ZEA

Bei der Bestimmung des ZEA-Gehaltes in FM-Proben mittels HPLC betrug die Wiederfindungsrate bei einer Nachweisgrenze von 2,5 µg/kg Probenmaterial (ca. 88 % TS) über 90 %.

Für die Extraktion wurden 25 g der gemahlenen Probe in einen 500 ml Erlenmeyerkolben mit Gewinde eingewogen (Präzisionswaage, Fa. METTLER-TOLEDO, Gießen). Hinzu kamen 10 g Hyflo Super Cel® medium (Nr. 56678, Fa.

FLUKA, Deisenhofen).

Um der Affinität von ZEA zu alkalischen Substanzen entgegenzuwirken, musste die Probe mit 20 ml schwacher Phosphorsäure (0,33 mol/l) versetzt werden. Anschließend wurde die Probe nach Zulage von 250 ml Chloroform (puriss p.a., Nr. 25690, Fa.

FLUKA, Deisenhofen) 45 min auf einem Magnetrührer (Fa. GERHARDT, Bonn) gerührt und im Anschluss über einen mit etwa 15 g Na-Sulfat wasserfrei (Nr. 71962, Fa.

FLUKA) bestückten Faltenfilter (615 ¼, ø 185 mm, Fa. MACHEREY-NAGEL, Düren) ab filtriert, bis ein Aliquot von 200 ml gewonnen war.

Das Aliquot wurde zu Beginn der Aufreinigung in einen 500 ml Rundkolben überführt und das Chloroform bei einer Wasserbadtemperatur von 40 °C und einem Unterdruck von 250 mbar am Rotationsverdampfer (rotavapor R-114, Fa. BÜCHI, Schweiz;

Controller, Fa. VACUBRAND, Wertheim) abdestilliert.

Nachdem der Rückstand in 30 ml Chloroform aufgenommen worden war, wurde die Probe über einen Trichter in einen 250 ml Scheidetrichter überführt.

Nach Zulage von 1 g NaCl (purum p.a., Nr. 71381, Fa. FLUKA, Deisenhofen) und 20 ml Injektionsvolumen 100 µl

Flussrate 1,0 ml/min

Eluent

(Verlauf entlang eines Gradienten)

0.-12. min: 100 % Laufmittel B; 12.-15. min: Umstellung;

15.-30. min: 95 % Laufmittel A; 30.-33. min: Umstellung;

33.-35. min: 100 % Laufmittel B

Detektion UV-Detektion

Ex. 219 nm

Messdauer 51 min

p.a., Nr. 71692, Fa. FLUKA, Deisenhofen; Salzsäure: 1M, Nr. 109057, Fa. Merck, Darmstadt) konnte die Probe 3 min ausgeschüttelt werden.

Im Anschluss an die Phasentrennung wurde die untere Chloroformphase abgelassen, die wässrige Reagenzphase in einem separaten Becherglas zwischengelagert und die Chloroformphase nach Rückführung in den bereits vorhandenen Scheidetrichter ein weiteres Mal mit ZEA-Reagenz und NaCl ausgeschüttelt.

Die Chloroformphase konnte anschließend verworfen und die beiden Reagenzphasen im Scheidetrichter vereint werden.

Um die Reagenzphase rückstandslos in den Scheidetrichter überführen zu können, wurde das Becherglas mehrfach mit geringen Mengen Chloroform gespült und der Inhalt anschließend durch vorsichtiges Schwenken nochmals durchmischt, bevor die Chloroformphase endgültig verworfen wurde.

Dann konnte die Reagenzphase mit 3-5 Tropfen Phenolphtalein (1 % in Ethanol, Nr.

77620, Fa. FLUKA, Deisenhofen) versetzt und anschließend mit einer 0,6molaren Phosphorsäure (ortho- Phosphoräure, 85 %, purum p.a., Nr. 79623, Fa. Fluka, Deisenhofen) bis zur Farblosigkeit titriert werden.

Die angesäuerte Probe musste zurück in den Scheidetrichter überführt und insgesamt 3 x mit jeweils 10 ml Chloroform kräftig geschüttelt werden. Die Chloroformphasen wurden gesammelt, durch einen Phasentrennfilter (ZEA Hy 597, Fa. SCHLEICHER &

SCHUELL, Dassel) in 50 ml Spitzkolben filtriert und anschließend erneut bei 40 °C und 250 mbar bis zur Trockene eingeengt. Reste im Spitzkolben trockneten durch Abpusten mit Stickstoff (Fa. AIR LIQUIDE).

- zusätzliche Aufreinigung

In einigen Fällen war im Anschluss an das Einengen optisch erkennbar, dass das Ausgangsmaterial zu viele Verunreinigungen bzw. Farbstoffe (z.B. Hagebutten) enthielt.

Um während der Detektion das Ergebnis nicht zu verfälschen, war eine zusätzliche Aufreinigung unumgänglich.

Dazu fand eine DC-Karte (TLC Silicagel 60, 10 x 10 cm, Fa. MERCK) Verwendung. Auf einer Höhe von 1,5 cm wurde 1 cm entfernt vom linken Rand der Karte 5 µl des ZEA-Standards (100 mg/ml) durch mehrfaches punktförmiges Auftupfen aufgebracht. Auf gleicher Höhe, mit 1,5 cm Abstand zum ZEA-Standard und je 1 cm Abstand zueinander,

zeichnete man zur Orientierung 3 je 1 cm lange Bleistiftstriche nebeneinander an. Auf jeden der Striche brachte man gleichmäßig verteilt insgesamt 200 ml der Probe - die zuvor in 400 ml Ethanol im Ultraschallbad gelöst worden war - mit einer HPLC-Glasspritze auf die DC-Platte auf. Anschließend verbrachte man die Platte in eine Laufkammer. Als Laufmittel dienten 50 ml eines Chloroform/ Methanolgemisches (48,5/1,5; v/v). Die Laufhöhe erstreckte sich über 9 cm bis zum Kartenende. Nach einer kurzen Abdampfzeit fand unter UV-Licht im Bereich des potentiell kontaminierten Inhaltes der Probe anhand der Laufhöhe des Standards eine Markierung statt und das Kieselgel musste an dieser Stelle sorgfältig von der DC-Platte entfernt und in einem 20 ml Becherglas gesammelt werden. Die Probe wurde mehrfach mit je 2 ml Chloroform aus dem Kieselgel extrahiert und sodann über einen Schwarzbandfilter in einen 10 ml Spitzkolben filtriert. Das Chloroform konnte dann im Rotationsverdampfer bei 40 °C und 250 mbar eingedampft und die Lösungsmittelreste erneut mittels Stickstoff abgeblasen werden. Der Rückstand wurde in 200 µl HPLC-Laufmittel (MOH / Essigsäure 5%ig, 65/35, v/v) aufgenommen, im Ultraschallbad gelöst, in Gänze in einen Mikroeinsatz für Autosampler-Fläschchen überführt und in die HPLC verbracht.

Bei den übrigen Proben konnte der Rückstand in 400 µl HPLC-Laufmittel (65 % Methanol, für HPLC, Nr. 8402, Fa. MALLINCKRODT BAKER INC., Grießheim und 35 % Essigsäure (1%ig) reinst, 100%, Nr. 27225, Fa. RIEDLE-DE HAEN, Seelze) aufgenommen und im Ultraschallbad (Sonorex TK 30, Fa. BANDELLIN ELECTRONIC, Berlin) von der Kolbenwand gelöst werden.

Zur Analyse waren ca. 200 µl der Probe in einen Mikroeinsatz für Autosamplerfläschchen zu überführen und zur Analyse in die HPLC zu stellen.

Der Autosampler (SIL-10A XL, SHIMADZU, Duisburg) injizierte 20 µl der Probenlösung in die HPLC-Anlage.

Die Förderung der Probe und des Fließmittels (65 % Methanol und 35 % Essigäure;

5%ig) erfolgte mit konstanter Flussrate von 1 ml/min durch die Säulen (Vorsäule, Security Guard C18, 4x3 mm, Fa. PHENOMENEX; Säule, Security Guard HPLC Cartridge System_, Fa. PHENOMENEX). Nach Exzitation (Anregung) des ZEA bei einer Wellenlänge von 283 nm im Fluoreszensdetektor (RF 10 AxL, Fa. SHIMADZU,

Duisburg) fand die Messung der Emission bei 445 nm in der Fotozelle des Detektors statt.

Das Chromatogramm konnte unter Zuhilfenahme der Class-VP Chromatography Software von SHIMADZU erstellt werden.

Angaben zu den HPLC Bedingungen sind der folgenden Tabelle 32 zu entnehmen. Die Identifizierung des ZEA erfolgte anhand der Retentionszeiten des ZEA-Standards, der die Säulen vor den Proben durchlief. Der ZEA-Gehalt verhielt sich proportional zur Fläche des Peaks und war somit quantitativ bestimmbar.

Tabelle 32: HPLC-Bedingungen für die ZEA-Analytik