Komplementierung eines F1C-negativen E. coli-Stammes mit dem foc-Operon

inhibierenden Effektes auf die aEPEC-Infektion tatsächlich auf die Deletion der F1C-Fimbrien in EcN zurückzuführen war, sollte EcN foc mit dem foc-Operon komplementiert werden.

Darüber hinaus sollte das foc-Operon in IMT13962 und MG1655 eingebracht werden. Beide Stämme wiesen im Wildtyp keine F1C-Fimbrien auf und waren deutlich weniger adhärent an IPEC-J2 als EcN. Anhand dessen sollte untersucht werden, ob durch Bildung von F1C-Fimbrien die Stämme besser an IPEC-J2 adhärieren und dadurch ebenfalls ein inhibierender Effekt auf die aEPEC-Infektion vermittelt wird. Von der Arbeitsgruppe T. A. Ölschläger (Universität Würzburg) wurde dafür der Cosmid-Klon pCosF1C6 aus einer mit Hilfe des SuperCos1-Vektors (Stratagene, Heidelberg) erstellten EcN-Genombank zur Verfügung gestellt. Das Cosmid pCosF1C6 enthielt das vollständige foc-Operon. Es wurde mittels Elektroporation (3.4.6.2) in EcN foc, MG1655 und IMT13962 eingebracht.

Die Transformation von EcN foc gelang nicht. Erfolgreich transformierte Klone von MG1655 verloren das Cosmid trotz Antibiotikaselektion nach zwei- bis dreimaligem Überimpfen.

Zudem zeigten die Klone ein extrem langsames Wachstum.

EcN besitzt bereits 2 kleine, genetisch sehr stabile Plasmide mit einem ColE1- bzw. ColE2-ähnlichen Replikationsursprung (Blum-Oehler et al., 2003). Um eine mögliche Plasmidinkompatibilität mit dem SuperCos1-Vektor (ColE1-Replikationsursprung) zu umgehen, wurde versucht, das foc-Operon (ca. 12,5 kb) in den Cosmidvektor pLA2917 [RK2-Replikationsursprung, (Allen und Hanson, 1985)] zu klonieren. Die Transformation von EcN foc mit pLA2917 gelang ebenfalls nicht. Somit konnte EcN foc nicht mit dem foc-Operon komplementiert werden. Der endgültige Nachweis, ob der Verlust der Adhäsionsfähigkeit von EcN foc und des inhibierenden Effektes auf die aEPEC-Infektion auf die Deletion der F1C-Fimbrien zurückzuführen war, konnte damit nicht erbracht werden.

Es gelang jedoch, IMT13962 über Einbringen des Cosmids pCosF1C6 mit dem foc-Operon zu komplementieren (IMT13962 pCosF1C6). Das Cosmid blieb über mindestens 8 Generationen stabil im Stamm erhalten. Der Nachweis erfolgte mittels Plasmidaufarbeitung (3.4.1.2) und PCR (focA) (3.4.4). Die rasterelektronenmikroskopische Aufnahme in Abb. 24 zeigt die Adhäsion der Komplementante an IPEC-J2 nach 4 h Inkubation. Ein Teil der Bakterien produzierte in solch starkem Maße Fimbrien, dass die Oberfläche der Bakterien vollständig von ihnen bedeckt wurde. Die Überproduktion deutet auf eine nicht kontrollierte, übermäßige Expression der foc-Gene und eine außerordentliche metabolische Belastung der Bakterienzelle hin.

Abb. 24: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von IMT13962 pCosF1C6 an IPEC-J2 nach 4 h

Die Inkubation auf IPEC-J2 erfolgte mit MOI 100 für 4 h bei 37 °C in DMEM/HAM’S-FKS. Der schwarze Pfeil kennzeichnet die Bakterien, der weiße Pfeil die Fimbrien. Maßstab 1 µm

Im Adhäsionstest wurde überprüft, ob IMT13962 pCosF1C6 gegenüber dem Wildtyp IMT13962 eine höhere Adhäsionsfähigkeit an IPEC-J2 besitzt. Dabei zeigte sich, dass die Adhäsionsrate von IMT13962 pCosF1C6 um 200 % anstieg (p=0,023), jedoch 50 % unter der von EcN lag (p=0,008; Abb. 25). Die Ergebnisse bestätigten, dass F1C-Fimbrien die sehr gute Adhäsion von E. coli an IPEC-J2 vermitteln können. Zusätzlich wurde der Referenzstamm RZ525 auf seine Adhäsionsfähigkeit an IPEC-J2 getestet. Es handelt sich hierbei um einen uropathogenen E. coli-Stamm (UPEC), der eine hohe klonale Ähnlichkeit zu EcN aufweist (Grozdanov et al., 2004) und ebenfalls F1C-Fimbrien bilden kann. Die tatsächliche Bildung wurde jedoch nicht überprüft. Auch dieser Stamm adhärierte sehr gut an IPEC-J2, deutlich geringer als EcN (um 45 %, p=0,036), aber ähnlich stark wie IMT13962 pCosF1C6 (p=0,469).

rel. Adhäsion (% EcN)

0 50 100

*

IMT13962 IMT13962 RZ525 pCosF1C6

*

*

Abb. 25: Vergleich Adhäsion von IMT13962 pCosF1C6 und RZ525 mit EcN und IMT13962-Wildtyp an IPEC-J2 nach 2h

Die Inkubation der Stämme erfolgte für 2 h mit MOI 100 bei 37 °C in DMEM/HAM’S-FKS. Die Daten sind angegeben in Relation zur Adhäsion von EcN als Mittelwerte  Standardabweichungen aus 3 unabhängigen Tests. * p0,05, ¹ vs. EcN, ² vs. IMT13962

Um zu überprüfen, ob durch die sehr gute Adhäsion von weiteren E. coli-Stämmen über F1C-Fimbrien ein inhibierender Effekt auf die aEPEC-Infektion erzielt werden kann, wurden IMT13962 pCosF1C6 und RZ525 vergleichend zu EcN im Infektionstest mit P2005/03 eingesetzt. Wie in Abb. 26 dargestellt, reduzierte IMT13962 pCosF1C6 die Infektionsrate signifikant um 67 % (p<0,041) und unterschied sich hierin deutlich vom Wildtyp IMT13962 (p=0,043), der die Infektionsrate nur unwesentlich beeinflusste (p=0,419). Der inhibierende Effekt war jedoch geringer als bei Vorinkubation von EcN (67 % vs. 83 %, p=0,002). Der UPEC-Stamm RZ525 zeigte eine deutliche, aber geringere Inhibierung als die Stämme IMT13962 pCosF1C6 und EcN (48 %, p=0,175). Der Vergleich dieser Ergebnisse mit den in Abb. 25 dargestellten Adhäsionsraten verdeutlicht, dass die Stärke des inhibierenden Effektes von EcN und IMT13962 pCosF1C6 korrelliert war mit ihrer Adhäsionsfähigkeit an IPEC-J2. Die verringerte Adhäsion von IMT13962 pCosF1C6 gegenüber EcN resultierte dabei in einer verringerten Inhibierung der aEPEC-Infektion. Gleichzeitig zeigte aber RZ525 im Vergleich zu IMT13962 pCosF1C6 trotz leicht erhöhter Adhäsionsrate einen geringeren inhibierenden Effekt auf die aEPEC-Infektion. Die Unterschiede zwischen IMT13962 pCosF1C6 und RZ525 waren jedoch nicht signifikant.

Die Ergebnisse zeigen, dass der inhibierende Effekt auf die aEPEC-Infektion durch Einbringen des foc-Operons in den nicht adhärenten Stamm IMT13962 auf diesen übertragen werden konnte. Dadurch wurde belegt, dass die Adhäsion via F1C-Fimbrien den

inhibierenden Effekt vermittelte. Gleichzeitig wurde für einen weiteren an IPEC-J2 sehr gut adhärenten E. coli-Stamm (RZ525) ein inhibierender Effekt auf die aEPEC-Infektion nachgewiesen.

rel. Infektion P2005/03 (% Monoinfektion)

0 50 100

EcN IMT13962 IMT13962 pCosF1C6

RZ525

*

*

*

*

Abb. 26: Infektionsrate von P2005/03 an IPEC-J2 bei Vorinkubation von IMT13962 pCosF1C6 und RZ525

Die Infektion von IPEC-J2 mit P2005/03 erfolgte über 6 h mit MOI 100 bei 37 °C in DMEM/HAM’S-FKS. Die Daten sind angegeben in Relation zur Monoinfektion von P2005/03 als Mittelwerte  Standardabweichungen aus 3 unabhängigen Tests. * p0,05, ¹ vs. Monoinfektion, ² vs. EcN, ³ vs.

IMT13962

4.3.3 Bedeutung der Flagellen von EcN für den inhibierenden Effekt auf die