Zellbiologische Arbeiten

B.2.2.1 Kultivierungsbedingungen von Makrophagen und Enterozyten

Alle Zelllinien wurden unter Standardbedingungen bei 37°C, 8% CO2 und feuchter Atmosphäre im Brutschrank kultiviert. Die Makrophagen wurden kultiviert in DMEM supplementiert mit 10% (v/v) fötalem Kälberserum (FCS) und 2 mM L-Glutamin (Vollmedium). Zur Vermehrung wurden die Zellen alle zwei Tage abgeschabt und in einer Verdünnung von 1:2 bis 1:3 auf Zellkulturflaschen mit frischem Medium verteilt.

Die Kultivierung der verwendeten Epithelzellen erfolgte in DMEM mit 4,5 g/l Glukose, 5% (v/v) FCS und 2 mM L-Glutamin. Die adhärenten Zellen wurden alle vier Tage mit PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 6,5 mM Na2HPO4; 1,7 mM KH2PO4; pH 7,2) gewaschen und zum Ablösen für 5 min mit Trypsin/EDTA inkubiert (0,05% (v/v) Trypsin / 0,02% (w/v) EDTA). Anschließend konnten die Zellen in Medium aufgenommen werden. Nach einer Zentrifugation bei 1000 x g für 5 min bei

RT wurde das im Überstand befindliche Trypsin/EDTA entfernt, die Zellen in Medium suspendiert und in einer Verdünnung von 1:5 bis 1:8 auf Zellkulturflaschen mit frischem Medium verteilt.

Zur längeren Konservierung der Zelllinien wurden die Zellen vor Erreichen der Konfluenz abgelöst, zentrifugiert und in eiskaltem Einfriermedium (70% (v/v) DMEM;

20% (v/v) FCS; 10% (v/v) DMSO) suspendiert. Nach Überführen in Kryoröhrchen wurden die Zellen 8 h bei –20°C und dann mindestens 24 h bei -80°C gelagert. Die dauerhafte Konservierung erfolgte in flüssigem Stickstoff.

Zum Auftauen wurden die Zellen durch kurzes Überführen in ein 37°C warmes Wasserbad zügig angetaut und mit frischem Medium wieder in Kultur gebracht.

Die Knochenmarksmakrophagen wurden in Zusammenarbeit mit Dr. W. Bäumer (Institut für Pharmakologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover) nach der von Lutz et al. (LUTZ et al. 1999) beschriebenen Methode isoliert und am Tag 12 für Stimulations- bzw. Infektionsversuche verwendet.

B.2.2.2 Stimulation und Infektion von Makrophagen und Enterozyten

Die Zellen wurden wie beschrieben abgelöst (B.2.2.1) und mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer gezählt. Die Aussaat erfolgte in Vollmedium in Zellkulturplatten oder Zellkulturschalen, so dass sich bei der Infektion eine Konfluenz von ca. 90% bei den Makrophagen und ca. 50% bei den Enterozyten ergab. Die Zellzahl ist bei der jeweiligen Methodenbeschreibung aufgeführt. Je nach Versuchsansatz wurden folgende Volumina verwendet: 0,5 ml für 12-well-, 1 ml für 6-well-Platten, 5 ml für kleine Zellkultur- (3,5 cm²) und 10 ml für große Zellkulturpetrischalen (9,4 cm²).

Am Versuchstag wurde zur Stimulation der Makrophagen LPS in einer finalen Konzentration von 5 µg/ml in das Medium pipettiert, im folgenden kurz als

„LPS (5 µg/ml)“ angegeben, und bis zu den Erntezeitpunkten auf den Zellen gelassen. Die Kontrollen blieben unbehandelt. Für eine Mykobakterieninfektion wurde das Medium abgesaugt und gegen die Infektionssuspension (B.2.1.1) ersetzt.

Nach einer Infektionszeit von 2 h wurden die Zellen mit PBS gewaschen, um alle noch extrazellulär gelegenen Mykobakterien zu entfernen und anschließend mit frischem Vollmedium inkubiert. In einigen Fällen wurden parallel Makrophagen mit Latexkügelchen (Ø 1 µm) versetzt. Dabei wurden die Latexkügelchen mit Komplett-medium auf eine OD660 von 0,15 eingestellt und die Makrophagen für eine

Für eine Stimulation der Enterozyten wurden diese am Versuchstag mit frischem Medium versetzt, das mit Zellkulturüberstand von (infizierten) Makrophagen in einer finalen Konzentration von 1,25 bis 25% versetzt war. Zusätzlich wurden Enterozyten mit LPS (5 µg/ml) stimuliert oder unbehandelt gelassen. Die Ernte der Enterozyten erfolgte nach einer Inkubation von 0,5 bis 48 h unter Standardbedingungen.

B.2.2.3 Hemmstoffversuche

Für die Hemmstoffversuche wurden die Makrophagen in kleinen Petrischalen (3,5 cm²) oder 6-well-Platten ausgesät und 24 h vor der Infektion bzw. Stimulation mit PBS gewaschen und frischem Medium versetzt. Für eine Hemmung der Transkription wurde 4 h nach der Infektion bzw. Stimulation der Makrophagen (B.2.2.2) ActinomycinD (ActD) mit einer finalen Konzentration von 5 µg/ml in das Medium pipettiert und die Zellen bis zu 8 h inkubiert. ActD gehört zu den antineoplastischen Antibiotika und hemmt in der eingesetzten Konzentration die DNA-abhängige RNA-Polymerase durch eine Komplexierung mit DNA (MARTIN et al. 1990). Damit wird dem Experimentator eine Untersuchung der Stabilität von RNA Transkripten ermöglicht. Bei einigen Experimenten wurde zeitgleich mit ActD der Hemmstoff SB203580 in einer finalen Konzentration von 10 µM zugesetzt. SB203580 reguliert direkt die p38 mitogen activated protein kinase (MAPK) (CUENDA et al.

1995). Die RAW264.7 Makrophagen wurden bis zu 8 h mit den Inhibitoren - einzeln oder in Kombination - inkubiert und für die Präparation von gRNA lysiert (B.2.4). Für eine Hemmung der Proteinsynthese wurden die Zellen für 15 min mit Cycloheximid (CHX) in einer finalen Konzentration von 10 µg/ml Medium inkubiert, infiziert und wie oben beschrieben mit ActD behandelt (MARTIN et al. 1990).

Um Kontaminationen mit Endotoxinen als ungewollte Stimulantien in der Zellkultur auszuschließen, wurden Kontrollversuche mit dem Peptidantibiotikum Polymyxin B durchgeführt (COYNE et al. 1994). Bei diesen Experimenten wurden die Zellen parallel zu den Infektionen mit Mykobakterien mit 10 µg/ml Polymyxin B vorinkubiert, nach 0,5 h infiziert und im weiteren Verlauf wie die infizierten Zellen behandelt und zur Isolierung von RNA genutzt.

B.2.2.4 Zellkulturüberstandanalysen

Für die Gewinnung der Zellkulturüberstände wurden RAW264.7 Makrophagen in Vollmedium ausgesät (5 x 10⁵ in 1 ml pro 12-well oder 1 x 10⁶ in 10 ml pro 9,4 cm²

Petrischale), über Nacht inkubiert und infiziert bzw. stimuliert (B.2.2.2). In einigen Fällen erfolgte die Infektion bzw. Stimulation in serumfreiem Makrophagenmedium (PAA, Cölbe). Nach 0,5 bis 48 h wurden die Zellkulturüberstände abgenommen, durch eine Zentrifugation von Zelltrümmern separiert (10000 x g für 30 sec bei 4°C) und in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß bei -70°C gelagert.

Die Bestimmung des NO-Gehaltes erfolgte mit unverdünnten Zellkulturüberständen nach der von Green et al. (GREEN et al. 1982) etablierten kalorimetrischen Meßmethode. Hierbei wird das gebildete NO aufgrund seiner kurzen Halbwertszeit in biologischen Systemen nicht direkt gemessen, sondern das vorhandene Nitrit, welches aus der Oxidation von NO mit freiem Sauerstoff hervorgeht.

In einer 96-well Mikrotiterplatte wurden 100 µl des Zellkulturüberstandes vorgelegt und mit 50 µl des diazotisierenden Reagenz Griess I (1% (w/v) Sulfonilamid; 5% (v/v) H3PO4) versetzt. Dabei entsteht ein transientes Diazoniumsalz. Nach Zugabe von 50 µl des Bindungsreagenz Griess II (0,1% (w/v) N-(1Naphthyl)-Ethylendiamin) bildet sich während der 10-minütigen Inkubation (RT) ein stabiler Azofarbstoff. Die Absorption dieses Produktes bei 550 nm ist linear proportional zu der Nitrikonzentration in der Probe. Aus Standardlösungen von 1,56 bis 100 µM Nitrit wurde eine Verdünnungsreihe von Nitrit in TKM-Puffer (50 mM Tris-HCl;

250 mM Saccharose; 25 mM KCl; 5 mM MgCl2; pH mit 5 N HCl auf 7,6 eingestellt) erstellt. Der Farbumschlag der Lösung wurde bei 550 nm am ELISA-Reader (H.8) photometrisch gemessen. Proben und Standards wurden in Duplikaten oder Triplikaten gemessen. Anhand der aus der Verdünnungsreihe abgeleiteten Standardgerade wurde die Konzentration von Nitrit in den Proben bestimmt.

Die Konzentrationsbestimmung von TNF-α erfolgte in einem ELISA in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. W. Bäumer (Institut für Pharmakologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover) wobei die zellfreien Kulturüberstände von Makrophagen 1:10 oder 1:20 verdünnt wurden.

Für den Nachweis weiterer Zytokine, Wachstumsfaktoren und freier Rezeptoren wurden sogenannte Zytokin-Antikörper-Arrays eingesetzt. Das Prinzip und die Anwendung dieser Detektionsmethode sind im Methodenteil unter B.2.10 beschrieben. Der Aufbau der verwendeten Membranen ist im Anhang (H.6) tabellarisch dargestellt.

B.2.2.5 Transfektion

Transfektionen, darunter versteht man auch das Einschleusen von Fremd-DNA in eukaryontische Zellen, wurden durchgeführt, um die Aktivität von Reportergenen in RAW264.7 Makrophagen zu testen. Zu diesem Zweck wurde der zu untersuchende Promotor vor das renilla Luciferasegen kloniert (B.2.3.6) und die Zellen nach Angaben des Herstellers mittels ExGen 500 transfiziert. Dieses nicht-liposomale Polyethylenimin-Derivat komplexiert mit der DNA. Aufgrund seiner hohen Ladungsdichte bildet es mit der DNA durch ionische Wechselwirkungen Partikel von etwa 50 nm Durchmesser. Diese gelangen über Endozytose in die Zelle. Noch bevor die Endosomen mit Lysosomen fusionieren, kommt es durch rapide osmotische Anschwellung und Lyse der Endosomen zur Abgabe der ExGen 500/DNA Komplexe in das Zytoplasma. Die Menge an gebildeter Luciferase, bzw. die Aktivität dieses Enzyms zeigt die Promotoraktivität an. Eine gleichzeitige Transfektion mit firefly Kontrollplasmid diente als interne Transfektionskontrolle. Die Aktivität der firefly Luciferase wurde zum Abgleich der renilla Luciferaseaktivität genutzt.

Pro Ansatz wurden 4 x 10⁶ Zellen in 10 ml Vollmedium in großen Zellkulturpetrischalen (9,4 cm²) ausgesät und über Nacht zum Erreichen einer 80%-igen Konfluenz inkubiert. Die benötigte Plasmid DNA wurde endotoxinfrei präpariert. Pro Petrischale wurden 0,025 µg firefly Kontrollplasmid mit 0,75 µg pIRGprom und 50 µl ExGen 500 eingesetzt. Nach einer Inkubation von 6 h bei 37°C wurden die Transfektionsreagenzien abgenommen, die Zellen von der Schale abgelöst, in serumfreiem Makrophagenmedium auf 12-wells verteilt und ü. N.

inkubiert. Am folgenden Tag erfolgte die Infektion mit MAP bzw. die Stimulation mit LPS (B.2.2.2) und nach weiteren 24 h Inkubation die Zellernte. Die Zellkulturplatten wurden auf Eis gestellt und die Zellen dreimal mit 1 ml kaltem PBS gewaschen, bevor sie mit je 100 µl passivem Lysepuffer pro 12-well abgenommen und lysiert wurden. Nach einem zweimaligen Einfrier-Auftau-Zyklus bei -70°C und RT wurde die relative Luciferaseaktivität in RLU (relative luciferase units) bestimmt.

B.2.2.6 Duales Luciferase System

Für die Bestimmung der relativen Luciferaseaktivität transfizierter Makrophagen wurde das Testsystem Dual-Luciferase^™ Reporter Assay System benutzt. Es erlaubt die Messung der Aktivität von sowohl der firefly als auch der renilla Luciferase in einer Probe. Zunächst wurden die Lysate mit Substratpuffer für die firefly Luciferase

versetzt, welche als Katalysator bei der ATP-abhängigen oxidativen Decarboxylierung von D-Luciferin zu Oxoluciferin unter Emission von Licht fungiert.

Durch Zugabe des Substratpuffers für die renilla Luciferase wird die Lumineszenz der firefly Luciferase gequencht, d. h. in ihrer Stärke gemindert, und zugleich die Reaktion der renilla Luciferase gestartet. Diese verwertet Coelenterazine und Sauerstoff zur Abspaltung von CO2 und Generierung von Lumineszenz.

Die Messungen von jeweils 20 µl Zelllysat erfolgten in 5 ml Polystyrolröhrchen am Luminometer (H.8) nach Angaben des Herstellers. Für einen internen Abgleich der als RLU angegebenen Messwerte, wurden die Werte der firefly Luciferase in Relation zu denen der renilla Luciferase und der Proteinkonzentration (B.2.9.1.2) der jeweiligen Probe gesetzt und mittels EXCEL graphisch dargestellt.