Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Mechanismen der Mykobakterien-abhängigen Modulation von Makrophagen und deren
Auswirkungen auf Enterozyten
Dissertation
zur Erlangung des Grades Doktor der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat.
im Fachbereich Mikrobiologie
an der Tierärztlichen Hochschule Hannover
vorgelegt von Tina Basler
aus Peine
Hannover 2006
Hannover, Hannover)
Betreuungsgruppe: PD Dr. R. Goethe
Dr. S. Weiß (Institut für Molekulare Immunologie, GBF Braunschweig)
Prof. Dr. E. Toepfer-Petersen (Institut für Reproduktionsmedizin, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover)
Externer Gutachter: Prof. Dr. A. Haas (Institut für Zellbiologie, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn, Bonn)
Tag der mündlichen Prüfung: 08.06.2006
Die Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft im Rahmen des Sonderforschungsbereiches 621 „Pathobiologie der intestinalen Mukosa“ gefördert.
Basler, T., Jeckstadt, S., Valentin-Weigand, P., R. Goethe (2006)
Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium smegmatis and lipopolysaccharide induce different transcriptional and post-transcriptional regulation of the IRG1 gene in murine macrophages.
Journal of Leukocyte Biology 2006 Mar; 79(3):628-38
- Tagungsbeiträge
Basler, T., Valentin-Weigand, P., R. Goethe (2003)
Immune-responsive gene 1 (IRG1), a putative marker gene to distinguish LPS from mycobacterial signaling in macrophages.
55. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie, Dresden In: International Journal of Medical Microbiology 293, (Suppl. 36) (2003) 272
Basler, T., Geffers, R., Weiß, S.,Valentin-Weigand, P., R. Goethe (2004)
Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis induces a specific gene expression profile in J774 macrophages leading to specific interactions with enterocytes.
Joint Annual Meeting Immunology 2004 of the Dutch and German Societies of Immunology, Maastricht, Holland; In: Immunobiology 209 (2004) 392
Basler, T. und R. Goethe (2005)
IRG1 is differentially regulated at the transcriptional and posttranscriptional level in LPS stimulated and Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis infected murine macrophages.
36. Annual Meeting of the German Society for Immunology and the Scandinavian Society for Immunolgy, Kiel; In: Immunobiology 210 (2005) 395
their transcriptional and post-transcriptional regulation of the IRG1 gene in murine macrophages.
19th Meeting of the European Macrophage and Dendritic Cell Society 2005, Amsterdam, Holland
Basler, T. und R. Goethe (2006)
Differences in TNFalpha Gene Expression in Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium smegmatis and Lipopolysaccharide Stimulated Murine Macrophages Result from a Post-Transcriptional Regulation Mechanism.
106th General Meeting of the American Society of Microbiology, Orlando, USA
A.1 Die Paratuberkulose der Wiederkäuer ... 11
A.2 Eigenschaften der Gattung Mycobacterium... 13
A.2.1 Die Bedeutung von MAP ... 15
A.3 Monozyten und Makrophagen in der Wirtsabwehr ... 18
A.3.1 Ontogenese und Funktionen von Makrophagen ... 18
A.3.2 Die Aktivierung von Makrophagen... 19
A.3.3 Erkennung bakterieller Moduline über PAMPs... 20
A.3.4 Die Signalvermittlung im aktivierten Makrophagen ... 24
A.3.5 Mechanismen der Genregulation... 28
A.3.6 Übergreifende Modulation der Immunabwehr infizierter Makrophagen ... 30
A.4 Zielsetzung der Arbeit ... 32
B Material und Methoden ...33
B.1 Material ... 33
B.1.1 Chemikalien, Geräte und Verbrauchsmaterialien... 33
B.1.2 Lösungen und Puffer ... 33
B.1.3 Antikörper und Oligonukleotide... 33
B.1.4 Plasmide ... 34
B.1.5 Bakterien- und Zellkulturen... 34
B.2 Methoden ... 36
B.2.1 Anzucht von Bakterien... 36
B.2.2 Zellbiologische Arbeiten... 37
B.2.3 Molekulargenetische Arbeiten ... 42
B.2.4 Untersuchungen von RNA ... 48
B.2.5 Polymerasekettenreaktion ... 52
B.2.6 Bestimmung der Transkriptionsrate... 53
B.2.7 Mikroarray Genexpressionsanalyse ... 55
B.2.8 Sequenzanalysen ... 57
B.2.9 Proteinbiochemische Methoden ... 58
B.2.10 Antikörper-Array... 61
B.2.11 Densitometrische Auswertungen... 61
C Ergebnisse...63
C.1 MAP, MS und LPS induzieren eine differentielle Genregulation in murinen Makrophagen ... 63
C.1.3 Transkriptionelle Genregulation... 66
C.1.4 RAW264.7 Makrophagen zeigen nach einer Stimulation mit LPS eine erhöhte Stabilisierung der RNA für IRG1... 67
C.1.5 Genexpressionsvergleiche in RAW264.7 Makrophagen und primären Knochenmarksmakrophagen nach Stimulation mit LPS, MAP oder MS... 69
C.1.6 Die Genexpressionsintensität von IRG1 in infizierten RAW264.7 Makrophagen korreliert mit der Erregerdosis ... 70
C.1.7 Aktivierung des IRG1 Promotors in LPS stimulierten RAW264.7 Makrophagen ... 72
C.1.8 Erhöhte Stabilität der IRG1 RNA in MS infizierten RAW264.7 Makrophagen... 73
C.1.9 Die Funktion von p38 MAPK in der Stabilisierung der IRG1 RNA ... 77
C.1.10 Zusammenfassung Teil 1 ... 82
C.2 Spezifische Expressionsprofile Mycobacterium avium infizierter Makrophagen und ihre Auswirkungen auf Enterozyten ... 83
C.2.1 Quantitative Unterschiede im Transkriptom infizierter RAW264.7 Makrophagen ... 84
C.2.2 Bestätigung ausgewählter differentiell exprimierter Gene... 91
C.2.3 Quantitative Unterschiede im Sekretom infizierter RAW264.7 Makrophagen... 95
C.2.4 Infizierte Makrophagen induzieren eine subspeziesspezifische Genexpression in Enterozyten... 100
C.2.5 Zusammenfassung Teil 2 ... 108
D Diskussion...109
D.1 MAP, MS und LPS induzieren eine differentielle Genregulation von IRG1 und TNF-α in Makrophagen ... 110
D.2 Subspeziesspezifische Effekte von MAP und MAA in Makrophagen und die Interaktion mit Enterozyten ... 116
E Zusammenfassung ...128
F Summary...131
G Literaturverzeichnis ...133
H Anhang...155
H.1 Differentiell regulierte Gene in MAP versus MAA infizierten RAW264.7 Makrophagen ... 155
H.3.2 Stocklösungen ... 161
H.4 Kits ... 165
H.5 Antikörper und Oligonukleotide ... 166
H.5.1 Antikörper... 166
H.5.2 Oligonukleotide ... 167
H.6 Antikörper-Arrays ... 169
H.6.1 Legende zu den Antikörper-Arrays... 171
H.7 Vektorkarten... 172
H.8 Geräte ... 173
H.9 Abbildungsverzeichnis... 175
H.10 Tabellenverzeichnis... 177
% Prozent
® eingetragenes Warenzeichen
°C Grad Celsius
µ mikro, 10-6
A Ampere Abb. Abbildung abs. absolut ActD ActinomycinD
Ak Antikörper
AP-1 Activator protein-1
APS Ammoniumpersulfat
ATCC American Type Culture Collection, Mannassas, USA ATP Adenosintriphosphat
bp Basenpaare BSA Rinderserum Albumin
CD Cluster of differentiation
cDNA komplementäre DNA
Ci Curie
cpm Counts per minute
CHX Cycloheximid
CTP Cytidintriphosphat
ddH2O (zweifach destilliertes, deionisiertes) Wasser Da Dalton
DEPC Diethylpyrocarbonat
DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleinsäure
DNase Desoxyribonuklease
dNTP Desoxynukleosidtriphosphat
DSMZ Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
ELISA Enzyme linked immunoassay
ERK Extracellular signal-regulated kinase et al. et alii (und andere)
x g Erdbeschleunigung
GAPDH Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase G-CSF Granulocyte colony-stimulating factor
GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor GTP Guanosintriphosphat
h Stunde
HEPES 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazino]-Ethansulfonsäure HRP Horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase) ICE Interleukin-1β-converting enzyme
IFN-γ Interferonγ
IgG Immunglobulin G
IL Interleukin
IS900 Insertionselement 900
JNK c-Jun N-terminal kinase
LAM Lipoarabinomannan LB Luria-Bertoni
LPS Lipopolysaccharid, Endotoxin
m milli, 10-3
M Mol
MAP Mycobacterium avium paratuberculosis MAA Mycobacterium avium avium
min Minute MФ Makrophage mRNA messenger Ribonukleinsäure
MS Mycobacterium smegmatis
kb Kilobasenpaare
kDa Kilodalton
tmTNF/sTNF membranständiges / lösliches TNF NFκB Nuclear factorκB
PCR Polymerase chain reaction PBS Phosphat-gepufferte Saline PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease
rRNA Ribosomale Ribonukleinsäure
RT Raumtemperatur SDS Natriumdodecylsulfat
SSC Standard saline citrate
SS-DNA salmon sperm (Lachssperma) - Desoxyribonukleinsäure Tab. Tabelle
TBS(T) Tris-buffered saline (mit Tween) TEMED N,N,N’,N’,-Tetramethylethyldiamin
™ trademark; Warenzeichen
TLR Toll-like Rezeptor TNF Tumornekrosefaktor TNF-R1 (-2) TNF-Rezeptor-1 (-2)
tRNA Transfer-Ribonukleinsäure
u Enzymaktivitätseinheit (unit)
U Umdrehungen
ü. N. über Nacht
UTP Uraciltriphosphat
UV Ultraviolettes Licht
V Volt Vs versus
v/v Volumenprozent (volume per volume) w/v Gewichtsprozent (weight per volume) x Mal
A Einleitung
A.1 Die Paratuberkulose der Wiederkäuer
Die durch Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) hervorgerufene Paratuberkulose ist eine weltweit verbreitete Erkrankung der Wiederkäuer (MERKAL 1984). Betroffen sind Haus- und Wildwiederkäuer genauso wie Wiederkäuer zoologischer Gärten (CHIODINI u. VAN KRUININGEN 1983). Es wurden auch Infektionen mit MAP bei Hunden, Wildkaninchen und Schweinen nachgewiesen (GREIG et al. 1997; THOEN et al. 1975; VOGEL 1977). Monogastrische Tiere erkranken jedoch nicht an der Paratuberkulose, obwohl sie mit MAP infiziert werden können. Die Paratuberkulose von Rindern führt zu enormen Produktionseinbußen in der milch- und fleischproduzierenden Industrie und wurde von Collins als eine der bedeutendsten und kostenintensivsten Krankheiten der Milchrinder bezeichnet (COLLINS 1994). Ob MAP auch für den Menschen eine Gefahr darstellt, ist noch sehr umstritten. Nach der Isolierung von MAP aus Darmbereichen an Morbus Crohn erkrankten Menschen wird ein Zusammenhang von MAP und der Entstehung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen beim Menschen diskutiert (GREENSTEIN 2003).
Bei Wiederkäuern ist die genaue Pathogenese der Paratuberkulose noch weitgehend ungeklärt. Die meisten der nachfolgend erläuterten Charakteristika wurden beim Rind erforscht. Die häufigsten Infektionswege stellen orale Infektionen durch Haltung der Tiere auf MAP-kontaminierten Weiden und das Saugen von Jungkälbern an kotverschmierten Zitzen dar (CLARKE 1997; COCITO et al. 1994). Ebenso konnten vitale Erreger aus Reproduktionsorganen isoliert werden, aber auch intrauterine Infektionen wurden beschrieben und spielen vor allem bei Foeten klinisch erkrankter Kühe eine bedeutsame Rolle (GERLACH u. VALENTIN-WEIGAND 1998; KREEGER 1991; SEITZ et al. 1989; SWEENEY et al. 1992b). Symptomatisch unterscheidet man drei klinische Stadien. Im ersten, subklinischen Stadium zeigen die Tiere keinerlei Symptome und scheiden den Erreger nicht aus. Im nächsten Stadium wird der Erreger intermittierend mit dem Kot und der Milch ausgeschieden (SWEENEY et al. 1992a). Klinische Symptome sind nur bei einer sehr kleinen Anzahl von Tieren zu beobachten (LEPPER et al. 1989). Im Bereich der Mukosa kommt es jedoch zu einer kontinuierlichen Ausbreitung von MAP. Erst in der dritten, exkretorischen Phase
zeigen sich klinische Symptome wie nicht therapierbare wässrige Durchfälle, diffuse Ödeme, Anämien und auch Infertilität. Bei ungestörtem Allgemeinbefinden und anhaltender Fresslust kommt es zur fortschreitenden Abmagerung bis zur völligen Auszehrung sowie zu einer drastischen Reduktion der Milchleistung. Die Tiere sterben schließlich in einem katarrhalischen Stadium (COCITO et al. 1994). Dabei sind die Pathomechanismen weitgehend ungeklärt.
Die Infektion erfolgt meist in den ersten sechs Lebensmonaten. Spätere Infektionen sind selten und über zwei Jahre alte Rinder gelten als resistent gegenüber einer Infektion (LARSEN et al. 1975). In Bezug auf die Mechanismen der Infektion gilt die Translokation von MAP aus dem intestinalen Lumen durch die Mukosa mit der Aufnahme über M-Zellen und Persistenz in subepithelialen Makrophagen als gesichert (SIGURETHARDOTTIR et al. 2004). Die Aufnahme von MAP über M-Zellen im Epithel der Peyerschen Platten sowie die anschließende Internalisierung durch sub- und intraepitheliale Makrophagen wurde erstmals von Momotani et al.
(1988) nachgewiesen. Bei adulten Tieren hat sich die Lage der Peyerschen Platten im Darmbereich im Vergleich zu den Jungtieren verschoben und in vorderen Abschnitten liegen damit relativ gesehen weniger M-Zellen vor, wodurch vermutlich weniger Mykobakterien ins Epithel gelangen und die geringere Infektionsanfälligkeit von Rindern mit zunehmendem Alter erklärt werden könnte (SIGURETHARDOTTIR et al. 2004). Das intrazelluläre Bakterienwachstum führt schließlich zum Absterben der Makrophagen und zur Freisetzung der Erreger, die entweder ausgeschieden oder erneut phagozytiert werden. Die Infektion breitet sich dabei im Dünndarm aus und äußert sich in immer größer werdenden Läsionen der Darmschleimhaut (CHACON et al. 2004; CLARKE 1997). Durch die im Vergleich zu anderen mykobakteriellen Infektionen deutlich verminderte Produktion von TNF-α (Tumornekrosefaktor-α) und dem Verlust der CD4+ (cluster of differentiation) T-Zellantwort unterbleibt die Bildung herdförmiger Granulome und es kommt zu einer diffusen granulomatösen Entzündung (CLARKE 1997; COUSSENS 2004; LUGTON 1999). Betroffen sind vor allem das distale Jejunum, das Ileum, die Ileocaecalklappe sowie die mesenterialen Lymphknoten (CLARKE 1997; SIGURETHARDOTTIR et al.
2004). Damit zeigt das Krankheitsbild viele Gemeinsamkeiten mit Darmveränderungen von Patienten mit Morbus Crohn (CHACON et al. 2004;
GREENSTEIN 2003). Sowohl die Lokalisation des Erregers, der ausgesprochene
durch Mycobacterium avium avium (MAA) hervorgerufenen Geflügeltuberkulose abzugrenzen.
In der Etablierung und Aufrechterhaltung der Infektion wird dem Makrophagen eine entscheidende Rolle zugewiesen. MAP invadiert und persistiert in Makrophagen und ist in der Lage die eigentliche Effektorfunktion der Zelle zu seinen Gunsten zu modulieren. Dies zeigt sich vor allem in der oben angesprochenen verminderten Sekretion von TNF-α und anderen Mediatoren (COUSSENS 2004). Darüber hinaus bewirkt die Infektion nicht vorstimulierter Makrophagen mit Mykobakterien eine Refrakterität gegenüber IFN-γ (Interferonγ), wodurch die T-Zellantwort unterbleibt (HUSSAIN et al. 1999).
A.2 Eigenschaften der Gattung Mycobacterium
In der Gattung Mycobacterium sind aerobe, säurefeste, schlanke Stäbchen, die zu den Actinomyzeten gehören aber normalerweise keine Lufthyphen bilden und nicht sporulieren vereint. Sie bilden die einzige Gattung innerhalb der Familie der Mycobacteriaceae und weisen als Charakteristika eine Unbeweglichkeit und die Resistenz gegenüber salzsaurem Alkohol nach einer Färbung mit Phenol-Fuchsin auf. Mit dieser Ziehl-Neelsen Färbung (COCITO u. DELVILLE 1985) lassen sie sich von den meisten anderen Bakterien eindeutig abgrenzen. Die Eigenschaft liegt begründet in dem hohen Gehalt an Wachsen in ihrer Zellwand und der damit einhergehenden hohen Festigkeit gegenüber Säuren und Basen (BARRY, III 2001).
Die Mehrheit der über 50 Arten der Gattung Mycobacterium sind nicht pathogene, in der Natur verbreitete saprophytäre Arten, wie z. B. Mycobacterium (M.) smegmatis und M. phlei, die in ihren Habitatansprüchen den nahe verwandten Bodenbakterien Streptomyces und Actinomyces ähneln (COSMA et al. 2003). Darüberhinaus gibt es einige wenige pathogene Spezies, wie M. tuberculosis, M. leprae, M. ulcerans, M.
avium avium (MAA) und M. avium paratuberculosis (MAP), die Erreger der Tuberkulose, Lepra, Ulzera, Geflügeltuberkulose und Paratuberkulose. Anhand ihres Wachstumsverhaltens werden Mykobakterien in typische und nicht-typische Mykobakterien unterteilt. Zu den atypischen, welche relativ schnell wachsen, zählen die Saprophyten. Typische Mykobakterien hingegen weisen ein extrem langsames Wachstum auf. Zu dieser Gruppe gehören opportunistische und obligate Pathogene.
Die Gruppe umfasst die nicht tuberkulösen Mykobakterien und den M. tuberculosis
Komplex. Der letztere enthält die nahe verwandten M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. canettii und M. microti (>99% Übereinstimmung auf Nukleotidebene einiger Loci) (COSMA et al. 2003). Trotzdem unterscheiden sich diese Mykobakterien in ihrer Morphologie, ihrer Biochemie, ihrem Wirtsspektrum und dem hervorgerufenen Krankheitsbild in verschiedenen Tiermodellen (BROSCH et al.
2002). M. tuberculosis verursacht weltweit jährlich nahezu 3 Millionen Todesfälle (DYE et al. 1999). In einigen Teilen Afrikas werden weitaus mehr Tuberkulosefälle durch M. africanum als durch M. tuberculosis hervorgerufen (NIEMANN et al. 2002).
Infektionen mit M. carnettii sind sehr selten (COSMA et al. 2003). Im Gegensatz zum humanpathogenen M. tuberculosis ist für M. bovis ein breites Wirtsspektrum beschrieben. M. bovis ruft in verschiedenen Säugetieren Tuberkulose hervor, darunter z. B. Mensch und Rind, und war vor der Beschreibung der Pasteurisierung von Milch der häufigste Erreger der Tuberkulose beim Menschen (COSMA et al.
2003).
In der mykobakteriellen Zellwand finden sich mit LAM (Lipoarabinomannan) sowie seine Vorstufen LM (Lipomannan) und PIM (Phosphatidylinositolmannosid) charakteristische Lipidkomponenten wieder, die sowohl in der Physiologie der Bakterien als auch in der Modulation der Wirtszellen während der Infektion eine entscheidende Rolle spielen (BRIKEN et al. 2004; ZHANG et al. 1994). LAM, LM und PIM sind Lipoglykane und auf nicht-kovalente Weise über einen Phosphatidylmyoinositolanker in der Plasmamembran verankert und erstrecken sich bis in das Äußerste der Zellwand (BESRA et al. 1997; NIGOU et al. 2003). LAM ist nicht nur der zentrale Ligand in der Interaktion zwischen M. tuberculosis, Makrophagen und Dendrischen Zellen (MAEDA et al. 2003; SCHLESINGER et al.
1994), sondern gilt auch als wichtiger Modulator der Immunantwort im Verlauf der Tuberkulose und Lepra (CHATTERJEE u. KHOO 1998; NIGOU et al. 2002).
Die pathogenen Mykobakterien sind typische fakultativ intrazelluläre Bakterien (BRIKEN et al. 2004). Sie werden nach der Phagozytose von den Makrophagen nicht abgetötet, sondern persistieren in frühen Phagosomen und können die Immunreaktion des Wirtes umdirigieren (FLYNN u. CHAN 2001). An der Endozytose von M. tuberculosis und MAA sind Komplement-, scavenger- und Mannose- rezeptoren beteiligt (VAN CREVEL et al. 2002), welche entweder nicht-opsonisierte Mykobakterien binden oder Opsonine auf mykobakteriellen Oberflächen erkennen.
konnte in Abwesenheit von C3 eine um 70% reduzierte Phagozytoserate nachgewiesen werden (SCHLESINGER 1993).
Für M. tuberculosis und MAA liegen relativ gute Kenntnisse über Mechanismen des intrazellulären Überlebens und die Antwort der Makrophagen auf eine Infektion vor.
M. tuberculosis besitzt die Fähigkeit die Reifung des mykobakteriellen Phagosoms zum Phagolysosom zu blockieren (CLEMENS u. HORWITZ 1995) und die Ansäuerung zu unterbinden (STURGILL-KOSZYCKI et al. 1994). Phagosomen mit M. tuberculosis wurden aufgrund der früh-endozytischen kleinen GTP-asen Rab5 und Rab11, dem Transferrin-Rezeptor und dem Fehlen der V-ATPase als frühe Phagosomen beschrieben (RUSSELL 2001). Fusionsergeignisse der mykobakteriellen Phagosomen mit endosomalen Kompartimenten gemäß der von Desjardins aufgestellten kiss and run Hypothese (DESJARDINS 1995) werden unterbunden. Als Mechanismus wird die durch vitale M. tuberculosis aktiv vermittelte Hemmung des Ca2+-Anstiegs im infizierten Makrophagen diskutiert, sowie eine M. tuberculosis vermittelte Enzymhemmung der sphingosine kinase und dem damit einhergehenden Verlust des Ca2+/CaM/CaMKII-Signalkomplexes in der Membran mykobakterieller Phagosomen (KUSNER 2005; MALIK et al. 2001; MALIK et al.
2003). Die nahezu komplett unterbundene Phagosomenansäuerung liegt begründet in der fehlenden H+-pumpenden V-ATPase. Sturgill-Koszycki et al. konnten für M. tuberculosis bereits 1994 den Nachweis der fehlenden V-ATPase im mykobakteriellen Phagosom bei stark verminderter Ansäuerung zeigen (STURGILL- KOSZYCKI et al. 1994). Für die erfolgreiche Hemmung der Reifung mykobakterieller Phagosomen in Makrophagen wurde für MAA mit einer Abhängigkeit von Cholesterol nachgewiesen (DE CHASTELLIER u. THILO 2006). Vergleichende Infektionsstudien mit MAP liegen bislang nicht vor.
A.2.1 Die Bedeutung von MAP
Zu den nicht-tuberkulösen Mykobakterien gehören M. leprae, der Erreger der Lepra beim Menschen, M. marinum, M. ulcerans und der sogenannte M. avium Komplex (MAC). Der MAC umfasst mit M. avium intrazellulare, Mycobacterium avium avium (MAA), M. avium paratuberculosis (MAP), M. avium hominissuis, und M. avium silvaticum sind in der Umwelt relativ weit verbreitete Mykobakterien (CANGELOSI et al. 2001; INDERLIED et al. 1993).
Die Subspezies M. hominissuis ist ein häufiger Erreger von Mykobakteriosen bei Mensch und Schwein und wurde 2002 erstmals von Mijs et al. taxonomisch abgegrenzt (MIJS et al. 2002; TURENNE et al. 2006). Kürzlich durchgeführte Sequenzanalysen von MAC-Isolaten bestätigten diese neue Subspeziesunterteilung (TURENNE et al. 2006).
M. intrazellulare und MAA sind Verursacher von Mykoakteriosen bei immunsupprimierten Menschen und M. silvaticum verursacht tuberkuloseartige Erkrankungen bei Vögeln (LEGRAND et al. 2000). MAA ist einer der wichtigsten opportunistischen Infektionserreger bei HIV-Patienten (HORSBURGH, JR. 1991) und ebenso der Erreger der Geflügeltuberkulose (TELL et al. 2001). Ein weiterer veterinärmedizinisch relevanter Krankheitserreger ist die Subspezies MAP als Verursacher der Paratuberkulose bei Wiederkäuern (COCITO et al. 1994). Die genetische Differenzierung der Subspezies MAP erfolgt über den Nachweis von Insertionselementen (IS), wie z. B. IS900 bei gleichzeitiger Abwesenheit von IS901 und IS902 (VARY et al. 1990). Desweiteren ist für MAP eine unter den Subspezies einmalige Wachstumsabhängigkeit von dem Zellwand-assoziierten Siderophor Mycobactin beschrieben (BARCLAY et al. 1985). Im Gegensatz zu MAA ist für MAP ein sehr langsames Wachstumsverhalten charakteristisch. Die Verdopplungszeit beträgt etwa 24 h im Gegensatz zu 10 bis 12 h für MAA (HARRIS u. BARLETTA 2001). Zur Charakterisierung von MAA wird das Insertionselement IS1613 herangezogen (LEGRAND et al. 2000). Darüber hinaus konnten für die MAC Subspezies die oben angeführten unterschiedlichen Wirtsspezifitäten nachgewiesen werden, was ihre Differenzierung trotz der hohen genetischen Ähnlichkeit begründet (FALKINHAM, III 1996). In Bezug auf die gesamte Genomgröße haben MAP (4,83 Mbp) und MAA (5,48 Mbp) (CHACON et al. 2004) eine Ähnlichkeit von 97% und die Gensequenz der 16S rRNA weist sogar eine nahezu 100%-ige Übereinstimmung auf (BANNANTINE et al. 2003; LI et al. 2005). Kürzlich wurde von Turenne et al. eine weitere subspeziesspezifische Differenzierungsmöglichkeit für diagnostische Zwecke über die Sequenzierung des hsp65 (heat shock protein) vorgestellt (TURENNE et al. 2006).
Auch im Hinblick auf das Infektionsgeschehen konnten Übereinstimmungen nachgewiesen werden. Nach der Überwindung der intestinalen Barriere über die M-Zellen des Epithels im Bereich der Peyerschen Platten werden die Erreger von
2004). Hier persistiert MAP vorwiegend im Darm. Interessanterweise invadiert MAA vorwiegend Enterozyten und es kommt zu einer systemischen Ausbreitung. Darüber hinaus ist MAA für Rinder nur gering pathogen. Sie entwickeln eine effektive Immunantwort, die zur Bildung von verkäsenden Granulomen und Erregereliminierung führt (DE LISLE et al. 1998). Für MAA konnte gezeigt werden, dass LAM spezifisch mit dem Mannoserezeptor und CD14 auf Makrophagen interagiert und die Phagozytose fördert (STROHMEIER u. FENTON 1999). Beide Erreger besitzen die Fähigkeit in frühen Phagosomen zu persistieren. In einer Studie an J774A.1 Makrophagen konnten vitale MAP und MAA intrazellulär bis zu 15 Tage nachgewiesen werden, während nicht pathogene Mykobakterien innerhalb von 24 h abgetötet waren (KUEHNEL et al. 2001). Von M. tuberculosis und MAA ist bekannt, dass mykobakterielle Komponenten, wie LAM oder Sulfatide die Phagosomen- membranbestandteile so modifizieren können, dass die Lysosomen-Phagosomen- Fusion unterbunden wird (Clemens et al., 1995). Es konnte aber eine Störung der Phagosomenreifung in J774A.1 Makrophagen auch für MAP nachgewiesen werden (KUEHNEL et al. 2001). Zudem wurden in diesen Infektionsstudien an J774A.1 Makrophagen mit der gezeigten Induktion von Zytokinen wie IL-1, IL-6 und TNF-α das gleiche Zytokinexpressionsmuster wie bei einer Infektion von J774A.1 Makrophagen mit MAA nachgewiesen werden (Chan et al., 1994; Clarke, 1997). Dies zeigte, dass beide Subspezies J774A.1 Makrophagen auf die gleiche Weise stimulieren können.
Von der Tuberkulose ist bekannt, dass die Kontrolle der Infektion vor allem von CD4+-T-Lymphozyten abhängig ist, denn die von ihnen synthetisierten Mediatoren IFN-γ und IL-2 induzieren die Aktivierung der Makrophagen. Eine gesteigerte antimykobakterielle Aktivität konnte bei der Tuberkulose durch die synergistische Wirkung von TNF-α und IFN-γ nachgewiesen werden. IFN-γ spielt auch eine entscheidende Rolle in der Kontrolle von Infektionen mit MAA (FLORIDO et al.
1999). Ob dieser Effekt auch bei Makrophagen eintritt, die mit MAP infiziert sind, ist nicht geklärt. Die CD4+-T-Lymphozyten sind für die Immunantwort aber ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Möglicherweise spielen bei infizierten Rindern auch die γδ+-T-Lymphozyten eine Rolle, die bei Jungtieren einen großen Anteil der T-Lymphozyten ausmachen (COUSSENS 2001).
Obwohl die Invasion und Persistenz der beiden Subspezies MAA und MAP in Wirtszellen die erläuterten Gemeinsamkeiten aufzeigen, unterscheiden sie sich in
ihren Pathogenitätsmechanismen. Für MAP ist ein ausgeprägter Darmtropismus beschrieben und im Gegensatz zu MAA, für den ausgehend vom Darm eine hämatogene Generalisation beschrieben ist, konnte MAP vor allem in der intestinalen Mukosa nachgewiesen werden (Harris & Barletta, 2001). Interessanterweise hemmt MAP die Stimulierung der CD4+-T-Lymphozyten während die immunologische Antwort auf eine Infektion mit MAA eine deutliche Aktivierung der CD4+-T-Lymphozyten beinhaltete (ZUR et al. 2003). Die molekularen Mechanismen der Deaktivierung von CD4+-T-Lymphozyten in J774A.1 Makrophagen nach einer Infektion mit MAP sind allerdings weitgehend ungeklärt. Da die Expression der kostimulatorischen Oberflächenmoleküle unbeeinflusst blieb, ist es denkbar, dass MAP in J774A.1 Makrophagen die Expression bisher unbekannter Faktoren induziert, welche mit essentiellen Kostimulatoren interferieren. Ein direkter Vergleich der Genexpression von infizierten Makrophagen bietet die Möglichkeit Unterschiede in der Modulation der J774A.1 Makrophagen zu ermitteln und eventuell differentiell regulierte Gene zu detektieren, die spezifisch bei Makrophagen nach einer Infektion mit MAA oder MAP exprimiert werden.
A.3 Monozyten und Makrophagen in der Wirtsabwehr
A.3.1 Ontogenese und Funktionen von Makrophagen
Ausgehend von pluripotenten Stammzellen im Knochenmark entstehen die myeloische und die lymphatische Stammzellreihe mit ihren Vorläuferzellen. Aus lymphatischen Vorläufern gehen T- und B-Lymphozyten und NK (natural killer)-Zellen hervor. Aus myeloischen Vorläuferzellen differenzieren sich Erythrozyten, Thrombozyten, Granulozyten und mononukleäre Phagozyten (JANEWAY 1999).
Dendritische Zellen (DCs) können sich sowohl aus myeloischen als auch aus lymphatischen Vorläufern zu plasmazytoiden, interstitialen oder Langerhans DCs entwickeln (LIU 2001). Die Differenzierung von myeloischen Vorläufern zum Monoblasten und weiter zum Monozyten wird durch IL-3, GM-SCF und M-CSF (ganulocyte/macrophage colony stimulating factor) gesteuert. Monozyten zirkulieren ein bis drei Tage im Blut bevor sie an das Endothel der Gefäße adhärieren und in das Gewebe einwandern, wo sie unter dem Einfluß verschiedener Zytokine und
weiterer Anteil der Monozyten differenziert zu DCs und wandert nach der Phagozytose von Antigenen in Lymphknoten ein (RANDOLPH et al. 1998).
Makrophagen werden aufgrund der Expression spezifischer Oberflächenmoleküle charakterisiert. Während der Reifung, die durch Stimuli wie LPS initiiert werden kann, kommt es zur Expressionsverstärkung spezifischer kostimulatorischer Oberflächen- moleküle wie CD80 oder CD86. Neben der Antigenpräsentation liegt eine wesentliche Funktion der Makrophagen in der Phagozytose. Nach einer Antigenerkennung, vermittelt durch eine Vielzahl verschiedener Rezeptoren (Mannose-, scavenger-, Komplemen-trezeptoren, Dectin 1), werden Pathogene im Phagosom über einen kiss and run mit hydrolytischen Enzymen aus Lysosomen konfrontiert und degradiert. Zu den weiteren biologischen Funktionen mononukleärer Phagozyten zählen Zytotoxizität gegenüber entarteten Zellen und die Sekretion biologisch aktiver Mediatoren. Makrophagen sezernieren auch im nicht aktivierten Zustand verschiedene Zytokine, wie IL-1α/β, TNF-α, IFNα/β, GM-SCF, M-CSF und G-CSF sowie Enzyme, reaktive Sauerstoffintermediate und extrazelluläre Matrixproteine. Durch eine Aktivierung wird die Expressionsintensität in Abhängigkeit des Antigens verstärkt oder vermindert (ADEREM u. UNDERHILL 1999; NATHAN u.
SHILOH 2000).
A.3.2 Die Aktivierung von Makrophagen
Sobald Krankheitserreger eine Epithelbarriere überwinden, werden sie von Phagozyten erkannt und mit Hilfe von Gewebemakrophagen, neutrophilen Granulozyten, antimikrobiellen Peptiden und Komplementsystem bekämpft (ADEREM u. UNDERHILL 1999). Desweiteren kommt es zur Aktivierung der Phagozyten und zur Sekretion von inflammatorischen Mediatoren und Zytokinen. Die Antigenpräsentation mittels Haupthistokompatibilitätskomplexproteinen (major histocompatibility complex; MHC) und die gleichzeitige Expression kostimulatorischer Oberflächenmoleküle bewirken die Aktivierung und die klonale Proliferation der zum jeweiligen Antigen passenden naiven CD4+-T-Lymphozyten, die für die Aktivierung von B-Lymphozyten, CD8+-T-Lymphozyten und weiterer Makrophagen benötigt werden (JANEWAY 1999). Damit besitzen die Makrophagen als professionelle Phagozyten sowohl in der angeborenen als auch in der erworbenen Immunität eine bedeutsame Funktion in der Erregerbekämpfung.
Im folgenden sind von Makrophagen exprimierte Rezeptoren, ihre jeweiligen bakteriellen Liganden und die induzierten Signaltransduktionskaskaden mit Schwerpunkt auf mykobakterielle Antigene als Modulatoren beschrieben.
A.3.3 Erkennung bakterieller Moduline über PAMPs
Makrophagen reagieren auf die große Vielfalt von Fremdantigenen in unterschiedlicher Weise. Für die Phagozytose und Abtötung pathogener Bakterien ist eine Aktivierung der Makrophagen erforderlich, wobei die Agonisten, die eine Erhöhung der funktionalen Fähigkeiten von Makrophagen bewirken, eine große, komplexe Molekülgruppe darstellen (REINER 1994). Ein wichtiger Mechanismus der angeborenen Immunität besteht darin, nicht jedes mögliche Antigen als „fremd“
einzustufen, sondern bestimmte, in der Evolution hoch konservierte Strukturen, zu erkennen (MEDZHITOV u. JANEWAY, JR. 2000). Diese Strukturen werden als
„pathogen-associated molecular patterns“ (PAMPs) deklariert und umfassen biochemisch und strukturell ganz unterschiedliche Moleküle wie LPS, Flagellin, Peptidoglykane, Lipoteichonsäuren, Mannane, Glykane, doppelsträngige RNA und bakterielle DNA (ADEREM u. ULEVITCH 2000; JANEWAY, JR. u. MEDZHITOV 1999). Ihre Gemeinsamkeiten bestehen darin, dass sie ausschließlich von Mikroorganismen gebildet werden, essentiell für die Pathogenität oder das Überleben im Wirt sind und bei einer Vielzahl verschiedener Pathogene vorkommen (HOFFMANN et al. 1999; MEDZHITOV u. JANEWAY, JR. 2000). Aufgrund ihrer Fähigkeit die Aktivität von Makrophagen zu beeinflussen, können diese bakteriellen Antigene auch als Moduline bezeichnet werden, und damit von anderen Virulenzfaktoren wie Adhäsinen oder Invasinen abgegrenzt werden (HENDERSON et al. 1996).
Zu den von gramnegativen Bakterien bekannten Modulinen und Aktivatoren von Makrophagen gehören die als „outer membrane proteins“ bezeichneten Proteine und das Lipopolysaccharid (LPS) der äußeren Zellwand. Bei LPS, handelt es sich um ein amphiphiles Molekül, dessen Struktur in die drei seperaten Teile Lipid A, Kernregion und O-spezifische Seitenkette untergliedert ist (RAETZ u. WHITFIELD 2002). LPS bindet das LBP (LPS binding protein) und der daraus resultierende Komplex (LPS-LBP) assoziiert mit dem Oberflächenmolekül CD14 auf
Signalwege aktiviert. Aktuellere Studien über die von LPS ausgelöste Genexpression in murinen Makrophagen zeigten, dass Lipid A eine Aktivierung von TLR4 (Toll-like Rezeptor 4) auslöst (LIEN u. INGALLS 2002; MEANS et al. 1999). Die Erkennung von LPS wird durch weitere Moleküle vermittelt und die Signaltransduktion dadurch verstärkt. Das sezernierte Protein MD-2 assoziiert mit der extrazellulären TLR4- Domäne und vermittelt eine verstärkte LPS vermittelte Makrophagenaktivierung (SHIMAZU et al. 1999). Ein ähnlicher „Verstärker“ wurde für B-Lymphozyten nachgewiesen. Ogata et al. (2000) zeigten über die Assoziation von TLR4 mit MD-1, welches eine hohe Homologie zu MD-2 aufweist, und dem Protein RP105 einen funktionellen Zusammenhang der LPS-Erkennung und –Vermittlung über TLR4 auf B-Lymphozyten (OGATA et al. 2000). Dies soll verdeutlichen, dass PAMPs ihren modulatorischen Einfluss auf verschiedene Zelltypen ausüben können. In ihrer Erkennung sind vor allem TLRs von Bedeutung, auf die im unteren Abschnitt mit dem Schwerpunkt mykobakterieller PAMPs gesondert eingegangen wird.
Die Zellwand von Mykobakterien, die phylogenetisch zu den grampositiven Bakterien zählen ist besonders lipidreich und viele der Mykolsäuren und Mykoside werden als Virulenzfaktoren eingestuft, da sie eine hohe immunmodulatorische und anti- inflammatorische Aktivität besitzen (BRENNAN 2003). Bereits 1994 konnten Zhang et al. über eine Stimulation humaner Monozyten mit den mykobakteriellen Zellwandkomponenten LM und PIM zur Sekretion von TNF-α und IL-8 nachweisen.
Ein weiteres mykobakterielles Modulin ist LAM, ein Glykolipid mit immunregulatorischen und anti-inflammatorischen Eigenschaften, die das Überleben der Mykobakterien innerhalb des Makrophagen begünstigen (HENDERSON et al.
1996). LAM stellt als eine verzweigte Form von Phosphtidylinositolmannosid den Hauptbestandteil der mykobakteriellen Zellwand dar und wird in Mannose-capped (ManLAM) und Arabinofuranosyl-terminierte (AraLAM) LAMs unterteilt. Beide Formen bestehen aus dem Homopolysaccharid D-Mannan und dem daran gebundenen Homopolysaccharid D-Arabinan. In Abhängigkeit der vorhandenen Mannose-caps oder terminalen Inositolphosphatgruppen konnten in vivo deutliche Unterschiede in der Stimulierung von Makrophagen nachgewiesen werden (STROHMEIER u. FENTON 1999). ManLAM findet sich vor allem bei pathogenen Mykobakterien, während AraLAM die Zellwand nicht pathogener Mykobakterien kennzeichnet (VERCELLONE et al. 1998). ManLAM besitzt die Fähigkeit humane Monozyten zur Synthese von TNF-α zu stimulieren, und Zhang et al. (1994) zeigten,
dass ManLAM von M. tuberculosis genauso wie LPS gramnegativer Bakterien humane Monozyten über Signalwege mit NFκB (nuclear factor κB) und NFIL6 zur Expression von IL-6 aktivierten, einem an der T-Zell-Aktivierung beteiligten Zytokin (ZHANG et al. 1994). Folgende Studien wiesen für AraLAM avirulenter Mykobakterien eine signifikant stärkere Induktion der Zytokinproduktion, ermittelt am Beispiel TNF-α, nach (STROHMEIER u. FENTON 1999). Desweiteren konnten Krutzik et al. (2003) eine TLR2-abhängige Erkennung mykobakterieller Moduline nachweisen und Takeuchi et al. (2002) ebenso eine Aktivierung über TLR2 in Assoziation mit TLR1 und TLR6 (KRUTZIK et al. 2003; TAKEUCHI et al. 2002).
Toll-like Rezeptoren stellen eine strukturell konservierte Familie von Membranrezeptoren mit einer hohen Homologie zum Toll-System von Drosophila melanogaster dar (MEDZHITOV et al. 1997). Eine enorme Vielfalt mikrobieller Produkte kann von TLRs erkannt werden und die Zelle aktivieren, was schließlich zur Transkription spezifischer Gene führt, die in der Regulation der adaptiven Immunantwort beteiligt sind (TAKEDA et al. 2003). Der Nachweis der Expression von TLR mRNAs erfolgte für unterschiedliche Gewebe mit einer besonders großen Bandbreite der bisher 13 beschriebenen TLR-Mitglieder in professionellen Phagozyten. Mykobakterielle Komponenten werden von TLR2 alleine oder in Assoziation mit TLR1 und TLR6 erkannt (KRUTZIK u. MODLIN 2004; SELVARAJOO 2006; STENGER u. MODLIN 2002).
Die Familie der TLRs gehört zu einer großen Gruppe Rezeptoren der angeborenen Immunität, den sogenannten mustererkennenden Rezeptoren („pattern-recognition receptors“; PRRs). Da diese Rezeptoren von verschiedenen antigenpräsentierenden Zellen wie Makrophagen, Dendritischen Zellen, B-Lymphozyten, aber auch von Epithelzellen mit einer einheitlichen Spezifität exprimiert werden, können Pathogene von einer enormen Vielzahl verschiedener Effektorzellen erkannt werden. Funktionell können die PRRs in sezernierte, endozytierende und signaltransferierende Rezeptoren unterteilt werden (MEDZHITOV u. JANEWAY, JR. 2000). Nucleotide- oligomerisation domain (NOD)-Proteine sind aufgrund ihrer leucin-rich repeats nahe mit den TLRs verwandt, an der intrazellulären Erkennung pathogener Liganden wie Peptidoglykanen oder Muramyldipeptiden beteiligt (INOHARA u. NUNEZ 2003) und aktivieren caspase- und NFκB-Signalwege. Das NOD2-Protein wird in hohem Maße von Monozyten exprimiert, kann aber auch mittels IFN-γ und TNF-α in intestinalen
Protein in der Prädisposition von Morbus Crohn involviert (GIRARDIN et al. 2003) und wurde vermehrt in entzündetem Colon von Patienten mit Morbus Crohn nachgewiesen. Auch MAP wurde mit Morbus Crohn in Zusammenhang gebracht (GREENSTEIN 2003). Inwieweit das Bakterium am Krankheitsgeschehen beteiligt ist bleibt jedoch zu untersuchen.
Die sezernierten PRRs wirken als Opsonine und binden an mikrobielle Zellwände und markieren sie zur weiteren Erkennung durch das Komplementsystem und durch Phagozyten (EPSTEIN et al. 1996). Endozytierende PRRs kommen vor allem auf Phagozyten vor und vermitteln die Aufnahme und Zerstörung der Mikroben über lysosomale Faktoren mit der anschließenden Prozessierung und Antigenpräsentation (MEDZHITOV u. JANEWAY, JR. 2000). Ein Beispiel bildet der Mannoserezeptor, ein kalziumabhängiger Rezeptor von Makrophagen, DCs und Endothelzellen. Der Rezeptor erkennt genauso wie der Makrophagen-scavenger-Rezeptor ohne vorherige Opsonisierung bakterielle Zellwandkomponenten. Die Gruppe der Makrophagen-scavenger-Rezeptoren ist spezifisch für acetyliertes oder oxidiertes niedermolekulares Lipoprotein, einige Lipoteichonsäuren und Polysaccharide. Ihre Funktion besteht in erster Linie in der Phagozytose apoptotischer Zellen und der Endozytose modifizierter Lipoproteine und Cholesterolablagerungen (ERNST 1998).
Weitere PRRs sind die Mitglieder der DC-SIGN-Familie, die von DCs und Makrophagen exprimiert werden. Trotz der nachgewiesenen Fähigkeit Mannosezucker bakterieller Antigene und HI-Viren über ihre single carbohydrate recognition domain zu erkennen (APPELMELK et al. 2003; CURTIS et al. 1992), ist ihre Rezeptorfunktion für der Zellaktivierung weitgehend unklar (MCGREAL et al.
2005). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass DC-SIGNs nach der Antigenerkennung eine Signalvermittlung für eine erfolgreiche Degradation über den Phagosom-Lysosom-Weg vermitteln. Für DCs konnte eine Interaktion von M. tuberculosis-ManLAM mit DC-SIGN detektiert werden, die zu einer induzierten Sekretion des immunsupprimierenden IL-10 führte. Diese Daten führten Geijtenbeek et al. (2003) zu der Hypothese, dass M. tuberculosis über die Bindung an DC-SIGN DCs in ihren immunmodulatorischen Funktionen hemmt, womit diese Interaktion einen wichtigen Teil der Strategie von M. tuberculosis in der Modulation der Wirtsabwehr übernimmt (GEIJTENBEEK et al. 2003).
Zu den weiteren Rezeptoren, die eine Funktion in der Erkennung mykobakterieller Antigene und der Signalweiterleitung mit anschließender Expression
immunmodulatorischer Gene haben, gehören verschiedene Lektinrezeptoren, Komplementrezeptoren, CD40 und CD44 (QUESNIAUX et al. 2004a).
A.3.4 Die Signalvermittlung im aktivierten Makrophagen
Die beschriebenen PRRs („pattern-recognition receptors“) sind für die Erkennung mykobakterieller Antigene und die daran anschließende Signalvermittlung von Relevanz. Eine Aktivierung von Makrophagen über TLR2 gilt als gesichert und konnte für unterschiedliche Mykobakterien wie M. tuberculosis und M. avium avium (MAA) gezeigt werden (LIEN et al. 1999; MEANS et al. 1999). Als „Aktivierungsgrad“
des Makrophagen wurde in den meisten Studien die Genexpression verschiedener Effektormoleküle gemessen. Dazu zählen die proinflammatorischen Zytokine IL-1, IL-6 und TNF-α, Chemokine wie IL-8, Adhäsionsmoleküle wie ICAM-1 und synthetisierte reaktive Sauerstoffradikale (reactive oxygen intermediates; ROIs) und Stickstoffradikale (reactive nitric intermediates; RNIs) (GORDON 2003). Im Hinblick auf mykobakterielle Infektionen sind vor allem TNF-α, aufgrund seiner Funktion in der Granulombildung, und ROIs und RNIs, die in der Zerstörung phagozytierter Mikroorganismen beteiligt sind (NATHAN u. SHILOH 2000) von Bedeutung.
Desweiteren signalisieren ROIs und RNIs zellulären Stress und aktivieren stress- sensitive Kinasen wie p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase) und JNK (c-Jun amino-terminal kinase; SAPK: stress-activated protein kinase) (SAYRE et al. 2000).
MAPKs kommen in allen eukaryontischen Zellen vor und regulieren die Expression von Genen der Apoptose und Entzündung (DONG et al. 2002).
Die genauen Signalvermittlungswege, d. h. die Mechanismen der komplexen Signaltransduktionskaskade von der mykobakteriellen Rezeptoraktivierung bis hin zur Genexpression sind bisher weitgehend unklar. Jedoch konnten Schorey &
Cooper (2003) der p38 MAPK eine zentrale Rolle in der Signalvermittlung zuweisen (SCHOREY u. COOPER 2003). Infektionsstudien von Tse et al. (2002) mit MAA unterstützen diese Hypothese. Es konnte eine Abhängigkeit der IL-10 Expression von der Aktivierung der p38 MAPK gezeigt werden (TSE et al. 2002). Desweiteren kommt es zu einer konstitutiven Aktivierung von p38 MAPK durch apathogene im Vergleich zu einer nur kurzzeitigen Aktivierung durch virulente MAA-Stämme (ROACH u. SCHOREY 2002). Keinerlei Hinweise gibt es bisher über eine
induziertes Zytokinexpressionsprofil, jedoch fehlen jegliche Hinweise zur Modulation rezeptorvermittelter Signaltransduktionskaskaden sowie zur Genregulation (COUSSENS et al. 2005; WEISS et al. 2004).
Der genaue Mechanismus, über den bakterielle Antigene eine Immunantwort induzieren, ist sehr komplex. Der Makrophage kann durch eine Ligand-Rezeptor- Interaktion in seiner Aktivität gehemmt oder stimuliert werden. Hierzu muss ein extrazelluläres Signal über intrazelluläre Signaltransduktion durch die Zelle in den Zellkern weitergeleitet werden. In Abbildung 1 sind essentielle Komponenten der mykobakteriellen Makrophagenaktivierungskaskade schematisch dargestellt, wobei die Signalvermittlung über TLRs (Toll-like Rezeptoren) im Mittelpunkt steht, da hier bereits eine Vielzahl involvierter Proteine charakterisiert sind.
Toll-like Rezeptoren sind Typ I Membranproteine mit einer extrazellulären Domäne aus 19 bis 25 Tandemkopien von leucin-rich repeats (LRRs) und einer dem IL-1 Rezeptor ähnlichen zytoplasmatischen Toll/IL-1 Rezeptor (TIR)-Domäne (AKIRA u. TAKEDA 2004). Die Signaltransduktion der TLRs wird über unterschiedliche Adapterproteine weitergeleitet. MyD88 (myeloid differentiation primary response protein) nimmt dabei eine zentrale Rolle ein. Es bindet an die TIR-Domäne und rekrutiert die IRAKs (IL-1 receptor-associated kinases), welche nach Phosphorylierung mit TRAF6 (TNF receptor-associated factor 6) interagieren (CAO et al. 1996a; CAO et al. 1996b). TRAF6 wird somit durch IRAKs aktiviert und vermittelt schließlich eine Aktivierung von TAK1 (transforming growth factorβ- activated protein kinase), MAPKs (mitogen-activated protein kinases) und eine Freisetzung des Transkriptionsfaktors NFkB über eine Phosphorylierung des Inhibitorproteins IkB (KARIN u. BEN NERIAH 2000; LI u. KARIN 2000).
Im Fall der TLR2 und TLR4 ist ein weiteres Adapterprotein an der Signalstransduktion beteiligt. Das sogenannte Mal/TIRAP wurde zuerst von Horng et al. (2001) nachgewiesen. Die Arbeitsgruppe konnte TIRAP eine Funktion in der MyD88-unabhängigen Signaltransduktion von TLR4 zuweisen (HORNG et al. 2001).
Yamamoto et al. (2002) jedoch führten Studien an MyD88-defizienten Mäusen durch und zeigten, dass TIRAP nicht spezifisch ist für TLR4 und nicht im MyD88- unabhängigen sondern im MyD88-abhängigen Signalweg von TLR2 und TLR4 partizipiert (YAMAMOTO et al. 2002). Über die genaue Adapterfunktion herrscht somit noch Unklarheit. In aktuellen Untersuchungen an MyD88-knockout Mäusen
wurden von Selvajaroo wiederum neue Komponenten des MyD88-unabhängigen Signalwegs von TLR4 beschrieben (SELVARAJOO 2006).
Als gesichert gilt ein weiterer MyD88-unabhängiger Signalweg, der durch das TIR- Domänen-Adaptermolekül TICAM-1 (TIR-domain containing adapter molecule-1), auch als TRIF (TIR-comain containing adapter inducing IFNβ) bezeichnet, vermittelt wird. Dieser Signalweg konnte durch eine Aktivierung von TLR3 über virale doppelsträngige RNA nachgewiesen werden und führt zur Aktivierung des Interferon- regulierenden Faktor-3 (IRF-3) (HOEBE et al. 2003; OSHIUMI et al. 2003).
Für mykobakterielle Bestandteile wie LM, PIM, ManLAM (M. tuberculosis, M. bovis), PILAM (M. smegmatis) und AraLAM (M. chelonae) wurde bisher nur eine Signalvermittlung über TLR2 mittels MyD88 nachgewiesen (JONES et al. 2001;
QUESNIAUX et al. 2004b; VIGNAL et al. 2003). Die von Means et al. (1999) dargestellte Signalvermittlung über TLR4 durch hitzeinstabile Zellwandkomponenten von M. tuberculosis konnte bislang nicht reproduziert werden (MEANS et al. 1999).
Unklarheit herrscht auch über die Beteiligung von NOD-vermittelten Signaltransduktionskaskaden nach mykobakteriellen Infektionen sowie über die Bedeutung von AREs (adenylate uridylate-rich elements) und die von ihnen regulierte Stabilisierung verschiedener mRNAs (siehe Abbildung 1).
Abbildung 1. Model einer Mykobakterien-vermittelten Makrophagenaktivierung. Die Erkennung mykobakterieller Antigene erfolgt über den Mannoserezeptor, den scavenger-Rezeptor, Komplementrezeptoren, CD14, DC-SIGN und TLRs. Über die Aktivierung von TLR2 alleine oder in Assoziation mit TLR1 und TLR6 kommt es über den MyD88-Signalweg alleine oder in Kombination mit dem weiteren Adapterprotein Mal/TIRAP zur Rekrutierung von Serin/Threoninkinasen (IRAKs) und einer anschließenden Komplexbildung von IRAK mit TRAF6. Die Signalkaskade mündet u. a. in der Aktivierung der drei MAPKs ERK1/2, JNK und p38 und der daraus resultierenden Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie AP-1, c-Jun/Fos, ELK1 und NFkB, der auch direkt durch TRAF oder NOD2 aktiviert werden kann. Es kommt zur Transkription spezifischer, entzündungsrelevanter Gene, deren mRNAs z. T. AREs aufweisen. Die Bindung von AREBPs an diese Sequenzmotife fördert oder verlangsamt die Degradierung der mRNA durch Deadenylierung. In diese posttranskriptionelle Regulation ist die p38 MAPK und vermutlich auch TIRAP involiert. AP-1: activator protein-1;
AREBP: AU-rich binding protein; CD14: cluster of differentiation 14; JNK: c-Jun N-terminal kinase, DA: deadenylase; DC: dendritic cell; ERK: extrazellular signal-related kinase; IκB: inhibitor of kappaB;
IRAK: IL-1 receptor associated kinase; LAM: Liparabinomannan; LM: Lipomannan;
MR: Mannoserezeptor; NFκB: nuclear factor kappaB ; NOD2: nucleotide-binding oligomerisation domain protein 2; KR: Komplementrezeptor; PIM: Phosphatidylinositolmannosid; R: Ribosom;
SCR: scavenger receptor; TIRAP: TIR domain adapter protein; TLR: Toll-like receptor;
TRAF: TNF receptor associated factor.
A.3.5 Mechanismen der Genregulation
Makrophagen zählen als professionelle Phagozyten zum angeborenen Immunsystem und sind beim ersten Kontakt mit PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) in der Lage, diese als „fremd“ zu erkennen und sofort unter Schonung des eigenen Gewebes gezielt zu eliminieren (JANEWAY, JR. u. MEDZHITOV 2002). Hierfür ist eine spezielle Genregulation für die schnelle Expression von spezifischen Proteinen der Abwehrreaktion erforderlich. Zum anderen muss die Zelle nach der Synthese dieser Effektorproteine ihre eigene Expressionsmaschinerie gezielt drosseln, um eine unkontrollierte Beeinflussung der umgebenden Zellen durch potente Stimulatoren wie z. B. TNF-α zu vermeiden (JONGENEEL 1994). Im folgenden werden grundlegende Mechanismen der Genregulation von Eukaryonten erläutert.
Die Expression eines Gens kann auf unterschiedlichen Ebenen kontrolliert werden.
Sowohl die Stärke der Transkription als auch die Stabilität der mRNA und deren Translationseffizienz können Ziel der Regulation sein. Während der Transkription überträgt die RNA-Polymerase die genetische Information der DNA auf die RNA. Für den Start der Transkription ist der Promotorbereich von Bedeutung. In Abhängigkeit seiner Sequenz und der daraus resultierenden Bindung der RNA-Polymerase spricht man von „starken“ oder „schwachen“ Promotoren. Die Regulation des Transkriptionsstarts erfolgt über die Bindung von aktivierenden oder reprimierenden Transkriptionsfaktoren, auch als transaktivierende Faktoren bezeichnet, die im Promotorbereich an cisregulatorische Elemente binden können (ROEDER 2005). In frühen Phasen der Genregulation von immunologisch relevanten Genen werden vor allem die Transkriptionsfaktoren NFkB oder AP-1-genutzt (GHOSH 1999). Neben der ersten Phase der Transkription können auch die Elongation und die Termination Ziel der Regulation sein. Die zeitlich gesehen erste posttranskriptionelle Regulationsmethode liegt in der differentiellen Degradierung von mRNAs (siehe auch Abbildung 1). Die Degradierung von mRNA beginnt sofort nach ihrer Synthese mittels Deadenylierung der mRNA durch Ribonukleasen und mittels endonukleolytischer Spaltungen (ROSS 1995). Je schneller der Abbau einer mRNAs erfolgt, desto weniger Zeit verbleibt für die Translation. Verschiedenen Zytokinen konnte eine Funktion in der Stabilisierung von mRNAs von Wachstumsfaktoren und entzündungsrelevanten Proteinen nachgewiesen werden. So ist IL-1 in der Lage eine
TNF-α wiederum vermag die IL-1 mRNA zu stabilisieren (GOROSPE et al. 1993).
Eine Regulation der mRNA-Degradierung wird z. B. über AU-reiche (adenylate uridylate-rich) Sequenzen im 3´-Bereich der mRNAs ermöglicht. Die Erstbeschreibung dieser durch Kopien von AUUUA- oder UUAUUUAUU charakterisierten Sequenzmotife in mRNAs verschiedener Zytokine geht auf Caput et al. (1986) zurück (CAPUT et al. 1986). Besonders gut konnte die Regulation von TNF-α charakterisiert werden. TIA (T-cell intracellular antigen)-1 und TIAR (TIA-1- related protein) wirken als silencer der Translation indem sie an AREs der TNF-α mRNA binden. Weitere AREBPs (ARE-binding proteins) sind das destabilisierende TTP (Tristetraprolin) und das stabilisierende HuR (CLARK et al. 2003). Auch die eigentliche Translation kann über Translationsinitiationsfaktoren reguliert werden und die Effizienz mit der eine in der Zelle vorhandene mRNA translatiert wird, bestimmt darüber, wieviel des entsprechenden Proteins exprimiert werden kann. Oftmals liegt ein Protein zunächst in einer sogenannten Proform vor und unterläuft bis zur aktiven Form weitere Reifungsprozesse. Ein Beispiel dafür ist IL-1β. Bevor das Protein als aktives proinflammatorisches Zytokin IL-1β aus einem Makrophagen sezerniert wird, kommt es zum Transport der IL-1β Proform zur Zellmembran und der Umwandlung zur reifen IL-1β Form durch das ICE (IL-1β converting enzyme). Somit kann die Expression von IL-1β über Regulation des ICE auch posttranslational reguliert werden.
Zusammenfassend ergibt sich für die Expression von Wachstumsfaktoren und Zytokinen der Entzündung ein komplexes Netzwerk unterschiedlicher spezifischer Kontrollmechanismen. Im Hinblick auf die durchzuführenden Infektionsstudien ist es damit zwingend erforderlich alle Ebenen der Genregulation zu untersuchen und die Ergebnisse immer im Zusammenhang mit allen bekannten entzündungsrelevanten Faktoren zu interpretieren.
Eine klassische Methode zur Analyse von RNA Transkripten stellen Northern Analysen dar. Dabei wird die Gesamtmenge der jeweiligen RNA einer Zelle über eine Hybridisierung mit bekannten, radioaktiv markierten cDNAs untersucht (SAMBROOK 2001). Neuartige Methoden mit dem gleichen Ziel sind Mikroarrays und Real-Time PCRs, wobei die RNA zunächst in cDNA transkribiert werden muss (SCHENA et al.
1996; WONG u. MEDRANO 2005). Die Quantität verschiedener mRNAs ist abhängig von der Transkriptionsrate, d. h. die Menge synthetisierter Transkripte eines spezifischen Gens pro Zeit. Die Methode des nuclear run on transcription assay, die
im Methodenteil beschrieben ist, untersucht die Menge tatsächlich aktiv transkribierter mRNA eines bestimmten Zeitpunktes (GREENBERG u. ZIFF 1984).
Alle genannten Methoden ermöglichen eine Aussage über Genexpression und deren Regulation, ohne die Proteinsynthese mit einzubeziehen. Aus diesem Grund ist ein Nachweis des reifen Proteins über seine Aktivität oder mittels spezifischer Antikörper notwendig. Hierfür eignen sich ELISAs oder Antikörper-Arrays.
Diese Darstellungen verschiedener ausgewählter Genregulationsmechanismen und ausgewählter Methoden zur Gen- und Proteinexpressionsuntersuchung sollen verdeutlichen, dass einzelne Methoden für sich alleine nur eine spezielle Ebene des komplexen Regulationsnetzwerkes charakterisieren können. Für umfassende Interpretationen hingegen ist eine kombinierte Expressionsanalyse mittels verschiedener Methoden essentiell.
A.3.6 Übergreifende Modulation der Immunabwehr infizierter Makrophagen
Wie beschrieben sind pathogene Mykobakterien als fakultativ intrazelluläre Mikroorganismen vorwiegend im Makrophagen zu finden. Dabei kommt es durch mykobakterielle Bestandteile über die erwähnten Rezeptoren (siehe auch Abbildung 1) zur Aktivierung des Makrophagen und damit zu Veränderungen in der Genexpression. Nach der Phagozytose der Bakterien werden komplexe zelluläre Prozesse eingeleitet. Es kommt zur Heranreifung und Ansäuerung des Phagolysosom (DORN et al. 2002; STORRIE u. DESJARDINS 1996) und zur Synthese reaktiver Sauerstoffmoleküle (ROIs) beim sogenannten oxidative burst mittels NADPH-Oxidasen und Generierung von NO durch die induzierbare NO- Synthase (iNOS) (ISCHIROPOULOS et al. 1992). Der Makrophage stellt somit ein komplexes System dar und vermag ohne Hilfe anderer Immunzellen neben apoptotischen Zellen auch viele Mikroorganismen zu eliminieren.
Trotzdem übernimmt der Makrophage weiterführende immunologische Funktionen, wie die Antigenpräsentation prozessierter mikrobieller Peptide als Komplex mit ihren MHC Molekülen an der Zelloberfläche, die Expression kostimulierender Oberflächen- moleküle und die Sekretion von T-Zell-aktivierenden und chemotaktischen Botenstoffen. Die bisherigen Infektionsstudien von Makrophagen konnten die
Mykobakterien darlegen. Es gibt jedoch nur wenige Studien, die neben dem mit Mykobakterien infizierten Makrophagen auch Einflüsse auf die Effektorzellen der Peripherie untersuchen. Winau et al. (2004) konnten durch die Infektion von Makrophagen mit M. tuberculosis weder eine Antigenpräsentation über MHCI Moleküle noch eine Expression der antigenpräsentierenden CD1 Moleküle hervorrufen. Der infizierte Makrophage sezernierte jedoch Vesikel mit mykobakteriellen Zellwandbestandteilen (blebs), die über ein sogenanntes cross- priming nicht infizierte Dendritische Zellen zur Antigenpräsentation aktivierten (WINAU et al. 2004).
MAP persistiert in intestinalen Makrophagen, die in der lamina propria von B- und T-Lymphozyten sowie von Enterozyten und Dendritischen Zellen umgeben sind (SIGURETHARDOTTIR et al. 2004). Die Tatsache, dass MAP gravierende chronisch entzündliche Veränderungen der Darmschleimhaut hervorruft, führt zu der Vermutung, dass der infizierte Makrophage auch auf intestinale Epithelzellen (IECs) einen entscheidenden Einfluss nimmt. Lange Zeit wurden IECs nicht als immunologisch aktive Zellen betrachtet (JANEWAY 1999), jedoch konnten vereinzelt immunmodulatorische Effektorfunktionen von Epithelzellen wie z. B. eine Zytokinproduktion oder Antigenpräsentation nachgewiesen werden (SODERHOLM et al. 2004).
Für humane IECs konnte auf Ebene der RNA die Expression von TLR1 bis TLR9, und für murine bisher TLR2, TLR4, TLR5 und TLR9 nachgewiesen werden (ABREU et al. 2005). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Epithelzellen TLR5 besonders stark exprimieren, was nach einer Aktivierung durch Flagellin zur Sekretion von Chemokinen (MIP-3α) führte. Somit übernehmen IECs neben der Barrierebildung gegen Mikroorganismen auch als Immunzellen entscheidende Funktionen (RHEE et al. 2004). Weitere Untersuchungen konnten der TLR5- abhängigen Erkennung von Flagellin auf IECs eine Rolle bei Morbus Crohn und idiopathic inflammatory bowel disease zuweisen (LODES et al. 2004). Auch für humane Dendritische Zellen konnte eine Expression von TLRs und eine Funktion in der Homöostase im Instestinalraum nachgewiesen werden. Es gibt jedoch keine Studien zur Interaktion von Makrophagen nach einer Infektion mit MAP mit den umgebenden Effektorzellen und deren Aktivierung oder Deaktivierung. Ein Anhaltspunkt für eine möglicherweise entscheidende Funktion von intestinalen Epithelzellen im Verlauf der Paratuberkulose besteht im Darmtropismus des
Erregers, wobei es nur in bestimmten Bereichen zur Persistenz kommt, sowie der Tatsache, dass sich auch die IECs im Hinblick auf ihre Expression von TLRs, ihre Aktivierung und Sekretion von Zytokinen, Chemokinen und antimikrobiellen Peptiden ganz entscheidend unterscheiden (ABREU et al. 2005; GANZ 2003).
A.4 Zielsetzung der Arbeit
Aus der dargelegten Einleitung wird deutlich, dass Mykobakterien im Makrophagen unterschiedliche Ebenen der Effektorfunktionen beeinflussen. Da zu dieser Thematik relativ wenig über Mycobacterium (M.) avium paratuberculosis (MAP) bekannt ist, wurde in der vorliegenden Arbeit die Modulation der Genregulation infizierter Makrophagen durch MAP untersucht. Als Vergleich dienten eine Infektion mit dem nicht pathogenen M. smegmatis (MS) und der universelle Stimulator LPS (Lipopolysaccharid) von gramnegativen Bakterien. Mittels dieser Infektionen wurden molekulare Mechanismen im Hinblick auf eine MAP-spezifische Modulation des Makrophagen untersucht.
Die beiden Subspezies M. avium (MAA) und MAP persistieren in Makrophagen.
Interessanterweise haben sie trotz einer genetisch sehr engen Verwandtschaft unterschiedliche Wirtsspezifitäten und unterscheiden sich auf bisher unbekannte Weise in ihren Pathogenitätsmechanismen. Die Infektion muriner Makrophagen mit MAP bewirkt eine Zytokinproduktion und eine T-Zell-Deaktivierung. Vergleichende Auswirkungen auf T-Zellen durch MAA infizierte Makrophagen waren bislang nicht nachweisbar. Die Modulation der Makrophagenaktivierung durch die Infektion mit MAP, deren Mechanismen sowie die Auswirkungen auf Effektorzellen der Peripherie wurden bislang nicht untersucht, stellen im Hinblick auf den Vergleich der durch MAP und MAA hervorgerufenen unterschiedlichen Krankheitsgeschehen aber einen Schlüsselpunkt für die Etablierung des Erregers dar.
Daher wurden Gen- und Proteinexpressionsrofile mit dem Vergleich einer Infektion von MAP mit MAA erstellt, wobei Proteine mit relevanten Funktionen entzündlicher Prozesse im Vordergrund der Untersuchungen stehen. Und neben der Modulation des Makrophagen sollen darüber hinaus mögliche Effekte auf nicht infizierte Epithelzellen analysiert werden.
B Material und Methoden
In diesem Abschnitt der These werden nach Angabe der verwendeten Materialien die durchgeführten Methoden beschrieben. Alle nicht dargelegten Standardmethoden sind der allgemein zugänglichen Literatur (SAMBROOK 2001) zu entnehmen.
B.1 Material
B.1.1 Chemikalien, Geräte und Verbrauchsmaterialien
Für die vorliegende Arbeit wurden Chemikalien der Mindestreinheitsstufe „zur Analyse“ verwendet. Diese wurden von Roth (Karlsruhe), Merck (Darmstadt), Serva (Heidelberg) oder Sigma (Deisenhofen) bezogen. Die Restriktionsendonukleasen wurden von New England Biolabs (Frankfurt am Main) und weitere molekularbiologische Enzyme von Invitrogen (Karlsruhe) oder Merck (Darmstadt) bezogen. Für die Kultivierung der Zelllinien kamen Zellkulturmedien und –zusätze der Firma Invitrogen/Gibco (Karlsruhe) zum Einsatz. Die radioaktiven Nukleotide [α32P]dCTP (3000 Ci/mmol) und [α32P]UTP (3000 Ci/mmol) wurden von Perkin Elmer/NEN (Köln) bezogen.
Spezielle Chemikalien, Laborgeräte und verwendete Kits sind im Anhang (A) aufgelistet. Die Verbrauchsmaterialien wurden von Sarstedt (Nümbrecht), Nunc (Wiesbaden), Greiner Bio-One (Essen) oder Biozym (Hess.-Oldendorf) bezogen.
Spezielle Materialien sind im Anhang angeführt.
B.1.2 Lösungen und Puffer
Alle verwendeten Stock-, Gebrauchs- und Pufferlösungen (H.3) wurden mit ddH2O hergestellt. Wenn möglich wurden sie autoklaviert oder mit autoklavierten Stammlösungen angesetzt. Die finalen Konzentrationen sind der Methodenbeschreibung zu entnehmen.
B.1.3 Antikörper und Oligonukleotide
Die benutzten Antikörper wurden von BioSource (Solingen) und Amersham (Freiburg) bezogen und sind wie auch die Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide mit einer HPLC-gereinigten Qualität von der Firma MWG-Biotech (Ebersberg) im Anhang (H.5) aufgelistet. Die Auswahl der Primersequenzen erfolgte
auf Basis der unter der Datenbank medizinischer Veröffentlichungen PUBMED (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Genome) hinterlegten murinen Genomsequenzen unter Zuhilfenahme des freien Primer-Generierungsprogramms primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). Sie sind i. d. R.
intronüberspannend (Ausnahme: IL-10). Vor allem bei dem Primerdesign für die Real-Time PCR ist zu beachten, dass die Primer keine repetitiven Sequenzen, eine Länge von etwa 20 bp, eine einheitliche Schmelztemperatur aufweisen und ein Produkt generieren, welches nicht größer als 200 bp ist. Die Sequenzen wurden über DNASTAR, Primer Select Software (Lasergene, Madison, USA; über die GBF, Braunschweig) ausgewählt.
B.1.4 Plasmide
Die in dieser Arbeit verwendeten, kommerziell erworbenen Plasmide pGL3-Basic Vektor, pGL3-Control Vektor und pRL-TK sind im Anhang (H.7) aufgeführt.
B.1.5 Bakterien- und Zellkulturen
B.1.5.1 Mykobakterien
Für die Infektionsversuche wurden die Mykobakterien Mycobacterium avium avium (MAA), Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) und Mycobacterium smegmatis (MS) eingesetzt. Dafür wurde der MAA Stamm DSM 44156 verwendet, der von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig stammte. Auch der verwendete MAP Feldstamm 6783, der erstmals von Jark et al. (JARK et al. 1997) beschrieben wurde, stammte von der DSMZ (DSM 44135). Der Stamm weist ein mycobactinabhängiges Wachstum auf und wurde vom nationalen Referenzzentrum für Mykobakterien (Institut für experimentelle Biologie und Medizin, Forschungsinstitut Borstel) durch Sequenzanalyse des 16S rRNA Gens als MAP identifiziert. Die Bestätigung der Klassifizierung erfolgte am Institut für Mikrobiologie an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durch den PCR gestützten Nachweis des IS900. Mycobacterium smegmatis mc²155 (ATCC 19420) war von der DSMZ.
B.1.5.2 E. coli
Im Rahmen dieser Arbeit wurden für sämtliche Klonierungsarbeiten der Escherichia coli (E. coli) Stamm DH5α mit dem Phänotyp supE44 ΔlacU169 (Φ80lacZ ΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 eingesetzt.
B.1.5.3 Zelllinien
Für Infektions- und Stimulationsversuche wurden die murinen Makrophagenzelllinien J774A.1 und RAW264.7 sowie die murinen Enterozyten MODE-K eingesetzt. Die J774A.1 Makrophagen (RALPH et al. 1976) (DSMZ-Nummer ACC 170;
ATCC TIB-67) wurden 1968 aus einem spontanen Tumor einer Balb/c Maus gewonnen. Sie exprimieren Komplement- und Immunglobulinrezeptoren und synthetisieren sowohl Lysozym als auch IL-1. Die Makrophagen der Zelllinie RAW264.7 Makrophagen sind mit dem Abelson Leukämievirus immortalisiert (RASCHKE et al. 1978) (ATCC TIB-71). Sie synthetisieren ebenfalls Lysozym, exprimieren jedoch keine Oberfächenimmunglobuline. Die MODE-K Enterozyten wurden freundlicherweise von der Arbeitsgruppe Dominique Kaiserlian (Institut Pasteur de Lyon, Lyon, Frankreich) zur Verfügung gestellt. Durch Infektion primärer duodenaler Epithelzellen mit dem SV40-6 Retrovirus immortalisierten sie die Zellen (VIDAL et al. 1993), ohne Charakteristika von Enterozyten wie die Expression der Cytokeratine 8 und 18, Vilin sowie die der sekretorischen Komponente des IgA- Polymers zu beeinflussen.
B.1.5.4 Murine Knochenmarksmakrophagen
Primäre Knochenmarksmakrophagen von Balb/c Mäusen wurden freundlicherweise von Dr. W. Bäumer (Institut für Pharmakologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover) zur Verfügung gestellt.
B.2 Methoden
B.2.1 Anzucht von Bakterien
B.2.1.1 Mykobakterien
Die Kultivierung von MAP und MAA erfolgte über mehrere Monate in 20 ml Watson- Reid-Medium (5 g/l L-Asparagin; 10 g/l Glukose; 2 g/l Di-Ammoniumcitrat; 75 mg/l Eisenammoniumcitrat; 2 g/l NaCl; 2 g/l KH2PO4; 1 g/l MgSO4 x 7 H2O; 10 mg/l ZnSO4 x 7 H2O; 2 mg/l CaCl2 x H2O; 63 ml/l Glyzerol) in Zellkulturflaschen bei 37°C und feuchter Atmosphäre im Brutschrank. Der pH-Wert des Mediums wurde mit NaOH auf pH 5,6 eingestellt und nach dem Autoklavieren wurde das Medium mit 4 g/l Natriumpyruvat versetzt sowie für die Kultivierung von MAP mit 2 mg/l Mycobactin J. MS wurde auf Luria-Bertoni (LB) Agar angezogen und dann über 1 bis 3 Tage in einer LB Flüssigkultur bei 37°C rotierend (80 U/min) angezüchtet.
Zur längeren Konservierung wurden die Mykobakterien in Watson-Reid oder LB Medium mit 25% (v/v) Glyzerol bei -80°C eingefroren oder es erfolgte die Anfertigung von Lyophilisaten. Dabei wurde Kulturmaterial in 10 ml Kälberserum mit Zusatz von 10% (w/v) Glukose aufgenommen, je 1 ml in ein Lyophilisatgefäß überführt und 12 bis 16 h lyophilisiert. Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
Zur Gewinnung der Mykobakterien für die Infektionsversuche wurden Kolonien von MAP mit einer sterilen Impföse von der Oberfläche des Mediums in ein 15 ml Röhrchen mit 5 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) überführt und zur Vereinzelung der Bakterien mit 30 sterilen Glasperlen für 5 min gevortext. Um verbliebene Kolonieverbände von den vereinzelten Mykobakterien zu trennen, erfolgte ein Zentrifugationsschritt der Suspension bei 200 x g für 10 min und RT. Die Bakteriensuspension wurde dekantiert und für die Infektionsversuche auf eine OD660 von 0,15 (KUEHNEL et al. 2001) eingestellt. Für die Gewinnung von MAA wurden 10 ml Bakterienkultur bei 2000 x g für 10 min und RT zentrifugiert, das Bakterienpellet mit DMEM und Glasperlen aufgerüttelt und im weiteren wie oben beschrieben vorgegangen. Die Ernte von MS erfolgte durch Zentrifugation von 10 ml Bakteriensuspension bei 2000 x g für 10 min und RT. Das Bakterienpellet wurde mit 10 ml DMEM und Glasperlen gevortext und der Überstand weiterverwendet.
