ein-stellendenProtonierungsgleichgewichtsmiteinemKorrekturfaktorauszweiexponenziellen
Zerfallenanalogzur Triplettkorrektur(Abschnitt3.2.4) Rechnung getragen werden:
1
Da diemittlereFluoreszenzintensitat proportionalzurGleichgewichtsbesetzung B(1)
ist,charakterisiert dasSaure-Base-Gleichgewicht der Protonierung[21]nach
hF
wasauch ausGl.(3.96) und(3.97) abgeleitetwerdenkann.
DieFluktuationen unddiemittlereIntensitatderFluoreszenzmachenEGFPzueinem
moglichennichtinvasivenIndikatordeslokalenpH-WertesineinerlebendenZelle.