Bedeutung der Flagellen von EcN für den inhibierenden Effekt auf die

4.3.3.1 Bedeutung der Flagellen für die Adhäsion von EcN an IPEC-J2

Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen in Abb. 5 (4.1.1) zeigten, dass EcN auf IPEC-J2 ein Netzwerk aus filamentartigen Strukturen ausbildete, mit dem sich die einzelnen Bakterien untereinander vernetzten. Diese Strukturen unterschieden sich aufgrund ihrer Länge eindeutig von Fimbrien. Da EcN motil ist und Flagellen des Types H1 besitzt (Blum et al., 1995), wurde durch immunhistochemisches Anfärben der Filamente mit polyklonalen Antikörpern gegen H1 überprüft, ob es sich hierbei um Flagellen handelte. EcN wurde dazu mit MOI 100 über verschiedene Zeiträume (20 min bis 4 h) auf IPEC-J2 inkubiert, um Hinweise darauf zu erhalten, ob die Filamente während der Adhäsion gebildet wurden.

Die in Abb. 27 dargestellten epifluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen zeigen, dass die von EcN gebildeten Filamente durch Antikörper gegen H1 angefärbt wurden und somit Flagellen darstellten. In Abhängigkeit von der Inkubationszeit und damit von der Adhäsionsstärke von EcN konnte ein Anstieg der Flagellenzahl bzw. eine Verdichtung des Flagellennetzwerkes nachgewiesen werden. Besonders hervorzuheben ist hierbei, dass die Bakterien nach 20 min deutlich kürzere Flagellen ausbildeten als nach 1 h oder später.

Abb. 27: Bildung von H1-Flagellen durch EcN auf IPEC-J2

EcN wurde über verschiede Zeiträume auf IPEC-J2 mit MOI 100 bei 37 °C in DMEM/HAM’S-FKS inkubiert. Die Zellen wurden im Anschluss fixiert und die H1-Flagellen mit Hilfe der Primärantikörper Anti-H1 und Sekundärantiköper Anti-Kaninchen-IgG-FITC angefärbt (grün). Die Auswertung erfolgte am Epifluoreszenzmikroskop. Die Pfeile weisen auf eine Längenzunahme der Flagellen im Zeitraum von 20 min bis 1 h 20 min hin. Maßstab 10 µm

Zur Bestätigung der in Abb. 27 dargestellten Ergebnisse wurde mit Hilfe der Mutagenese nach Datsenko und Wanner (3.4.7) eine fliA-Mutante von EcN hergestellt (EcN fliA). FliA, ein Klasse 2-Gen des Flagellenoperons, kodiert für den Sigmafaktor 28, welcher die Trans-kription der hierarchisch nachgegliederten Klasse 3-Gene des Operons reguliert, unter ihnen fliC (kodiert für Flagellin) (Liu und Matsumura, 1995; Ohnishi et al., 1990). Die Deletion von fliA in EcN sollte damit zum vollständigen Verlust der Flagellenbildung führen.

Die Abb. 28 zeigt eine epifluoreszesmikroskopische Aufnahme von EcN fliA nach 2 h Inkubation auf IPEC-J2 und immunhistochemischer Anfärbung mit Antikörpern gegen H1-Flagellen. Es konnten keine filamentartigen Strukturen mehr nachgewiesen werden. Die zu erkennende Färbung der Bakterienoberfläche war auf eine unspezifische Markierung anderer Oberflächenantigene durch die polyklonalen Primärantikörper zurückzuführen. Sie wurde auch beim EcN Wildtyp nach 20 min Inkubation beobachtet, nach der die Bakterien nur wenige und kurze Flagellen aufwiesen (vergleiche Abb. 27).

Abb. 28: EcN fliA auf IPEC-J2 ohne Bildung von H1-Flagellen

EcN fliA wurde für 2 h auf IPEC-J2 mit MOI 100 bei 37 °C in DMEM/HAM’S-FKS inkubiert. Die Zellen wurden im Anschluss fixiert und mit Hilfe der Primärantikörper Anti-H1 und der Sekundärantikörper Anti-Kaninchen-IgG-FITC angefärbt (grün). Die Auswertung erfolgte am Epifluoreszenzmikroskop. Es wurden unspezifische Oberflächenstrukturen der Bakterien jedoch keine Flagellen angefärbt. Maßstab 10 µm

Neben der Fluoreszenzmikroskopie wurde auch die Rasterelektronenmikroskopie genutzt, um die Bildung von Filamenten durch EcN fliA nach Inkubation auf IPEC-J2 zu überprüfen.

Auch hier fehlten diese Strukturen (Abb. 29). Es wurde demnach eindeutig belegt, dass es sich bei den durch EcN auf IPEC-J2 gebildeten filamentartigen Strukturen um Flagellen handelte.

Abb. 29: REM – Bildung eines Flagellen-Netzwerkes durch EcN auf IPEC-J2

Die Stämme wurden für 4 h auf IPEC-J2 mit MOI 100 bei 37 °C in DMEM/HAM’S-FKS inkubiert. Die Zellen wurden fixiert und im Anschluss im Rasterelektronenmikroskop ausgewertet. Der Ausschnitt A zeigt die Flagellenbildung von EcN. Ausschnitt B zeigt die flagellennegative fliA-Mutante von EcN.

Schwarze Pfeile kennzeichnen die Bakterien, weiße Pfeile Flagellen, schwarz umrandete Pfeile Fimbrien. Maßstab 1 µm

Wie in Abb. 29 A zu erkennen, stellten die durch EcN auf IPEC-J2 gebildeten Flagellen in erster Linie interbakterielle Verbindungen dar. Es wurde daher untersucht, inwieweit die Flagellen auch zur Adhäsion von EcN an IPEC-J2 beitrugen. Dazu wurden EcN und EcN fliA für 2 h auf IPEC-J2 inkubiert und deren Adhäsion verglichen (3.2.5). Aus Abb. 30 ist ersichtlich, dass die Adhäsionsrate von EcN fliA im Vergleich zu EcN um 50 % reduziert war (p=0,001). Die Bildung von H1-Flagellen auf IPEC-J2 trug demnach wesentlich zur sehr guten Adhäsion von EcN an den Epithelzellen bei.

rel. Adhäsion (% EcN)

0 50 100

*

EcN fliA Abb. 30: Adhäsion EcN fliA an IPEC-J2 nach 2 h

Die Inkubation des Stammes auf IPEC-J2 erfolgte für 2 h mit MOI 100 bei 37 °C in DMEM/HAM’S-FKS. Die Daten sind angegeben in Relation zur Adhäsion von EcN als Mittelwerte  Standardabweichungen aus 3 unabhängigen Tests. * p0,05 vs. EcN

4.3.3.2 Einfluss der Flagellenbildung von EcN auf die aEPEC-Infektion

Es wurde überprüft, ob der inhibierende Effekt auf die aEPEC-Infektion bei Vorinkubation von EcN auf die Bildung von H1-Flagellen zurückzuführen war. Dazu wurden der EcN-Wildtyp und EcN fliA auf IPEC-J2 vorinkubiert und im Infektionstest (3.2.6) der Einfluss auf die Infektionsrate von P2005/03 bestimmt. Hierbei zeigte sich, dass EcN fliA die Infektions-rate signifikant um 63 % reduzierte (p=0,001) (Abb. 31). Der inhibierende Effekt war jedoch geringer als bei Vorinkubation von EcN (um 92 %; pvs. Monoinfektion=0,001; pvs. EcN fliA=0,001).

Der Vergleich dieser Ergebnisse mit den in Abb. 30 dargestellten Adhäsionsraten verdeutlicht wie schon zuvor bei den Stämmen IMT13962 pCosF1C6 und RZ525 (4.3.2.3), dass die Stärke des inhibierenden Effektes von EcN und EcN fliA mit deren Adhäsions-fähigkeit an IPEC-J2 korrelierte.

Die Ergebnisse zeigten, dass EcN auch ohne Ausbildung von H1-Flagellen einen inhibierenden Effekt auf die aEPEC-Infektion hatte. Mit Hilfe der EcN-Mutanten für Typ 1- und F1C-Fimbrien wurde zuvor nachgewiesen, dass der inhibierende Effekt zwingend von der Adhäsion via F1C-Fimbrien sowie der Adhäsionsstärke abhing (4.3.2.2). Da die Flagellenbildung maßgeblich die Adhäsion von EcN an IPEC-J2 erhöhte, trug sie somit indirekt zum inhibierenden Effekt auf die aEPEC-Infektion bei.

Col 5

EcN EcN fliA

rel. Infektion P2005/03 (% Monoinfektion)

0 50 100

*

*

Abb. 31: Infektionsrate von P2005/03 an IPEC-J2 bei Vorinkubation von EcN fliA

Die Infektion von IPEC-J2 mit P2005/03 erfolgte über 6 h mit MOI 100 bei 37 °C in DMEM/HAM’S-FKS. Die Daten sind angegeben in Relation zur Monoinfektion von P2005/03 als Mittelwerte  Standardabweichungen aus 3 unabhängigen Tests. * p0,05, ¹ vs. Monoinfektion, ² vs. EcN