f1 ori
SV40 poly A DsRed1 P CMV IE
P SV40e SV40 ori
P
Not I (1361)
Stu I
(2538) Kan r / Neo r
MCS
(591D671)
SnaB I
(341)
Stu I
(1115)
Abbildung 6.14: Plasmidkarte des
DsRed-Expressionsvektors.
FCS-Linescans in Zellen
2.0 2.4 2.8
DsRed -d w
0 2 4 6 8 10
0 20 40
EGFP-Intensit t [kHz]
laterale Position [ µ m]
(a)
(b)
(c) (d)
(e) (f)
Abbildung 6.15: FCS-Scan durch eine
H2B-EGFP- und DsRed-exprimierende
HeLa-Zelle:(a) Anomalieparameter d
w
von DsRed und (b) EGFP-Intensitat
als Funktion der Position in der Zelle,
(c) konfokales Fluoreszenzbild im
Ka-nal 0 (EGFP, 156172 Punkte,
Pixel-abstand100nm)mitdenPositionenfur
FCS-Messungen vor und (d) nach dem
FCS-Scan, (e)langsamer
aufgenomme-nes konfokales
Ubersichtsbild im
Ka-nal 0 (150150 Punkte, Pixelabstand
200nm) und (f) im Kanal 1 (DsRed).
WieschonbeidenMessungenderBeweglichkeitvonAlexa568konnteauchinnicht
DsRed-exprimierenden HeLa-Zellen mit analogem Vorgehen gezeigt werden, dass die zellulare
Autouoreszenz und das
Ubersprechen des EGFP im Detektionsspektrum von Kanal 1
gegenuber der Fluoreszenz von DsRed vernachlassigt werden kann, wahrend die
EGFP-Fluoreszenz im Kanal 0 bei Anregung mit 488nm ein deutliches Signal ergibt. Durch
Aufnahme zweifarbiger konfokaler Bilder konnten Zellen in der Interphase anhand ihrer
Chromatinstrukturausgewahlt werden,diegleichzeitig H2B-EGFPundDsRed
exprimier-ten.DessenroteFluoreszenzwarrelativgleichmaiginderganzenZelleverteilt.Eswurden
LinieninKernendieser Zellenfestgelegt, dienicht durch denNukleolus verliefenund
ent-langdenenFCS-MessungenanPunktenimAbstandvon1mdurchgefuhrtwurden.Nach
denFCS-Messungen wurde erneutein Fluoreszenzbild aufgenommen, um denVerlust an
Fluoreszenzintensitat sichtbar zu machen undeventuelle Bewegungen der Zelle zu
erken-nen.
2.0 2.5 3.0
3.5 0 2 4 6 8 10 12
40 60 DsRed -d w EGFP-Intensit t [kHz]
laterale Position [ µ m]
(a) (a)
(b)
(c) (d)
Abbildung6.16: FCS-Scan durch eine H2B-EGFP- und DsRed-exprimierende HeLa-Zelle:
(a)Anomalieparameter d
w
vonDsRed und (b) EGFP-Intensitatals Funktion der Position
inderZelle,(c)konfokalesFluoreszenzbild imKanal 0(EGFP, 188236 Punkte,
Pixelab-stand 100nm) mitden Positionen fur FCS-Messungenvor und (d) nach dem FCS-Scan.
Es konnte keine Immobilisierung der DsRed-Molekule beobachtet werden. Sie
zeig-ten
uberall im Kern behinderte Diusion mit einem mittleren Anomalieparameter von
d
w
=2,20,3 undeiner Diusionszeitvon
di
=2,00,7ms. Die nurgeringe Anzahlan
berucksichtigten Zellen fuhrt zu den groen Standardabweichungen. Trotzdem lasst sich
aus der in Abschnitt 6.1.2 bestimmten relativen nuklearen Viskositat von HeLa-Zellen
der DiusionskoeÆzient der DsRed-Molekule in Wasser zu 2,410 11
m 2
s 1
abschatzen.
Er ist bei gleicher molekularer Masse der Monomere deutlich kleiner als der von EGFP
(8,710 11
m 2
s 1
), was auf die Bildungvon Multimeren, vermutlich den bereits
beobach-teten Tetrameren, hindeutet [8 ].
Um die raumliche Abhangigkeit des Diusionsverhaltens zu veranschaulichen, ist in
Abb.6.15a derAnomalieparameterderDiusionvon DsRed ausderAnpassungder
Kor-relationsfunktionenandasModellderbehindertenDiusiongegendiePositionentlangder
in cmarkierten Liniein einemHeLa-Kern aufgetragen. Dabeiwurde einnichtstrahlender
ZustandangenommenmiteinerGleichgewichtsbesetzung von 0,3undeinerZeitkonstante
von 500s [56 ]. Es wurde das gleiche Vorgehen bei der Anpassung gewahlt wie im
Ab-schnitt6.1.1.Abb.6.15czeigt dieScanlinie,wiesievordemFCS-Scan ausgewahltwurde,
undddieLinie,diemannachdemScandurchAusbleichenderEGFP-Intensitaterkennen
kann. Dieses ebenso wie ein weiteres Beispiel(Abb. 6.16) zeigt, dass ein Zusammenhang
zwischender Dichte des durch EGFP-H2B markierten Chromatinsund der
Diusionsbe-hinderungbestehenkann.
Diskussion
In den beiden Experimenten, in denen die Dichte des uoreszenzmarkierten Chromatins
mitden Eigenschaften dermolekularen Diusion inBezug gesetztworden ist,zeigten die
MolekulebehinderteDiusion.Die Viskositat furdie Alexa488-Molekuleim Kernist
wie-derum ca.4fach hoher als in Wasser, in guter
Ubereinstimmung mit denvorhergehenden
Ergebnissen.Unklarist,obderz.B.EGFPahnlicheAnomalieparameterderBeweglichkeit
von Alexa durchzusatzliche Klebrigkeit erhoht ist. Auf jedenFall zeigt er furdie kleinen
Farbstomolekule keine Korrelation mit der durch Histon-AFP-Chimaren dargestellten
Chromatindichte, wahrend trotz der kleinen Zahl untersuchter Zellen die Beweglichkeit
dergroeren DsRed-ProteinedurchdasChromatinbeeinusstzu seinscheint.
Darauslasst sichschlieen, dass fursehr kleineTeilchen selbstz.B. bewegliche
Prote-ine von der Groe des EGFP eher Hindernisse darstellen, als zur Viskositat beizutragen
(zum Vergleichkonnenein Tischtennis- undein Basketball dienen).FurgroereTeilchen,
z.B. funktionelle Proteine oder Komplexe (Medizinballe, um im Bild zu bleiben), tragen
MolekulederGroedesEGFPeherzurViskositatbei,alsbehinderndzuwirken.Eine
Be-hinderungderBeweglichkeiterfahrensievorallemdurchmehroderwenigerimmobilisierte
StrukturenwieetwaChromatin.EineUmorganisationderdreidimensionalenKernstruktur
z.B.durchChromatin-(De-)AcetylierungkonntealsodieZuganglichkeitvonBereichenfur
bestimmte MolekuleinAbhangigkeit von derenGroe deniertbeeinussen.
6.2 Bindung und Beweglichkeit funktioneller Proteine im
Zellkern
Viele biologische Fragestellungen beschaftigen sich mit Wechselwirkungen zwischen
Ma-kromolekulen,z.B.derBindungvonTranskriptionsfaktorenanDNA.FurUntersuchungen
in vitromussendieWechselwirkungspartneraufgereinigt,aberunter moglichst
physiologi-schenBedingungeninLosungvorliegen.SchwierigisteineUntersuchunginlebendenZellen
undGeweben, daeineselektive Beobachtung derbeteiligtenMolekulenotwendigist,ohne
die komplexen intrazellularen Bedingungen zu storen. Die Entwicklung von
autouores-zenten Proteinen und uoreszenzmikroskopischen Methoden wie FCS, FLIP und FRAP
indenletzten JahrenbietetMoglichkeiten,MobilitatenundWechselwirkungenin vivo zu
untersuchen.Imfolgenden wirdamBeispieldesTranskriptionsterminationsfaktorsTTF-I
in HeLa-Zellen ein gemeinsam mit T. Weidemann (Abt. Biophysik der Makromolekule,
Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg) entwickeltes und angewandtes Konzept
vorgestellt, mit dem einstuge spezische Bindungen in lebenden Zellen charakterisiert
werden konnen.
6.2.1 Der Transkriptionsterminationsfaktor TTF-I in HeLa-Zellen
Eukaryotische ribosomale RNA (rRNA)ist der Hauptbestandteil der Ribosomen, der im
ZytoplasmabendlichenKorper,indenendieProteinbiosynthesestattndet.DiefurrRNA
codierenden Gene benden sich in Gruppen, die sich durch einen recht gleichmaigen
Wechsel von codierenden und nichtcodierenden Sequenzen auszeichnen. Die
nichtcodie-renden Bereiche enthaltenden Promotor oberhalb(upstream, in5'-Richtung bezogen auf
den codierenden Strang) des Strukturgens, einen Transkriptionsterminator T
0
direkt vor
demPromotorundweitereBindungsstellenfurTranskriptionsfaktoren.WeitereKopiendes
Transkriptionsterminators, T
1 {T
10
,bendensichunterhalb(downstream, in3'-Richtung)
des codierenden Abschnitts. Zur Initiation der Transkription bindenspezische Faktoren
an dieentsprechenden Bindungsstellen unddieRNA-PolymeraseI an denPromotor. Der
ausdenFaktoren undderPolymerasegebildeteKomplexfalltnachBeginnder
Transkrip-tionwiederauseinander,unddiePolymerasewandertin3'-Richtungauf demcodierenden
StrangundsynthetisiertdieRNA.DerTranskriptionsterminationsfaktorTTF-Ibindetan
eine der Terminatorsequenzen T
1 {T
10
und stoppt die Polymerase. Die fur rRNA
codie-renden Bereiche benden sich in vivo im Nukleolus, alle anderen Gene werden von den
RNA-Polymerasen IIundIIIauerhalb desNukleolus abgelesen.
Esistin vitro beobachtetworden,dassdieExistenzdesTerminatorsT
0
die
Transkrip-tionsinitiation erleichtert, eventuell durch Bindung von TTF-I, das eine mogliche
Tran-skriptiondesnichtcodierendenBereichsstopptunddenfolgendenPromotordavorschutzt,
blockiert zuwerden[51 ]. AllerdingsbeeinusstdieBindungvonTTF-1 anreine DNAdie
Transkription nicht. Weitere Ergebnisse [74 , 73 ] legen die Vorstellung nahe, dass an T
0
inChromatin gebundenes TTF-1 das Chromatinin einem mehrstugenProzess
umorga-nisiert,z.B. die Nukleosomenso im Bereich des Promotors verschiebt oder ihreBindung
lockert, dass der Transkriptionskomplex besonders eÆzient bindenkann. TTF-1 hat also