3.2.1 Standardzellkultur
Die IPEC-J2-Zellen wurden in 10 ml DMEM/HAM’S-FKS in 75 cm2-Zellkulturflaschen kultiviert. Die Inkubation der Zellen erfolgte im Brutschrank bei einem CO2-Gehalt von 5 % und einer relativen Luftfeuchte von 95 % bei 37 °C. Das Medium wurde alle 3 bis 4 Tage gewechselt. Die Zellen wurden im Abstand von 7 bis 8 Tagen subkultiviert.
3.2.2 Subkultivierung von Zellen
Adhärent wachsende Zellen wurden nach Erreichen eines konfluenten Monolayers durch enzymatisches Aufbrechen der Zell-Matrix-Verbindung mit Trypsin/EDTA vom Boden der Kulturflasche abgelöst und 1:10 verdünnt in eine neue 75 cm2-Zellkulturflasche gesät. Dazu wurden die Zellen zunächst mit 10 ml 1xPBS gewaschen und für ca. 10 min bei 37 °C in 5 ml 0,05 %/0,02 % Trypsin/EDTA in 1xPBS inkubiert. Die abgelösten Zellen wurden 1 min bei 155xg und Raumtemperatur zentrifugiert, in 10 ml 1xPBS gewaschen, erneut zentrifugiert und im Anschluss in 5 ml DMEM/HAM’S-FKS aufgenommen. 5x105 Zellen wurden in eine neue Zellkulturflasche überführt. Nach 24 h Inkubation im Brutschrank erfolgte ein Wechsel des Mediums.
3.2.3 Zellzahlbestimmung
Zur Bestimmung der Lebendzellzahl wurde nach Trypsinierung (3.2.2) und Waschen der Zellen mit 1xPBS ein Aliquot der Zellsuspension 1:10 mit Trypanblau verdünnt und am Umkehrmikroskop in einer Neubauer-Zählkammer gezählt. Die Konzentration der Zellen wurde durch Multiplikation der aus 4 Großquadraten gemittelten Anzahl nicht blau gefärbter und demnach lebender Zellen mit dem Kammerfaktor (1x104 Zellen) und dem Verdünnungsfaktor (10) errechnet.
3.2.4 Kryokonservierung und Auftauen von Zellen
Zur Langzeitaufbewahrung wurden die Zellen kryokonserviert. 24 h vor der Subkultivierung erfolgten ein Wechsel des Mediums und die Zugabe von Penicillin/Streptomycin (100 Einheiten bzw. 100 µg/ml). Nach Trypsinierung (3.2.2) und Waschen der Zellen wurden je 1x106 Zellen in 1,8 ml DMEM/HAM’S-FKS und 200 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) in Kryoröhrchen überführt, für kurze Zeit auf Eis inkubiert und über Nacht bei -80 °C gelagert.
Im Anschluss wurden die Röhrchen zur Langzeitlagerung bei -196 °C in flüssigen Stickstoff überführt.
Zur Rekultivierung der Zellen wurden diese direkt nach der Entnahme aus dem Stickstoffbehälter in einem 37 °C warmen Wasserbad aufgetaut und mit 10 ml warmen Zellkulturmedium in eine 25 cm2-Zellkulturflasche ausgesät. Nach einer Ruhephase von 24 h wurde das Medium gewechselt, um das zytotoxische DMSO und abgestorbene Zellen zu entfernen.
3.2.5 Adhäsionstest
Für die Adhäsionstests wurden 1x105 bzw. 5x104 Zellen/Loch in 1 ml bzw. 500 µl DMEM/HAM’S-FKS in 12- bzw. 24-Loch-Zellkulturplatten eingesät (3.2.2). Die Zellen wurden nach Ausbildung eines konfluenten Zellmonolayers innerhalb von 5 bis 7 Tagen nach dem Aussähen für den Zelltest genutzt. Die durchschnittliche Anzahl der Zellen betrug dann 2,6x105 bzw. 1,3x105 Zellen/Loch. Vor Testbeginn wurde das Medium erneuert.
Zur Herstellung des Inokulums wurden die Bakterien in LB- bzw. BHI-Medium bei 200 rpm und 37 °C bis zur OD600 1,0 angezogen, 5 min bei 8000xg zentrifugiert und in DMEM/HAM’S-FKS resuspendiert. Wenn nicht anders angegeben, wurden die Epithelzellen mit einer Multiplicity of Infection (MOI; Anzahl Bakterien/Wirtszelle) von 100 inokuliert (Volumen Inokulum 100 bzw. 50 µl). Die Zellkulturplatten wurden vorsichtig geschwenkt, um die Bakterien gleichmäßig zu verteilen, und für einen definierten Zeitraum im Brutschrank bei einem CO2-Gehalt von 5 % und einer relativen Luftfeuchte von 95 % bei 37 °C inkubiert. Im Anschluss wurden die Zellen dreimal mit je 2 ml 1xPBS gespült, um nicht adhärente Bakterien zu entfernen, und mit 1 ml 0,1 % Triton X-100 in H2Obidest lysiert. Das Lysat wurde dezimal in 150 mM NaCl verdünnt, in dreifacher Wiederholung auf LB-Agar ausplattiert und die Agarplatten über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Anzahl adhärenter Bakterien wurde durch Zählung der koloniebildenden Einheiten (KBE) unter Berücksichtigung des Verdünnungs-faktors bestimmt.
3.2.6 Infektionstest
Zellen und Bakterien wurden analog zum Adhäsionstest vorbereitet und die Zellen mit den Bakterien infiziert. Nach 3 h Inkubation im Brutschrank wurden die Zellen dreimal mit 1xPBS gespült, mit frischem DMEM/HAM’S-FKS bedeckt und für weitere 3 h im Brutschrank inkubiert. Die Inkubationszeit von 6 h ermöglichte die Bildung von Mikrokolonien porciner aEPEC. Aufgrund der generell niedrigen Infektionsrate des verwendeten porcinen aEPEC-Stammes P2005/03 an IPEC-J2 wurde mit einer MOI von 100 gearbeitet. Der Nährstoff-verbrauch und die durch Wachstum und Stoffwechsel der Bakterien verursachte Ansäuerung des Mediums implizierten den Wechsel des Mediums nach 3 h, um eine Hemmung des Bakterienwachstums und ein Ablösen des Monolayers zu verhindern. Die Infektion der Zellen mit dem humanen typischen EPEC-Stamm E2348/69 erfolgte für 3 h, da dieser im Gegensatz zum porcinen aEPEC-Stamm eine sehr viel höhere Infektionsrate und eine schnellere Mikrokoloniebildung aufwies. Die Infektionsrate wurde jeweils nach dreimaligem Waschen mit 1xPBS, Lysis der Zellen mit 0,1 % Triton X-100 in H2Obidest und anschließendem Ausplattieren auf LB-Agar mit Antibiotikazusatz selektiv bestimmt. Dazu wurde dem LB-Agar Tetracyclin (5 µg/ml) für P2005/03 oder Nalidixin (30 µg/ml) für
E2348/69 zugegeben. Die Anzahl koloniebildender Einheiten (KBE) im definierten Zeitraum entsprach der Infektionsrate.
Um den Einfluss von Bakterienstämmen auf die Infektion zu untersuchen, wurden diese vor-, ko- oder nachinkubiert. Sofern nicht anders angegeben, wurden sie mit einer MOI von 100 eingesetzt. Bei Vorinkubation wurden die Bakterien 2 h vor der Infektion appliziert und vor Zugabe von P2005/03 bzw. E2348/69 nicht adhärente Bakterien durch dreimaliges Waschen der Zellen mit 1xPBS entfernt. Bei Ko- und Nachinkubation wurden die Bakterien gleichzeitig bzw. 1 h später als P2005/03 bzw. E2348/69 appliziert. Abb. 4 gibt einen schematischen Überblick zum zeitlichen Ablauf der Infektionstests. Um die Anzahl adhärenter Bakterien der vor-, ko- oder nachinkubierten Stämme zu bestimmen, wurden die Lysate zusätzlich auf LB-Agar ausplattiert, die Gesamtzahl adhärenter Bakterien bestimmt und im Anschluss die Zahl adhärenter aEPEC/EPEC-Bakterien subtrahiert.
Der Einfluss von Kulturüberständen auf die aEPEC-Infektion wurde durch Vor- und Koinkubation überprüft. Die Kulturüberstände wurden aus Schüttelkulturen in DMEM/HAM’S-FKS gewonnen (3.1.4) und unverdünnt eingesetzt.
Abb. 4: Schema zum zeitlichen Ablauf des Infektionstests
3.2.7 Wachstumskinetik adhärenter aEPEC an IPEC-J2
Mit Hilfe von Wachstumskinetiken wurde das Wachstum adhärenter Bakterien von aEPEC an den Epithelzellen ermittelt. Dazu wurden IPEC-J2-Zellen in 24-Loch-Zellkulturplatten für 2 h mit P2005/03 infiziert. Dieser Zeitraum ermöglichte eine Adhäsion der Bakterien an die Wirtszelle, nicht jedoch die Bildung von Mikrokolonien. Im Anschluss wurden die Zellen dreimal mit 1xPBS gewaschen. Die Verdopplungszeit für P2005/03 im Zellkulturüberstand betrug 30 min. Um das erneute Anheften von Bakterien aus dem Überstand an die Zellen zu vermeiden, wurden die Überstände alle 30 min abgenommen und durch frisches Medium ersetzt. Über einen Zeitraum von 2,5 h wurde ebenfalls alle 30 min die Zahl adhärenter Bakterien durch Zelllysis und Ausplattieren auf Tet-LB-Agar bestimmt. Das Wachstum der Mikrokolonien wurde mit Hilfe von Wachstumskurven (halblogarithmisches Auftragen der Zahl adhärenter Bakterien pro Zeitpunkt) und durch Ermittlung von Verdopplungszeit td, Teilungsrate und Wachstumsrate während der logarithmischen Wachstumsphase charakterisiert.
td = t / n t = Zeitraum der Messung
n = Zahl der Generationen bzw. Teilungen
n = (logN – logN0) / log2 N = Zahl der Bakterien nach n Teilungen
N0 = Zahl der Bakterien zu Beginn des Versuchs
= n / t
= ln2 / td
Der Einfluss von EcN auf das Mikrokoloniewachstum von P2005/03 wurde nur bei Vorinkubation ermittelt. Dazu wurde EcN auf IPEC-J2 2 h vorinkubiert. Vor Infektionsbeginn wurden alle nicht adhärenten Bakterien von EcN durch dreimaliges Waschen mit 1xPBS entfernt (3.2.6).