Untersuchungen von RNA

B.2.4.1 Präparation von Poly(A)⁺-RNA

Die Präparation von Poly(A)⁺-RNA erfolgte nach der Methode von Rahmsdorf et al.

(1987) (RAHMSDORF et al. 1987). Hierzu wurden pro Versuchsansatz zwei bis drei große Kulturschalen mit je 1 x 10⁷ Makrophagen wie beschrieben stimuliert (B.2.2.2) und zu unterschiedlichen Zeitpunkten geerntet. Dazu wurden die Kulturschalen auf

Eis gestellt, die Zellen zweimal mit 10 ml eiskaltem PBS gewaschen und mit dem Zelllysepuffer SSTE (100 mM NaCl; 20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM EDTA, pH 7,5;

0,5% (w/v) SDS) abgeschabt. Zum Abbau von Proteinen wurde der Ansatz mit 6 µg Proteinase K bei 37°C für 30 min inkubiert und mit einer 19 G Kanüle viermal geschert. Nachfolgend wurde die Salzkonzentration auf 0,5 M NaCl eingestellt und gewaschene Oligo(dT)-Zellulose hinzu gegeben. Dazu wurden vorher jeweils 75 mg Oligo(dT)-Zellulose im Waschpuffer HSB (0,5 M NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 5 mM EDTA, pH 7,5; 0,1% (w/v) SDS) gemischt und bei 80 x g für 5 min pelletiert, zweimal mit ddH2O sowie einmal mit SSTE gewaschen und zuletzt in 1 ml SSTE suspendiert.

Die gewaschene Oligo(dT)-Zellulose wurde dann zu den Zelllysaten gegeben.

Während der ständigen Durchmischung für mindestens 16 h konnte die Poly(A)⁺-RNA an die Oligo(dT)-Zellulose binden und anschließend abzentrifugiert (80 x g für 4 min) und gewaschen werden. Viermal wurde das Oligo(dT)-Zellulose-Pellet in HSB zur Entfernung von tRNA, gRNA und Proteinresten und einmal in ddH2O vollständig suspendiert und durch Zentrifugation (80 x g für 4 min) pelletiert.

Die Elution der Poly(A)⁺-RNA erfolgte in drei Schritten mit ddH2O nach der beschriebenen Waschprozedur, wobei der Überstand mit der Poly(A)⁺-RNA gesammelt und anschließend bei 100 x g und 4°C für 10 min zentrifugiert wurde. Ein Aliquot der RNA wurde für die Konzentrationsbestimmung entnommen und der Rest bis zur Weiterverarbeitung bei –70°C gefällt (B.2.3.3.5).

B.2.4.2 Präparation von gRNA

Für die Präparation von gRNA wurde das RNeasy^® Mini Kit (H.4) nach den Angaben des Herstellers eingesetzt. Es vereint die Extraktion und Aufreinigung von gRNA über die Bindung an Silikamembranen mit einer DNase-Behandlung zur Eliminierung von Kontaminationen mit DNA.

Die Zellen wurden standardmäßig in einer 12-well Kulturplatte stimuliert (B.2.2.2) und anschließend mit eiskaltem PBS gewaschen und nach Angaben des Herstellers in Lysepuffer mit 1% (v/v) β-Mercaptoethanol abgenommen und mit einer 19 G Kanüle zehnmal homogenisiert. Nach einer Zugabe von 70% (v/v) Ethanol im gleichen Volumen erfolgte die Bindung der gRNA an die Membran der RNeasy^® Säulen, eine 20-minütige Behandlung mit DNase und die abschließende Elution mit ddH2O. Ein Aliquot wurde zur Konzentrationsbestimmung eingesetzt (B.2.3.3.2) und der Rest mit Ethanol gefällt (B.2.3.3.5).

B.2.4.3 Northern Analysen

Die präparierte RNA wurde für Genexpressionsuntersuchungen entweder in cDNA übersetzt (B.2.5.1) oder für Northern Analysen verwendet. Hierzu wurde die RNA zunächst im Agarosegel aufgetrennt. Da die als Einzelstrang vorliegende RNA zur Bildung von Sekundärstrukturen neigt, erfolgt die Elektrophorese von RNA stets unter denaturierenden Bedingungen mittels Formaldehyd oder wie in dieser Arbeit mit Glyoxal und Dimethylsulfoxid (DMSO). Die RNA liegt negativ geladen vor und bewegt sich im elektrischen Feld zur Anode. Somit werden die RNA Fragmente in der Agarosegelelektrophorese nach ihrer Molekülgröße aufgetrennt. Mit Hilfe von Ethidiumbromid, einer interkalierenden Substanz, werden die Nukleinsäuren bei Bestrahlung mit UV-Licht sichtbar. Die aufgetrennten Fragmente können durch einen Kapillarblot nach Southern (B.2.3.8) aus dem Agarosegel auf eine Nylonmembran transferiert, fixiert und mit verschiedenen Sonden hybridisiert werden.

B.2.4.4 Gelelektrophorese von RNA

Die Gelelektrophorese von glyoxaldenaturierter RNA erfolgte nach der Methode von Sambrook et al. (2001). Es wurden 4 µg Poly(A)⁺-RNA oder 15 bis 25 µg gRNA mit dem fünffachen Volumen an Glyoxalreaktionsmix (1,2 M Glyoxal; 60% (v/v) DMSO;

0,2 mg/ml Ethidiumbromid, 1,2 x BTPE; 4,8% (v/v) Glyzerol) gemischt, bei 55°C für 1 h denaturiert, auf Eis gekühlt (10 min), anzentrifugiert und mit 1/6-tel Volumen an Ladepuffer (50% (v/v) Glyzerol; 0,4% (w/v) Bromphenolblau) versetzt. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte über ein Agarosegel (1,5% (w/v)) in 1 x BTPE-Puffer (10 mM PIPES; 30 mM Bis-Tris; 1 mM EDTA, pH 8,0) bei 50 V (1 h) und 75 V (2 h). Zur Dokumentation wurde das Gel bei UV-Belichtung unter Berücksichtigung der beiden rRNA Fragmente von 1,874 kb und 4,718 kb analysiert und auf eine Nylonmembran transferiert.

B.2.4.5 Northern Blot

Beim Northern Blot werden im Agarosegel aufgetrennte RNA Moleküle (B.2.4.4) mittels Hochsalzpuffer durch einen Kapillarblot nach Southern (1975) auf eine Membran transferiert, fixiert und mit verschiedenen Sonden hybridisiert.

In dieser Arbeit wurde die RNA wie beschrieben aufgetrennt (B.2.4.4) und nach dem gleichen Prinzip wie der Southern Blot auf eine Nylonmembran transferiert (B.2.3.8).

Die anschließenden Hybridisierungen unterscheiden sich von DNA-DNA-Hybridisierungen und sind im folgenden Abschnitt beschrieben.

B.2.4.5.1 Hybridisieren und Waschen eines RNA Blots

Das Ziel dieser Hybridisierungsreaktionen ist der Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen. Eine denaturierte und markierte DNA Sonde wird zur denaturierten und an eine Matrix gebundene RNA gegeben. Enthält die DNA Sonde komplementäre Sequenzen zur immobilisierten Probe, kommt es während der Inkubation zu einer Hybridisierung (Basenpaarung). Nach stringenten Waschschritten zur Entfernung nicht- oder unspezifisch gebundener DNA Sonde von der Membran kann diese zur Autoradiographie (s. 2.2.4.1) eingesetzt werden (CHURCH u. GILBERT 1984). Es wurde nach einem modifizierten Protokoll von Church & Gilbert (1984) vorgegangen: die Nylonmembran wurde mit 2 x SSC befeuchtet und in 1 ml Hybridisierungspuffer (0,5 M Na2HPO4, pH 7,2; 1 mM EDTA, pH 7,5; 7% (w/v) SDS) pro 10 cm² Membranfläche bei 65°C für 2 h im Hybridisierungsofen prähybridisiert. Die radioaktiv markierte Sonde (B.2.3.7) wurde auf 2 bis 3 Mio cpm/ml eingestellt, zusammen mit 0,5 mg Hefe-tRNA und 0,25 mg SS-DNA bei 95°C für 10 min denaturiert und anschließend auf Eis gestellt. Der Prähybridisierungspuffer wurde gegen Hybridisierungspuffer (0,3 ml/10 cm² Membran) mit denaturierter Sonde getauscht und die Membran über mindestens 20 h rollend bei 65°C inkubiert. Nach erfolgter Hybridisierung wurde der radioaktive Puffer abgegossen. Um unspezifisch gebundene Sonde von der Nylonmembran zu entfernen, wurde die Membran einmal mit 50 ml Waschpuffer 1 (40 mM Na2HPO4, pH 7,2; 1 mM EDTA, pH 7,5; 5% (w/v) SDS) und dreimal mit 50 ml Waschpuffer 2 (40 mM Na2HPO4, pH 7,2; 1 mM EDTA, pH 7,5; 1% (w/v) SDS) bei 65°C für 15 min im Hybridisierungsofen gewaschen. Abschließend wurde die Nylonmembran in Frischhaltefolie gewickelt und zur Autoradiographie auf einem Röntgenfilm exponiert.

Um die RNAs hinsichtlich ihrer Quantität bei der Auswertung untereinander vergleichen zu können, wurde für die weiteren Hybridisierungen mindestens ein konstitutiv exprimiertes Gen als Kontrolle eingesetzt.

B.2.4.5.2 Entfernen der DNA-Sonden von der Nylonmembran

Die hybridisierten Nylonmembranen wurden zur Wiederverwendung durch zweimaliges Rütteln in kochendheißem SDS (0,1% (w/v)) für jeweils 5 min von der

gebundenen radioaktiv markierten DNA freigewaschen. Bis zur Rehybridisierung wurden die Membranen in Folie gewickelt und bei –20°C gelagert.