Von den zu färbenden Zellkulturen wurde vorsichtig das Medium abgesaugt und die Schale bzw. Platte zweimal hintereinander mit 1x PBS gespült. Die Fixierung der Zellen erfolgte mit 3,7 %igem Formalin für etwa 5 Minuten. In der Zwischenzeit wurde die Alcian-Blau-Lösung vorbereitet. Dazu wurden für 50 ml Endvolumen 21,7 ml Wasser mit 5 ml 0,5 %-iger Alcian-Blau-Lösung, 3,3 ml 3 molarem Natriumacetat sowie 20 ml 1 molarem Magnesium-Chlorid gemischt, entsprechend einer Endkonzentration von 0,05 % Alcian-Blau, 0,2 mM Na-Acetat und 0,4 mM MgCl2. Nach Absaugen des Formalins wurden die Zellen einmal mit dieser Lösung gespült, um Reste der Fixierung zu entfernen, und anschließend, mit der Färbungslösung bedeckt, über Nacht bei Raumtemperatur gefärbt. Am nächsten Tag folgte eine zweimalige Spülung mit Wasser und die frisch gefärbten Zellen konnten unter dem Mikroskop betrachtet und ggf. fotografiert werden.
3.12.2 Proliferationsassay
Da Kristallviolett alle im Lauf der Kultur von den Zellen gebildeten Matrixproteine unspezifisch anfärbt, konnte dieses als Marker für die Proliferation verwendet werden. Dafür war es nötig, die gesamte Platte für 15 Minuten mit einem Gemisch aus gleichen Teilen 3,7
%-igem Formaldehyd und 0,5 %-iger Kristallviolett-Lösung zu fixieren und gleichzeitig anzufärben. Nach Entfernung der Reste dieses Gemisches durch mehrmaliges intensives Spülen mit Wasser, wurde die frische Platte auf einem Lichttisch liegend fotografiert. Nach Zugabe eines Ethanol-Isopropanol-Gemisches löste sich die durch Wasser nicht zu lösende Farbe aus der Matrix wieder heraus, sodass anschließend eine Probe von 100 µl dieser Farbextraktionslösung in eine Kammer auf einer Multiwellplatte überführt und die Emission der gesamten Platte mit allen Proben im Titertek Multiscan Plus MK II durchgemessen werden konnte. Dazu wurde das Standardprogramm für 96-Well-Platten mit einem Filter, welcher ausschließlich für Licht der Wellenlänge 571 nm durchlässig war, verwendet.
3.12.3 Größenvergleiche zwischen den Kolonien in der Softagarose
Um eine quantifizierbare Größe für die in den Experimenten aufgetretenen Unterschiede in der Entwicklung und Differenzierung der Einzelkolonien unter den Bedingungen der jeweiligen Kulturmethode und/oder Cokulturkombination ermitteln zu können, wurden für den Größenvergleich pro Well bzw. pro unterschiedlichem Kulturansatz mindestens drei standardisierte Hellfeldfotos mit 20-facher Vergrößerung gemacht. Die Auswahl der Gesichtsfelder erfolgte jeweils nach dem Zufallsprinzip aus verschiedenen Bereichen der Kultur und bei Vorliegen einer ausreichend hohen Anzahl an Objekten erfolgte die
fotografische Dokumentation auf Filmen der Marke Kodak 200er ASA mit eingeschalteter Belichtungsautomatik. Die Fotos wurden alle im 13x15-Format entwickelt. Die Ermittlung der durchschnittlichen Größe der Kolonien in einer Schale erfolgte durch Ausmessung der auf diesen Fotos dargestellten Kolonien. Es wurden jeweils alle auf drei Fotos vollständig zu erkennenden Kolonien ausgemessen und die Werte in eine Tabelle im Tabellenkalkulationsprogramm Excel 7.0 eingetragen. Bei einer etwas geringeren Koloniedichte auf den einzelnen Ablichtungen wurden ggf. auch noch das 4. oder 5. Foto vermessen, um auf eine Gesamtanzahl von mindestens 100 ermittelten Werten zu kommen.
Mit Hilfe des Kalkulationsprogramms konnten die Mittelwerte, Standardabweichungen und standard errors of mean der Koloniegrößen für die einzelnen Experimentteile ermittelt werden. Die ermittelten Werte wurden in einem weiteren Schritt jeweils in Bezug gesetzt zu den Ergebnissen der in jedem Experiment mitgeführten Positivkontrolle in Form einer Cokultur mit NIH-3T3-LacZ. Dabei wurden die Messergebnisse für die mit LacZ cokultivierten Kolonien als Grenzmarke von 100 % gesetzt. Alle weiteren Ergebnisse in der Aufstellung und in der sich daraus ergebenden Grafik bezogen sich auf diesen über die einzelnen Experimente hin konstanten Wert.
Zur semiquantitativen, optischen Auswertung der Koloniegrößen wurden die Kulturen von zwei Personen unabhängig von einander in Bezug auf die Größe ihrer Kolonien (jeweils im Vergleich zu den mitgeführten LacZ-Kulturen) begutachtet. Die Ergebnisse wurden, wie im nachfolgenden Kapitel beschrieben, parallel zu der Fluoreszenz unter UV-Licht nach einem mehrstufigen Kreuzchenschema eingeteilt und in den unten gezeigten Tabellen dokumentiert.
3.12.4 Vergleich der Leuchtintensität der EGFP-exprimierenden Kolonien Zur Quantifizierung der Grünfluoreszenz wurden verschiedene Verfahren getestet.
Zunächst wurde eine direkte Messung der Emission im Fluorometer RF-5001 PC von Shimadzu, welches mir dankenswerterweise in der Abteilung Pharmakologie von Professor Beil zur Verfügung gestellt wurde, versucht. Dafür waren allerdings die Mengen an EGFP und die damit verbundene Emission für eine Messung zu gering. Ein Vergleich der Emission unterschiedlich kultivierter Zellen in den Wells einer Platte war dadurch trotz unterschiedlicher Ansätze nicht möglich.
Außerdem wurden Messungen der unmittelbaren Zu- oder Abnahme des EGFP-Anteils innerhalb eines Zellkonglomerats im zeitlichen Verlauf unter Zuhilfenahme des Mikroskops AxioVert 135 von PTI unternommen, an dem die Messungen freundlicherweise von Dr. Mark Wahring übernommen wurden. Zwar waren Unterschiede in der Leuchtintensität über die Zeit messbar, doch verhinderte auch hier die lange Halbwertszeit des EGFP und der sehr lange Zeitraum, in dem die Zellen unter unsterilen Bedingungen gehalten werden mussten, die Möglichkeit, beobachtete Veränderungen bis zum Erreichen eines Plateaus weiterzuverfolgen.
Deshalb wurde für die Auswertungen dieser Experimente ebenfalls ein semiquantitatives Verfahren gewählt, bei dem die Ergebnisse in einer dem Größenvergleich entsprechenden Skala ermittelt und dokumentiert wurden. Diese Bewertungen wurden durch die Anfertigung von UV-Licht-Fotos unterstützt und gefestigt.
Größe: Grünfluoreszenz:
∅∅
∅∅ nicht vorhanden
+ sehr kleine Kolonien nur ganz schwach
++ mittelgroße Kolonien starke Fluoreszenz
+++ sehr große Kolonien sehr starkes Leuchten ggf. auch +(+) oder ++(+) für entsprechende Äquivalente
Abbildung 3: Beispielhafte Bewertungstabelle für die relative Koloniegröße und die Intensität der Grünfluoreszenz
Nach diesem einfachen Schema wurde am Ende jeden Experiments der semiquantitative Gesamteindruck für die Grünfluoreszenz in jedem einzelnen Ansatz bzw. jedem einzelnen Well jeweils in Bezug auf die mitgeführte LacZ-Kontrolle ermittelt und dokumentiert.
Dadurch ergaben sich jedoch für die meisten der durchgeführten Cokultur-Kombinationen (z. B. für die Kombinationen aus Wnt5a, -7a und -11) und Experimentansätze (z. B. für Wnt5a und Wnt7a mit unterschiedlichen PKc-Inhibitoren und -Aktivatoren) jeweils nur eine geringe Anzahl von Einzelbewertungen. Hierbei war bei Bewertung von Erstexperiment und Folgeexperimenten zumeist von n = 3 bzw. bei Doppelbewertung durch zwei Personen von n = 6 auszugehen. Zudem erfolgte die Einteilung in einem letztendlich recht groben Raster mit einem Bewertungsspielraum von 0 bis 3 Kreuzen/Punkten. Für die statistische Auswertung und Darstellung dieser Daten ergab sich hieraus jedoch die Schwierigkeit, eine geeignete Darstellungsform zu finden, die dem Betrachter ein einfaches und schnelles Erfassen ermöglicht. Nach mehreren Versuchen anderer Darstellungsformen (u. a. der direkten Abbildung des Kreuzchenschemas) wurde analog zur Darstellung der Koloniegrößen ebenfalls die Abbildung in Form von Säulendiagrammen gewählt. Die statistische Auswertung ergab jedoch aufgrund der eher geringen Einzeldaten z. T. eine sehr große Spannbreite bei den Standardabweichungen, die sich nach Umrechnung in relative Prozentangaben in noch größeren Einzelzahlen ausdrückte. So hatten in der überwiegenden Zahl der Fälle die Einzelteile der Experimente bei gleichbleibender Bewertung einen Standard error of mean von Null, in Einzelfällen bei stark abweichender Ausprägung der Grünfluoreszenz aber auch bis zu 50. Im Vergleich hierzu erbrachte die Ausmessung der
Größe:
Koloniegröße jeweils mehr als hundert Einzeldaten pro Experiment und Well, so dass in der Gesamtheit der Daten auch statistisch aussagekräftige Standardabweichungen ermittelt werden konnten. Für die aufgeführten grafischen Darstellungen der Grünfluoreszenz (im Einzelnen Abb. 5, 7, 9, 11, 13 und 15) wurde daher jeweils ganz bewusst auf die Angabe einer Standardabweichung verzichtet.
3.12.5 Luziferaseaktivitätsmessung
Am Ende der Kulturzeit wurden die zu messenden Zellproben durch Absaugen des Mediums und zweifaches Spülen mit 1x PBS für die Luziferasemessung vorbereitet. Das 5x Cell Culture Lysis Reagenz wurde mit dem vierfachen Volumen an dd Wasser aufgefüllt und auf die zu lysierenden Zellen gegeben (100 µl pro Well auf einer 6-Well-Platte). Um eine gute Durchmischung zu erreichen, wurde das entstandene Lysat mehrfach auf- und abpipettiert und anschließend als Proben von jeweils 50 µl in vorher beschriftete Polystyreneröhrchen überführt. Es folgte die Messung dieser Proben der Reihe nach im Auto Clini Lumat LB952T der Firma Berthold mit automatischer Zugabe des im Luziferase Assay Puffer gelösten Luziferase Assay Substrates. Die ausgedruckten Messdaten konnten in den Computer eingegeben und statistisch ausgewertet werden.
3.12.6 Fotodokumentation der Zellkulturexperimente
Zur Auswertung und Dokumentation wurden die Ergebnisse aller erfolgreichen Experimente durch Fotos festgehalten. Dazu wurden nach standardisiertem Verfahren Kodak-Filme mit einer Cosina CT-1 Kamera belichtet. Diese Kamera ließ sich auf den Konus an dem verwendeten Mikroskop AxioVert 100 von Zeiss schrauben und lieferte damit Fotos, die einem rechteckigen Ausschnitt des eingestellten Gesichtsfeldes entsprachen. Für die Hellfeld-Fotografie einer Zellkultur wurden Filme mit 200 ASA verwendet, die mit Hilfe der eingebauten Belichtungsautomatik bei einer Lichtintensität der Stufe 5 am Regler des Mikroskops belichtet wurden. Für die Fotografie EGFP-exprimierender Zellen unter Bestrahlung mit UV-Licht von der an das Mikroskop angeschlossenen UV-Lichteinheit HBO 50/AC wurden Filme mit einer Lichtempfindlichkeit von 800 ASA verwandt. Mit Hilfe eines zwischengeschalteten Filters (FT510), der selektiv nur Licht im Bereich einer Wellenlänge von 450-490 nm passieren ließ, wurde das sichtbare Licht gegenüber dem gewünschten UV-Licht abgefangen. Die Filme wurden durchgängig mit einer Belichtungszeit von 20 Sekunden im Dunkelfeld belichtet. Die jeweils parallel zum Vergleich angefertigten Hellfeldfotos desselben Gesichtsfeldausschnitts wurden wie oben beschrieben mit Belichtungsautomatik bei gleicher Vergrößerung angefertigt. Die Reihenfolge der aufgenommenen Bilder wurde in Listen festgehalten, um eine spätere Beschriftung und Zuordnung der Fotos zu den entsprechenden Experimenten zu ermöglichen.
4 Ergebnisse
4.1 Ergebnisse zu Teil 1 der Arbeit: Herstellung und Charakterisierung