Quantitative Unterschiede im Transkriptom infizierter RAW264.7 Makrophagen

Da erste Unterschiede M. avium infizierter muriner Makrophagen in der T-Zellaktivierung nach einer 24-stündigen Infektionszeit nachweisbar waren (ZUR et al. 2003), wurde hier für einen Gesamtüberblick der Genexpression eine Mikroarrayanalyse mit RNA von RAW264.7 Makrophagen durchgeführt, die 24 h mit MAP bzw. MAA infiziert waren. Mit dem eingesetzten GeneChip^® Mouse Genome 430A 2.0 Array der Firma Affymetrix, der 22600 gespottete Oligonukleotide enthält, konnten über 14000 charakterisierte Gene untersucht werden. Dazu gehören neben Haushaltsgenen viele bei Entzündungsreaktionen auf- oder abregulierte Gene für Zytokine, Chemokine, Oberflächenmarker und Transkriptionsfaktoren.

In der Array Facility der GBF Braunschweig wurden zwei Chipanalysen der vereinigten RNAs aus drei voneinander unabhängigen Versuchen mit Makrophagen nach Infektion mit MAP oder MAA und unbehandelten Zellen durchgeführt. Zur Auswertung für diese Arbeit wurden alle regulierten Gene betrachtet, die in beiden Versuchen ein klares Hybridisierungssignal lieferten. Oligonukleotide, welche nach der Hybridisierung kein deutliches Fluoreszenzsignal lieferten und vom Scanner nicht aufgenommen wurden, erschienen nicht in der Auswertung. Ein wichtiges Qualitätsmerkmal von Mikroarrayanalysen ist der detection-Wert. Auf der Basis der Hybridisierungssignale wird die Differenz zwischen dem jeweiligen mismatch- und perfect match-Signal gebildet (siehe auch B.2.7). Bei einem geringen Signalunterschied wird das durch elf oligos charakterisierte probe set bei der Auswertung in eine qualitativ minderwertige Kategorie eingestuft. Man unterscheidet in der detection die minderwertige Kategorie absent (A), für sehr geringe Differenzen, und marginal (M) oder present (P) für deutliche oder eindeutige Differenzen bei allen mismatch- und perfect match Oligonukleotiden eines probe sets.

Desweiteren wurden die erhaltenen Hybridisierungsergebnisse zur Auswertung paarweise verglichen. Dazu wurde zunächst aus der Differenz der zu vergleichenden Signale der Logarithmus gebildet und der Wert dieser Signal Log Ratio wieder zurückgerechnet, um die Differenz zweier Signale als fold change anzugeben. Auch hier wurde die Qualität der detektierten Signale berücksichtigt. Es wurden die jeweiligen Signale eines probe sets von zwei Proben betrachtet und in Abhängigkeit ihrer Differenz in die Kategorien A, B, C und 0 eingestuft. Zeigten beispielsweise alle

Signale der einen Probe die gleiche Signalstärke von zwei und die der anderen acht an, so wird das probe set aufgrund der offensichtlich hohen Differenz im paarweisen Vergleich in die Kategorie A eingestuft. Bei Abweichungen innerhalb eines probe sets werden die Kategorien B oder C genutzt. Einige probe sets ergaben in beiden Proben positive und negative Werte für die einzelnen miteinander verglichenen oligos an und mussten in die Kategorie 0 als „nicht aussagekräftig“ eingestuft werden (CHUDIN et al. 2002; HILL et al. 2000).

Die für diese Arbeit notwendigen Datenauswertungen erfolgten unter dem Einsatz qualitativ unterschiedlicher Datenfilter mit zunehmender „Stringenz“. Zunächst wurde die Gruppe der unbehandelten Zellen mit der Gruppe der MAP oder mit der Gruppe der MAA infizierten Zellen verglichen. Dabei wurden alle Gene betrachtet, die in der MAP oder MAA Gruppe im Vergleich zur Kontrolle reguliert wurden. Für die nachfolgend angegebene Auswertung wurden alle regulierten Gene betrachtet, die sich im Replikat reproduzieren ließen, d. h. der fold change war bei beiden Arrays positiv oder negativ und das Signal war nicht bei beiden absent. Darüber hinaus wurden im Hinblick auf die Qualität des Signalunterschiedes infizierter Zellen zu unbehandelten Zellen zunächst alle Kategorien betrachtet, d. h. es wurden auch probe sets mit nicht übereinstimmenden Werten in die Auswertung mit einbezogen, um die regulierten Gene in ihrer Gesamtheit zu erfassen. In

Abbildung 18 ist die Gesamtzahl der regulierten Gene graphisch dargestellt. Nach einer Infektion mit MAP wurden gegenüber nicht behandelten Zellen 1036 Gene aufreguliert und 1230 abreguliert. Nach einer Infektion mit MAA wurden 1226

abreguliert und 1035 aufreguliert. Hinsichtlich der Anzahl regulierter Gene war die Antwort der

RAW264.7 Makrophagen auf eine Infektion mit MAP oder MAA damit nahezu identisch. Die Expressionsdifferenz war in ihrer Intensität größtenteils sehr gering.

Für die überwiegende Anzahl regulierter Gene wurde ein fold change von 1 bis 2 ermittelt. Durch Vergleich der Signalstärke auf- und abregulierter Gene nach einer Infektion mit MAP oder MAA zeigte sich jeweils eine „intensivere“ Regulation durch eine Infektion mit MAA. So konnten insgesamt 110 Gene mit einer Regulation über 5 fold für MAA und nur 91 Gene für MAP nachgewiesen werden.

Abbildung 18. Anzahl regulierter Gene in RAW264.7 Makrophagen nach 24 h Infektion mit MAP oder MAA im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen (I). Es wurden RAW264.7 Makrophagen mit MAP oder MAA infiziert, bzw. nicht behandelt. Nach 24 h Inkubation wurde die RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben, markiert und mit dem GeneChip^® Mouse Genome 430A 2.0 Array hybridisiert.

Die Fluoreszenzsignale wurden normalisiert. Zur Auswertung wurden die Signale infizierter RAW264.7 in Relation zu denen der Kontrollzellen gesetzt. Die Graphik zeigt alle Gene, die in drei unabhängigen Infektionsversuchen auf zwei Arrays eine Induktion oder Abregulation im Vergleich zur Kontrolle aufzeigten die der Anforderung no change entsprachen und eine Regulation von mindestens 1 fold, bzw. 5 fold war.

Anhand dieser Auswertungen war kein direkter Vergleich der Infektion mit MAP und der Infetion mit MAA möglich. Die Abbildung 18 zeigt zwar, dass die Anzahl regulierter Gene etwa gleich war, doch handelte es sich nicht um die gleichen Gene.

Das liegt zum einen an technischen Details während der Signaldetektion. Zum anderen wurden jeweils paarweise Vergleiche von MAP zur Kontrolle und MAA zur Kontrolle durchgeführt und die probe sets separat in Qualitätskategorien eingeteilt und gefiltert. Während dieser Auswertung kam es somit zu individuellen „Verlusten“

einiger Gene wenn z. B. zwischen den beiden durchgeführten Arrays oder innerhalb der probe sets Abweichungen detektiert wurden.

Für einen genauen Vergleich regulierter Genen nach einer Infektion mit MAP und MAA musste eine neuer Ansatz zur Auswertung gewählt werden. Dazu wurde ein seperater fold change im Hinblick auf die jeweilige Genexpression berechnet werden.

Denn der fold change bezieht sich immer auf einen Vergleich von zwei unterschiedlichen Proben.

In diesem direkten Vergleich wurden nach einer Infektion mit MAP im Vergleich zu einer Infektion mit MAA 731 Gene „stärker“ und 649 „schwächer“ exprimiert wurden.

Im Anhang ist eine Auswahl dieser differentiell regulierten Gene, die im Hinblick auf den aktivierten Makrophagen von Bedeutung in einer Entzündungsreaktion sind, tabellarisch aufgelistet (Tabelle 2). Dazu gehören Zytokine, Chemokine, Zytokin- und Chemokinrezeptoren und Proteine, die in Signaltransduktionskaskaden und transkriptionellen Ereignissen involviert sind.

Angegeben ist der fold change zwischen einer MAP und einer MAA Infektion (MAP/MAA) für zwei Arrayanalysen. Die Ergebnisse zeigen, dass MAA proinflammatorische Zytokine (IL-1α, IL-1β, TNF-α) und Chemokine (CXCL2) etwa 2-fach stärker induzierte als MAP. Gene für Rezeptoren oder Proteine der Signalvermittlung oder Transkription wurden nur sehr schwach (etwa <2-fach) reguliert. Dabei wurden sie zahlenmäßig in etwa gleichen Teilen durch MAP oder MAA stärker induziert oder supprimiert.

Da die Daten der im Anhang angegebenen Gene (Tabelle 2) z. T. große Schwankungen zwischen den Replikas zeigten und häufig in die qualitativ minderwertige Kategorie no change gruppiert wurden, erfolgte schließlich eine weitere Auswertung der ermittelten Arraysignale. Hierbei wurden im Vergleich zur oben eingesetzten Software ausschließlich Gene analysiert, die in keinem der beiden Replikas als no change deklariert wurden. Das bedeutet, dass probe sets mit inhomogenen Signalen herausgefiltert wurden. Es wurden also stringentere Kriterien für die Auswahl der probe sets angewendet, womit die Ergebnisse als eindeutig abgesichert und durch beide Arrays reproduzierbar anzusehen sind. Diese Kriterien gelten auch als Standard für eine Veröffentlichung der Versuchsdaten in international renommierten Wissenschaftsjournalen mit Gutachtersystem.

Für die durchgeführten Auswertungen bedeutete dies, dass sich die Anzahl regulierter Gene auf 613 auf- und 773 abregulierte Gene nach einer Infektion mit MAP im Vergleich zu unbehandelten Zellen reduzierte (Abbildung 19).

Abbildung 19. Anzahl regulierter Gene in RAW264.7 Makrophagen nach 24 h Infektion mit MAP oder MAA im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen (II). Es wurden RAW264.7 Makrophagen mit MAP oder MAA infiziert, bzw. nicht behandelt. Nach 24 h Inkubation wurde die RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben, markiert und mit dem GeneChip^® Mouse Genome 430A 2.0 Array hybridisiert.

Die Fluoreszenzsignale wurden normalisiert. Zur Auswertung wurden die Signale infizierter RAW264.7 Makrophagen in Relation zu denen der Kontrollzellen gesetzt. Die Graphik zeigt alle Gene, die in drei unabhängigen Infektionsversuchen auf zwei Arrays eine Induktion oder Abregulation im Vergleich zur Kontrolle aufzeigten. Probe sets der Kategorie no change wurden herausgefiltert. Dargestellt sind die Gesamtanzahlen der Gene mit einer Regulation von mindestens 1 fold, bzw. 5 fold im Vergleich zu unbehandelten Zellen.

Eine Infektion mit MAA induzierte 737 und supprimierte 932 Gene im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Anhand der Anzahl regulierter Gene konnte für MAA also eine

„intensivere“ Genexpression nachgewiesen werden. Unter Berücksichtigung des fold change regulierter Gene konnte darüber hinaus auch eine „intensivere“

Regulationintensität für induzierte Gene durch MAA nachgewiesen werden (MAA> 5 fold: 148 / MAP> 5 fold: 136). Interessanterweise wurden mehr Gene mit einer über 5-fachen Differenz durch MAP herunterreguliert (111) als durch MAA (62), jeweils im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Letztlich wurde für den direkten Vergleich der beiden Populationen wiederum ein seperater fold change von MAP und MAA infizierten RAW264.7 Makrophagen generiert. Mit diesen stringenten Auswertungskriterien konnten lediglich 19 Transkripte für 18 RNAs ermittelt werden, die nach einer Infektion mit MAP im Vergleich zu MAA differentiell reguliert wurden.

Diese sind in Tabelle 1 unter Angabe ihres fold change zwischen einer MAP und einer MAA Infektion (MAP/MAA) aufgelistet.

Tabelle 1: Vergleich der mRNA Expression differentiell exprimierter Gene in RAW264.7 nach 24 h Infektion mit MAP oder MAA.

Als Orientierungshilfe sind zusätzlich die jeweiligen signals für Kontrollzellen und infizierte Zellen und der daraus ermittelte Qualitätsparameter detection mit den Kategorien present (P), marginal (M) und absent (A) für zwei Arrayanalysen angegeben. Alle in Tabelle 1 dargestellten Gene waren durch MAP oder MAA im Vergleich zu Kontrollzellen induziert. Drei Gene wurden durch MAP etwa 1,5 bis 4-fach stärker induziert als durch MAA. Den Produkten dieser Gene (selenium binding protein 1/2 und G7e protein) konnte für Entzündungsreaktionen bisher keine relevante Funktion zugeschrieben werden.

Durch eine Infektion mit MAP wurden der IL-1 Rezeptor Anatogist (IL-1RA), die proinflammatorischen Zytokine IL-1α, IL-1β und TNF-α, das Chemokin CXCL2 (MIP-2) sowie der Wachstumsfaktor G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor;

CSF-3) schwächer induziert als durch MAA. Die Regulationsintensität lag bei 1,6 bis > 3-fach unter der Induktion durch MAA. Die am stärksten ausgeprägte Regulationsintensität durch MAP wurde bei IL-1β (bis zu 9,5-fach) detektiert.

Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass eine Infektion von RAW264.7 Makrophagen mit MAP oder MAA eine Regulation von über 1000 Genen induzierte.

In Abhängigkeit der genutzten Filter wurden durch beide Erreger im Vergleich zu Kontrollzellen jeweils ca. 1000 Gene aufreguliert und ca. 1230 Gene abreguliert. Die Regulationsintensität, d. h. der Expressionsunterschied zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen war sehr gering und lag für die Mehrheit regulierter Gene bei etwa 2-fach. Für die Routineanwendung im Labor wird ein Richtwert von größer gleich zwei einer differentiellen Genregulation als mutmaßlich gering fehlerbehaftet angegeben (LIPSHUTZ et al. 1999). Somit spielt bei Mikroarrayanalysen die Auswertung der Daten allgemein und die Einführung eines Schwellenwertes von 2-fach regulierten Genen eine große Rolle, um biologisch relevante Interpretationen zu ermöglichen.

In der vorgestellten Mikroarrayanalyse zeigte sich, dass mit den durchgeführten Analysen zunächst keine Aussagen zu paarweisen Vergleichen möglich waren.

Somit musste ein seperater, direkter Vergleich zwischen einer Infektion von RAW264.7 Makrophagen mit MAP oder MAA durchgeführt werden. Dieser Vergleich resultierte in 18 differentiell regulierten Genen mit einem marginalen Expressionsunterschied. Aufgrund der stringenten Auswerteanforderungen handelt es sich bei den Genen um verlässlich detektierte und korrekt abgelesene Transkripte

und können für eine Diskussion ihrer biologischen Funktionen und Auswirkungen auf die Zelle herangezogen werden.