3.11.10.1 Stabile Transfektion des Tetracyclintransaktivators (tTA) in RCJ-Zellen
Das Plasmid pUHD15.1, welches den tet-Transaktivator enthält, wurde zunächst in Anwesenheit des Hygromycin B-Resistenzplasmids mittels Clonfektin cotransfiziert (s. hierzu auch die genauere Beschreibung im Kap. 3.11.6.2) und die entstandenen stabilen Zellklone wurden anschließend durch Zugabe von Hygromycin B in einer Dosierung von 200 mg/ml selektioniert. Dieser Selektionsdruck durch das Hygromycin wurde auch in den darauffolgenden Experimenten durchgehend fortgesetzt. Die so neu entstandenen Zellklone wurden mit R-tTA und der jeweiligen Nummer des Selektionswells betitelt, jeweils als Stocks für spätere Verwendung eingefroren und parallel zur sofortigen Verfügung auf größeren Schalen vermehrt.
3.11.10.2 Charakterisierung der Stammzelllinien R-tTA-12, -17, -18, -21, -24, -28, -30 und -31
Die Zellen der R-tTA-Stammreihen, die durch die bereits vorausgegangene stabile Transfektion des Plasmides pUHD15.1 in die RCJ3.1(C5.18)-Mutterzellen entstanden waren, wurden vor der weiterführenden Transfektion mit dem Plasmid pBI-EGFP/Luc auf die Erhaltung ihrer Fähigkeit zur Differenzierung in Richtung Knorpelzellen getestet. Kollagen Typ II, welches während der Differenzierung von den chondrogenen Zellen produziert wurde, diente nach Anfärbung mit Alcian-Blau als Marker für die erfolgte Produktion von Knorpelmatrix. Pro Zelllinie wurden drei 50-mm-Schalen mit CAG beschichtet und jeweils eine Million Zellen pro Schale ausgesät. Nach einwöchiger und vierzehntägiger Kultur auf Kollagenagarose wurden dann die Zellen mit Formalin fixiert, mit Alcian-Blau gefärbt und unter dem Mikroskop ausgezählt. Festgehalten wurde jeweils die Dauer der Kultur, die Anzahl der insgesamt ausgewerteten Kolonien pro Schale sowie die Anzahl der am Ende blau gefärbten Kolonien. Aus diesen Angaben wurde der prozentuale Anteil der blauen und damit differenzierten Knorpelknötchen nach einer und nach zwei Wochen ermittelt.
3.11.10.3 Testung der zytotoxischen Eigenschaften von Neomycin auf R-tTA-Zellen Da die Stammzellen der R-tTA-Reihe, in welche der tet-Transaktivator stabil integriert war, bereits eine Resistenz gegen Hygromycin B aufwiesen, musste für die erneute Transfektion ein anderes Antibiotikum ausgesucht und seine zytotoxische Potenz ermittelt werden. Das Plasmid pBI-EGFP/Luc selbst weist keine in den Vektor integrierte Resistenzcodierung auf, weshalb sich ein Cotransfer mit einem Neomycinresistenz vermittelnden Plasmid anbot.
G418 (Neomycin) wirkt als Aminoglykosid unabhängig von Hygromycin durch Interaktion mit der 30 S-Untereinheit der Ribosomen. Indem an die mRNA nicht mehr die richtigen t-RNA-Moleküle angekoppelt werden, ergeben sich Fehler bei der Translation.
Um die für eine sichere Selektionierung nötige Konzentration an Neomycin zu ermitteln, wurden die R-tTA-Zellen analog zur Austestung der zytotoxischen Eigenschaften des Hygro-mycin B ebenfalls in einer Standardreihe mit aufsteigenden Antibiotikakonzentrationen für mindestens vierzehn Tage kultiviert. An jedem dritten Tag erfolgte ein Mediumwechsel mit anschließender Neuzugabe von Neomycin. Für die Standardreihe wurden Stocks von G418 (Neomycin) angelegt, welche nach Zugabe zum Medium in den entsprechenden Wells Endkonzentrationen von 10, 100, 200, 500 und 1000 µg/ml ergaben. Als Positivkontrolle wurde jeweils eine Spalte ohne Zusatz von Antibiotikum parallel mitgeführt.
3.11.10.4 Transfektion des Plasmides pBI-EGFP/Luc in die unterschiedlichen Klone der R-tTA-Zellen
Das linearisierte Plasmid pBI-EGFP/Luc wurde zusammen mit dem Neomycin-Resistenz-plasmid pSV2-neo unter Verwendung von Clonfektin-Reagenz nach und nach stabil in alle Klone der R-tTA-Reihe transfiziert. Zur Selektionierung stabiler Klone und zur Aufrechterhaltung des Selektionsdrucks während längerer Kultur wurde G418 (Neomycin) in der Konzentration von 200 µg/ml verwandt. Die aus dieser Transfektion hervorgegangenen Zellklone, welche während ihrer Differenzierung anfingen, EGFP zu produzieren, wurden daraufhin auf ihre chondrogenen Eigenschaften und auf die gleichzeitige Expression von Luziferase untersucht.
3.11.10.5 Trennung EGFP-regulierender von nicht regulierenden Zellen
Während der Experimente zur Ermittlung der Luziferaseaktivität wurde auf jeder Spalte einer 24-Well-Platte die selbe Anzahl Zellen eines Subklons ausgesät. Die unteren zwei Reihen der Platte wurden während der Kultur mit einem Zusatz von 10 µg Tetracyclin pro ml Medium versehen. Vor der Lysierung der Zellen für die Luziferasemessung wurden die Wells einer jeden Platte zunächst betrachtet und ihre EGFP-Expression anhand der sichtbaren Fluoreszenz bei Bestrahlung mit UV-Licht bewertet. Dabei wurde sowohl die EGFP-Expression als auch die Regulation dieser Expression im Vergleich zwischen den Tetracyclin freien Wells der oberen zwei Reihen und den mit Tetracyclinzusatz kultivierten Wells der unteren zwei Reihen einer jeden Platte festgestellt und tabellarisch dokumentiert.
3.11.10.6 Subklonierung besonders stark leuchtender Zellklone
Um eine möglichst homogene Population Luziferase- und EGFP-produzierender Zellen zu erlangen, wurden in weiteren Selektionsschritten stark leuchtende von nicht leuchtenden Zellen innerhalb einer polyklonalen Population getrennt. Dazu wurden sterile Multiwellplatten mit 96 Wells vorbereitet, indem die Wells jeder zweiten Reihe vollständig mit Medium gefüllt wurden. Mit dieser Maßnahme sollte die Verdunstung während der anschließenden Kultur möglichst gering gehalten werden. Pro Experiment wurden je nur zwei Klone der R-tEL-Reihe (R-tEL-12, -18, usw.) subkloniert, um eine Gefährdung der Ergebnisse durch lange Bearbeitungszeiten zu vermeiden. Die trypsinierten und gespülten Zellen wurden zu einem Pellet herunter zentrifugiert, in sehr wenig neuem Medium gelöst und gezählt. Anschließend wurden sie so in vorbereitetem Medium verdünnt, dass rechnerisch nur 4 Zellen auf einen Milliliter Medium kamen. Dieses vorbereitete Medium enthielt bereits entsprechend Hygromycin B und Neomycin. Mit dieser neuen Zellsuspension wurden nun die verbleibenden Reihen auf den 96-Well-Platten mit 200 µl/Well gefüllt. Je nach Anzahl der gemeinsam gepickten Kolonien, welche am Ende der Selektionierung zusammengefügt worden waren, wurden jeweils 12 solcher Wells pro Kolonie angelegt. Es folgte eine 14-tägige Kultur ohne weitere Behandlung. Nach dieser Kulturzeit, in welcher sich aus den vereinzelten Zellen Kolonien entwickeln konnten, wurden die beimpften Reihen unter dem Mikroskop betrachtet. Da in diesem Experiment kein Tetracyclin eingesetzt wurde, konnten die leuchtenden Kolonien unter dem Mikroskop gut identifiziert werden, auf dem Deckel markiert und anschließend vorsichtig in größere Wells überführt werden. Durch diese Methode ergaben sich Subklone der Zelllinien, z. B. R-tEL-12.1 bis R-tEL12.30, mit einem wesentlich größeren Anteil an EGFP-exprimierenden Zellen. Die weiteren Luziferasemessungen unter Tetracyclinregulation wurden mit den Zellen dieser Subklone durchgeführt.
Die Kolonien der Linie R-tEL-24 wurden bereits von Anfang an nach der Selektionierung einzeln in jeweils separate Schalen überführt.
3.11.10.7 Ermittlung einer Tetracyclinstandardkurve
Die Klone, in welche das Plasmid pBI-EGFP/Luc stabil unter die Regulation durch den Tetracyclintransaktivator transfiziert wurde, sollten mit Hilfe einer Tetracyclinstandardreihe auf ihre Regulationsfähigkeit in Bezug auf die Expression von EGFP und Luziferase getestet werden. Dazu wurde zunächst eine Verdünnungsreihe angelegt, bei der das Tetracyclin anfangs in einem 50x Stocks vorlag. Durch Verdünnung mit sterilem dd Wasser wurden daraus Stocks erstellt, die Tetracyclin in einer Konzentration von 50 µg/ml, 15 µg/ml, 5 µg/ml, 1,5 µg/ml und 0,5 µg/ml enthielten. Auf einer beschrifteten 24-Well-Platte wurden die zu untersuchenden Klone mit einer Dichte von 100.000 Zellen pro Well ausgesät (Alle Messungen erfolgten jeweils in Doppelbestimmungen.). Zu den vorgelegten 500 µl Medium in den einzelnen Wells kamen jeweils 10 µl eines Stocks aus der Verdünnungsreihe, so dass sich am Ende eine Spalte der Platte ohne jegliche Zugabe von Tetracyclin und je eine Spalte mit einer Endkonzentration von 10, 30, 100, 300 und 1000 ng Tetracyclin/ml Medium ergaben. Diese Kulturen wurden für 5 Tage mit täglichem Mediumwechsel und frischem Zusatz der jeweils entsprechenden Menge an Tetracyclin fortgeführt. Am letzten Tag wurden die Zellen zunächst unter dem Mikroskop begutachtet und die EGFP-Intensität sowohl tabellarisch als auch fotografisch festgehalten, sodann wurden die Kulturen lysiert und ihre Luziferaseaktivität gemessen. Dabei wurde jeweils in Doppelbestimmungen die Aktivität der ohne Tetracyclin kultivierten gegenüber den mit Tetracyclin kultivierten Zellen einer Zelllinie
gemessen. Für Subklone, welche bei der ersten Bestimmung überhaupt keine Expression von Luziferase zeigten, wurden im Folgenden keine Wiederholungsmessungen durchgeführt.
Zum Vergleich der Einzelexperimente miteinander wurden die jeweiligen Maximalwerte der Positivkontrollen der einzelnen Klone mit 100 Prozent gleichgesetzt und die ermittelten downregulierten Messwerte dazu in Beziehung gesetzt. Der angegebene Quotient stellte somit die Relation zwischen den Messergebnissen für die ohne Tetracyclin kultivierten Zellen gegenüber den Ergebnissen für die mit Tetracyclin behandelten Zellen dar.
3.12 Versuchsauswertung und Dokumentation