Quantitative Unterschiede im Sekretom infizierter RAW264.7 Makrophagen

Nahezu alle bisher durchgeführten und in der Literatur beschriebenen Analysen zur differentiellen Genregulation mit MAP oder MAA infizierten Makrophagen wurden auf Ebene der RNA gemacht. Die Interpretation der Genregulation war somit die Ebene der Transkription beschränkt. Modifikationen auf posttranskriptioneller Ebene, wie sie auch in Ergebnisteil 1 beschrieben sind, sowie auf translationaler Ebene konnten nicht erfasst werden. Zudem ließen sich anhand der Mikroarray- und RT-PCR-Analysen keine Aussagen zur Sekretion von Zytokinen und anderen sezernierten Proteinen der infizierten Zellen machen. Aus diesem Grund wurden die Kulturüberstände von Makrophagen nach einer Infektion mit MAP oder MAA auf die Expression verschiedener entzündungsrelevanter Proteine untersucht. Hierfür wurde wiederum eine Infektionszeit von 24 h gewählt. Dies war der erste Zeitpunkt bei dem Zur Lage et al. subspeziesspezifische Effekte infizierter J774A.1 Makrophagen auf CD4⁺-T-Lymphozyten nachweisen konnten. Zudem zeigten die oben ermittelten differentiell exprimierten Gene für IL-1α und IL-1β deutliche Unterschiede in der Genexpression nach 8 h bis 24 h (C.2.2.2). Die Kulturüberstände wurden wie beschrieben (B.2.10) mittels Zytokin-Antikörper-Arrays auf insgesamt 62 verschiedene inflammatorische und antiinflammatorische Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren untersucht. Dazu zählten z. B. IL-1α, IL-1β, TNF-α und G-CSF, deren RNAs aufgrund der Mikroarrayanalysen als differentiell exprimiert

gelten. Die folgenden Untersuchungen sollen zeigen, ob auch die Proteine differentiell exprimiert werden.

Es wurden zunächst die Membranen mit den capture-Antikörpern mit den Kulturüberständen inkubiert, gewaschen, mit Zytokin-spezifischen Biotin-markierten Antikörpern inkubiert, erneut gewaschen und schließlich mit HRP-markiertem Streptavidin inkubiert. Auf diese Weise ließen sich gleichzeitig verschiedene Zytokine in geringen Mengen nachweisen. Zudem waren quantitative Aussagen zwischen dem Kulturüberstand von MAP infizierten Makrophagen gegenüber MAA infizierten Makrophagen möglich. Dafür war es notwendig die Membranen bei der Immundetektion über unterschiedliche Zeiträume zu exponieren, bzw. es wurde auf eine CCD-Kamera zurückgegriffen. Bei dieser Detektionsmethode wurde die Exposition jeweils dann abgestoppt, wenn ein Signal die Sättigung erreicht hatte. Für reproduzierbare Aussagen wurden die Versuche mit unterschiedlichen Überständen wiederholt. Zudem sind die spezifischen capture-Antikörper auf den Membranen jeweils als Duplikate vorhanden. Prinzipiell können die resultierenden spots auch zur Konzentrationsbestimmung des jeweiligen Proteins genutzt werden.

An dieser Stelle besteht die Intention jedoch im Vergleich des Proteinexpressionsprofils der beiden Populationen. Dabei steht die Analyse der im Mikroarray als differentiell analysierte Gene im Vordergrund. In Abbildung 22 sind die Ergebnisse von jeweils einem repräsentativen Versuch mit dem RayBio^® Mouse Inflammation Antibody Array I / 1.1 als einzelne spots, sowie mit dem RayBio^® Mouse Cytokine Antibody Array III / 3.1 in der Übersicht dargestellt.

Die Gesamtdarstellung einer Membran (Cytokine Antibody Array III / 3.1) nach Inkubation mit dem Kulturüberstand von unbehandelten (K), MAP bzw. MAA infizierten RAW264.7 Makrophagen soll einen Einblick in die durchgeführte Methode geben. Zur eigentlichen Auswertung der Kulturüberstandanalysen von MAP oder MAA infizierten RAW264.7 Makrophagen wurden die nach unterschiedlichen Expositionszeiten detektierten Spotduplikate zusammengefasst, densitometrisch ausgewertet und das Verhältnis als Ratio von MAP zu MAA berechnet. Bei dem direkten Vergleich zwischen einer Infektion mit MAP und MAA wurde ein ähnliches Proteinexpressionsprofil detektiert. Proteine, die spezifisch im Kulturüberstand nach einer Infektion mit einer Subspezies vorliegen, konnten nicht nachgewiesen werden.

Jedoch waren in Übereinstimmung mit den Mikroarrays quantitative Unterschiede zu

als durch MAA. Dabei handelte es sich mit IL-1α, IL-6 und TNF-α um eine Gruppe inflammatorischer Mediatoren, sowie um die sezernierten TNF-Rezeptoren 1 und 2.

Die marginal schwächere Induktion von IL-1α und TNF-α durch eine Infektion mit MAP korrelierte mit den Genexpressionsuntersuchungen. Die Detektion der Transkripte für IL-1α lag ca. 2-fach und für TNF-α ca. 1,7-fach unter der durch MAA induzierten.

Desweiteren wurden chemotaktisch aktive Proteine nach einer MAP Infektion in verminderten Mengen sezerniert als nach einer Infektion mit MAA. Dazu gehörten MIP-1α, MIP-1γ und Eotaxin, wobei die Konzentrationen nach einer MAP Infektion im Vergleich zu einer MAA Infektion lediglich um einen Faktor von maximal zwei erniedrigt waren. Erstaunlicherweise wurde IL-1β vermehrt nach einer Infektion mit MAP sezerniert, obwohl die RNA stärker durch eine Infektion mit MAA induziert wurde (siehe C.2.1). Das inflammatorisch aktive Protein IL-1β war um einen Faktor von 2,5 stärker exprimiert, doch die Induktion der RNA durch MAP lag deutlich unter der Induktion mit MAA (2,6-fach, bzw. 9,5-fach). Hier scheinen subspezies-spezifische posttranskriptionelle oder translationale Modifikationen von Bedeutung zu sein. Weitere vier Proteine waren nach einer Infektion mit MAP in leicht höheren Konzentrationen nachweisbar als nach einer Infektion mit MAA. Dabei handelte es sich um eine heterogene Gruppe. Interleukin-4, welches bei vielen Zelltypen den MHCII aufreguliert, war um den Faktor 1,4 erhöht exprimiert, und ein G-CSF um den Faktor 1,3. LIX, ein Chemokin der C-X-C-Gruppe, wurde nach einer Infektion mit MAP oder MAA in etwa gleichen Mengen sezerniert.

Abbildung 22. Zytokinexpressionsprofil von MAP und MAA infizierten RAW264.7 Makrophagen.

Es wurden RAW264.7 Makrophagen mit MAP oder MAA infiziert oder als Kontrolle unbehandelt gelassen. Nach 24 h Inkubation wurden die Kulturüberstände abgenommen, nach Angaben des Herstellers mit den jeweiligen Membranen inkubiert und auf Röntgenfilmen exponiert. Links ist jeweils die gesamte, hybridisierte Membran eines Antibody-Arrays 3.1 nach der Autoradiographie abgebildet.

Im rechten Teil sind die spots ausgewählter Proteine einer Membran der Antibody-Array 1.1 mit Kulturüberständen MAP infizierter im Vergleich zu MAA infizierten RAW264.7 Makrophagen, sowie die densitometrisch ermittelten Signale, aufgeführt. Positive Ratios stellen die x-fach erhöhten Mengen nach einer Infektion mit MAP im Vergleich zu MAA dar, und negative die durch MAA erhöhten.

Zusammenfassend ergaben die Sekretomuntersuchungen in Übereinstimmung mit den oben beschriebenen Genexpressionsanalysen ein nahezu identisches Proteinexpressionprofil für MAP oder MAA infizierte RAW264.7 Makrophagen. Auch auf Proteinebene konnten lediglich quantitative Unterschiede für einige Zytokine nachgewiesen werden, wobei die Mehrheit der untersuchten Proteine nach einer MAA Infektion im Vergleich zu einer MAP Infektion in leicht erhöhten Konzentrationen sezerniert wurde. Dabei konnten in der Expressionsintensität maximal Unterschiede von 2-fach festgestellt werden. Lediglich IL-1β wurde durch

MAP 2,5-fach vermehrt sezerniert als durch MAA. Da auf Ebene der RNA eine erhöhte Genexpression von IL-1β durch MAA induziert wurde, muss es Regulationsmechanismen zwischen der Transkription der IL-1β-Proform, dem Transport der Proform zur Zellmembran und der Umwandlung zur reifen IL-1β-Form durch die ICE (IL-1β converting enzyme) und dem abschließenden Ausschleusen geben. Diese Mechanismen können als subspeziesspezifische Modulation infizierter RAW264.7 Makrophagen angesehen werden.

Zum einen konnten die ermittelten differentiell regulierten Gene exemplarisch für IL-1β und TNF-α bestätigt werden. Zum anderen zeigte die differentielle Proteinexpression am Beispiel IL-1β, wie wichtig es ist, verschiedene Ebenen der Genregulation zu untersuchen. Die Kernaussage eines sehr ähnlichen Expressionsprofils von RAW264.7 Makrophagen nach einer Infektion mit MAP und MAA konnte auf RNA- und Proteinebene nachgewiesen werden.

Subspeziesspezifische Unterschiede in der Modulation des Makrophagen konnten in differentiellen RNAs und Proteinen nachgewiesen werden.

Anhand des erstellten intrazellulären Gesamtüberblicks infizierter Makrophagen bis hin zum Sekretom am Beispiel entzündungsrelevanter Mediatoren ist es nun möglich, biologische Auswirkungen auf interzellulärer Ebene zu diskutieren und auch über den Einfluss auf nicht infizierte Zellen zu analysieren.

C.2.4 Infizierte Makrophagen induzieren eine subspeziesspezifische