Bestätigung ausgewählter differentiell exprimierter Gene

C.2.2.1.1 Bestätigung der differentiellen Expression ausgewählter Gene mittels RT-PCR

Für eine Bestätigung der mittels Mikroarray erhaltenen Ergebnisse wurden differentiell exprimierte Gene zunächst in RT-PCR Analysen untersucht. Dazu wurden wie oben beschrieben RAW264.7 Makrophagen in drei unabhängigen Versuchen mit MAP oder MAA infiziert. Nach 2 h, 8 h und 24 h wurde die RNA isoliert und revers in cDNA transkribiert. Die cDNA wurde auf die Expression einiger anhand der Mikroarrayanalysen ermittelten, regulierten Genen mittels RT-PCR untersucht. Dabei wurden regulierte Gene ausgewählt, die sich in den Gruppen der MAP und MAA infizierten Makrophagen unterschieden und von Bedeutung im Verlauf einer Entzündungsreaktion sind. Als Beispiele wurden IL-1RA, die proinflammatorischen Zytokine IL-1α und IL-1β, Lipocalin 2 und repräsentativ für Wachstumsfaktoren G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor) und GM-CSF (granulocyte/macrophage colony-stimulating factor) gewählt.

In Abbildung 20 ist die gelelektrophoretische Auftrennung im Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel der PCR Amplifikate für G-CSF, GM-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, Lipocalin 2 und GAPDH dargestellt. G-CSF und GM-CSF wurden nach einer Infektion von 2 h und 8 h deutlich aufreguliert. Nach 24 h schwächte sich die Induktion wieder ab. Beide Gene wurden stärker durch eine Infektion mit MAA als mit MAP induziert. Dabei war die stärkste Induktion von G-CSF nach 8 h und von GM-CSF nach 2 h zu sehen. Ebenfalls deutlich aufreguliert wurden IL-1α und IL-1β nach 2 h und 8 h Infektion mit MAP oder mit MAA. Auch diese beiden Zytokine wurden nach 24 h Infektion in ihrer Induktion merklich abgeschwächt. Zu jedem der analysierten Zeitpunkte war die Induktion von sowohl IL-1α und IL-1β durch MAA stärker ausgeprägt. In Abbildung 20 ist dies nur nach einer Infektionszeit von 24 h zu sehen, da für die anderen Zeitpunkte eine Sättigung der exponentiellen Amplifizierung während der PCR erreicht war. Für Lipocalin 2, ein Plasmaprotein mit einer Vielzahl physiologischer Funktionen, wie beispielsweise den Transport von

Steroidhormonen (MORAIS CABRAL et al. 1995), konnte die differentielle Induktion mit einer stärkeren Expression nach einer Infektion mit MAA für alle analysierten Zeitpunkte dargestellt werden. Für IL-1RA zeigte sich in der unten dargestellten gelelektrophoretischen Auftrennung der PCR Amplifikate eine leichte Induktion nach 8 h und 24 h Infektion. Durch MAA wurde IL-1RA etwas stärker induziert als durch MAP. Die Gensequenz von IL-1RA enthält eine typische Signalsequenz und wird normalerweise von Zellen sezerniert, die in die Apoptose übergehen, um die Entzündungsreaktion zu vermindern (MUZIO et al. 1999).

Abbildung 20. Genexpression differentiell exprimierter Gene in MAP und MAA infizierten RAW264.7 Makrophagen. Es wurden RAW264.7 Makrophagen mit MAP oder MAA infiziert oder als Kontrolle unbehandelt gelassen (-). Nach 2 h, 8 h und 24 h Inkubation wurde die RNA isoliert. Der Versuch wurde dreimal wiederholt und die jeweiligen RNAs gepoolt, in cDNA umgeschrieben und diese mittels RT-PCR auf die Genexpression von G-CSF, GM-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, Lipocalin 2 und GAPDH untersucht. Dargestellt ist die gelelektrophoretische Auftrennung der PCR Amplifikate.

C.2.2.2 Real-Time PCR zur differentiellen Genexpression von IL-1α und IL-1β Die oben beschriebenen semiquantitativen RT-PCR Analysen konnten eine differentielle Induktion ausgewählter Zytokine und Wachstumsfaktoren in MAP und MAA infizierten RAW264.7 Makrophagen bestätigen. Bei der Auswertung und Darstellung der Ergebnisse geriet man jedoch an die Grenzen dieser Methode.

Quantitative Aussagen waren oft nicht möglich, da einige der zu untersuchenden Proben während der aufeinanderfolgenden Inkubationszyklen schneller aus dem exponentiellen Bereich der DNA Amplifizierung heraus waren als andere. Somit war ein Vergleich mehrerer Proben innerhalb der Zeitreihe oder zwischen MAA und MAP nur suboptimal möglich. Um dieses Problem zu umgehen, wurden für eine zusätzliche Bestätigung der mittels Mikroarray erhaltenen Ergebnisse Real-Time PCRs mit den gleichen cDNA durchgeführt (MOCELLIN et al. 2003).

Es wurden Real-Time PCRs für eine Analyse der stark differentiell exprimierten Gene von IL-1α und IL-1β durchgeführt. Dazu wurden wie oben beschrieben RAW264.7 Makrophagen in drei unabhängigen Versuchen mit MAP oder MAA infiziert (B.2.2.2).

Nach 2 h, 8 h, und 24 h wurde die RNA isoliert und zur Synthese von cDNA eingesetzt (B.2.5.1). Die cDNA wurde für Genexpressionsanalysen auf IL-1α, IL-1β und (ribosomal protein s9) RPS9 mittels Real-Time PCR untersucht. Die Vorgehensweise ist im Methodenteil beschrieben (B.2.5.3). Zur Auswertung wurden die Fluoreszenzsignale jeweils nach Abzug der Signale interner Standards zusätzlich über das house-keeping Gen RPS9 normalisiert und in Abbildung 21 als x-fache Induktion nach einer Infektion graphisch dargestellt. Die Auswahl von IL-1α, IL-1β erfolgte exemplarisch aufgrund der deutlich unterschiedlichen Hybridisierungssignale der Mikroarrayanalysen (C.2.1). Die graphische Darstellung der x-fachen Induktion von IL-1α und IL-1β von RAW264.7 Makrophagen nach Infektion mit MAA bestätigte die stärkere Induktion beider Gene im Vergleich zu einer Infektion mit MAP. Der Mikroarray wurde mit RNA aus RAW264.7 Makrophagen durchgeführt, welche über 24 h infiziert waren. Die Untersuchungen auf Basis der Real-Time PCR zeigten die erwarteten differentiellen Genexpressionen von IL-1α, dass nach 24 h durch MAA etwa 3,4-fach stärker induziert wurde als durch MAP, und IL-1β, dass nach 24 h durch MAA etwa 58-fach stärker induziert wurde als durch MAP. Auch zu früheren Infektionsstadien wurde die Genexpression durch MAA jeweils stärker induziert als durch MAP.

Der deutlichste Unterschied der IL-1α Genexpression bei dem Vergleich zwischen MAA und MAP konnte mittles Real-Time PCR nach 8 h ermittelt werden und lag bei etwa 5-fach. Ein ähnliches Genexpressionsprofil ergab sich für die Untersuchung von IL-1β. Der deutlichste Unterschied der IL-1β Genexpression bei dem Vergleich zwischen MAA und MAP lag bei etwa 58-fach nach 24 h.

Abbildung 21. Differentielle Genexpression von IL-1α und IL-1β in MAP und MAA infizierten RAW264.7 Makrophagen. Es wurden RAW264.7 Makrophagen mit MAP oder MAA infiziert oder als Kontrolle unbehandelt gelassen. Nach 2 h, 8 h und 24 h Inkubation wurde die RNA isoliert. Der Versuch wurde dreimal wiederholt und die jeweiligen RNAs gepoolt, in cDNA umgeschrieben und diese mittels Real-Time PCR nach der SybrGreen-Methode auf die Genexpression von IL-1α, IL-1β und RPS9 untersucht. Die Fluoreszenzsignale von IL-1α und IL-1β wurden nach Abgleich mit denen von RPS9 und der internen Kontrollen als x-faches Signal von infizierten im Vergleich zu unbehandelten Zellen ausgewertet und hier exemplarisch für jeweils eine durchgeführte PCR

Anhand der dargestellten differentiellen Genexpressionsprofile konnten die Mikroarraydaten exemplarisch bestätigt werden. Bei dem Vergleich einer Infektion der RAW264.7 Makrophagen mit MAP und MAA konnten mittels Mikroarray weniger als 20 differentiell exprimierte Gene detektiert werden (Tabelle 1). Die Genregulation konnte semiquantitativ (Abbildung 20) und quantitativ (Abbildung 21) reproduziert werden. Dabei wurden exemplarisch entzündungsrelevante Zytokine und Wachstumsfaktoren ausgewählt. Zum einen lieferten die verschiedenen technischen Ansätze ähnliche Resultate und zum anderen ergaben sich daraus auch sehr ähnliche Transkriptome für RAW264.7 Makrophagen nach Infektion mit MAP oder MAA. Die Untersuchung einer Vielzahl von Genen resultierte in 18 marginal differentiell regulierten Genen.

C.2.3 Quantitative Unterschiede im Sekretom infizierter RAW264.7