Softagarkulturen von R-Coll(II)-EGFP-5 in Cokultur mit Monolayern aus Kombinationen von NIH-wnt7a, NIH-LacZ und sFRP2

Die neue Zelllinie sFRP2 sezernierte Fragmente der äußeren Domäne des Wnt-Rezeptors, durch welche die Wnt-Rezeptoren auf der Oberfläche der R-Coll(II)-EGFP-5-Zellen spezifisch besetzt und damit in ihrer Funktion blockiert werden sollten. Über diesen Mechanismus sollten wiederum die Einflüsse der von den NIH-3T3-wnt7a-Zellen sezernierten Faktoren auf die R-Coll(II)-EGFP-5 aufgehoben werden.

Dazu wurden die sFRP2-Zellen in 10-fachem Überschuss zu den NIH-wnt7a- bzw. zu den NIH-LacZ-Zellen (als Positivkontrolle) beim Anlegen der Platten in die Monolayer eingebettet.

Die mit diesen gemischten Monolayern cokultivierten R-Coll(II)-EGFP-5-Zellen zeigten allerdings eine etwas andere Entwicklung als erwartet. So ließ die Kombination von NIH-wnt7a mit NIH-LacZ die Kolonien im Softagar nur halb so groß werden wie die Kolonien über einer reinen NIH-LacZ-Kultur. Die Kombination LacZ/sFRP2 brachte Kolonien mit einer durchschnittlichen Größe von weniger als einem Viertel, Wnt7a/sFRP2 sogar von ungefähr einem Sechstel der ursprünglichen Durchschnittsgröße hervor. Die sFRP2-Zellen hatten nach diesen Experimenten einen gegensätzlichen Einfluss auf die R-Coll(II)-EGFP-5-Zellen ausgeübt als nach der Beschreibung ihrer Proteinsynthese zunächst zu erwarten war.

Diese unerwarteten Eigenschaften des Zellklons sFRP2 sollten sich in den weiter folgenden Experimenten immer wieder bestätigen. Demnach hatten sFRP2-Zellen einen ähnlich stark hemmenden Einfluss auf die Proliferation der EGFP-sezernierenden Zellen wie die Zellen des Klones NIH-wnt7a.

Abbildung 6: Koloniegröße von R-Coll(II)-EGFP-5-Zellen in Softagarkultur über den angegebenen Monolayern, bzw. Monolayer-Kombinationen. Dabei sind die Zellen der Linien NIH-wnt7a und -LacZ im gleichen Verhältnis zueinander, aber im Verhältnis 1/10 mit sFRP2 gemischt.

Auch in der Auswirkung auf die Grünfluoreszenz der cokultivierten Zellen ergab sich ein eher unerwartetes Bild. So zeigte bereits die Kombination von LacZ-Zellen mit sFRP2-Zellen eine Reduktion der Intensität auf etwa ein Drittel der Referenzschalen. Die deutlichste Abnahme der EGFP-Expression bewirkte jedoch die Kombination von wnt7a- und sFRP2-Zellen, wobei die sichtbare Grünfluoreszenz auf einen Bruchteil der ursprünglichen Intensität abnahm bzw. größtenteils ganz eingestellt wurde.

Größenvergleich: Softagarkulturen von R-Coll(II)-EGFP-5 über kombinierten Monolayer von NIH-LacZ, -wnt7a und sFRP2

0 20 40 60 80 100 120

LacZ LacZ +Chlorat Wnt7a/LacZ Wnt7a/LacZ +Chlorat LacZ/sFRP2 LacZ/sFRP2 +Chlorat Wnt7a/sFRP2 Wnt7a/sFRP2 +Chlorat

Monolayer(kombinationen)

Größe in Prozent (LacZ=100%)

Abbildung 7: Dargestellt ist die relative Intensität der Grünfluoreszenz der R-Coll(II)-EGFP-5-Kolonien über den Monolayern der oben genannten Zelllinien. Die Kolonien über dem reinen NIH-LacZ-Monolayer wurden als Kontrolle benutzt und ihre Intensität mit 100 % gleichgesetzt.

4.2.5 Softagarkulturen des Klones R-Coll(II)-EGFP-5 mit Monolayern von NIH-LacZ, sFRP2 und allen sieben NIH-wnt-Klonen

Als Weiterführung der bisherigen Experimente wurden anschließend über den Monolayern aller sieben NIH-wnt-Klone Softagarkulturen mit R-Coll(II)-EGFP-5-Zellen angelegt. Zur Kontrolle und zum Vergleich wurden wiederum parallel Ansätze mit Monolayern aus NIH-LacZ- und sFRP2-Zellen mitgeführt.

Die Zellen aller sieben Wnt-Klone übten einen deutlichen Einfluss auf die Entwicklung der cokultivierten Zellen aus. Die Klone NIH-wnt1, -wnt3a, -wnt4, -wnt7b sowie der bereits genannte NIH-wnt7a-Klon hemmten die Proliferation und die Differenzierung auf ein Viertel bis ein Fünftel des Vergleichswertes. Ebenso wurde der hemmende Effekt der sFRP2-Zellen erneut belegt. Ein anderes Ergebnis dagegen brachten die Wells mit den Klonen NIH-wnt5a und -wnt11 als Monolayer, bei denen sich eine Steigerung der Proliferation und eine daraus resultierende Größenzunahme der Kolonien nachweisen ließ.

Der Zusatz von 30 mM Chlorat zum Medium erbrachte für die Kolonien über den NIH-LacZ-Zellen keinen großen Unterschied in ihrer Einflussnahme auf die eingegossenen Kolonien. Dies gilt ebenso für die fünf der sieben Zelllinien, welche stark hemmend auf die Proliferation der R-Coll(II)-EGFP-5-Zellen wirkten, denn auch bei diesen bewirkte der Zusatz von Chlorat nur geringe Änderungen im Vergleich zu den ohne Chlorat geführten Kulturen.

So waren die ermittelten Koloniegrößen von R-Coll(II)-EGFP-5 im Vergleich zwischen den jeweils mit und ohne Chlorat kultivierten Zellen eines NIH-wnt-Monolayers nahezu gleich.

Für die beiden Klone NIH-wnt5a und -wnt11 zeigte sich jedoch eine deutliche Abnahme der proliferationssteigernden Effekte z. T. über die Maße hinaus bis in den hemmenden Bereich hinein.

Grünfluoreszenz: Softagarkulturen von R-Coll(II)-EGFP-5 über kombinierten Monolayern von NIH-LacZ, -wnt7a und sFRP2

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

LacZ LacZ + Chlorat Wnt7a/LacZ Wnt7a/LacZ + Chlorat LacZ/sFRP2 LacZ/sFRP2 + Chlorat Wnt7a/sFRP 2 Wnt7a/sFRP 2 + Chlorat

Monolayer(-kombinationen)

relative Intensität in Prozent (LacZ=100%)

Abbildung 8: Darstellung des Größenvergleichs der Kolonien über allen sieben Wnt-Zelllinien jeweils mit und ohne Zusatz von 30 mM Chlorat in das Kulturmedium. Die dunklen Balken stellen die Ergebnisse für die Kulturen mit Chloratzusatz dar.

Die ebenfalls beobachteten Einflüsse der NIH-wnt-Monolayer auf die EGFP-Expression der jeweils über dem Monolayer cokultivierten Softagarkolonien sind in der unten dargestellten Abbildung wiedergegeben. So hemmten die Klone NIH-wnt1, -wnt3a, -wnt4, -wnt7a und auch -wnt7b nicht nur das Wachstum der Kolonien, sondern bewirkten auch eine Reduktion der EGFP-Expression. Dabei hemmten Monolayer der Zelllinie NIH-wnt7a ebenso wie Monolayer von sFRP2 die Ausprägung der Grünfluoreszenz am meisten. Aber auch die anderen Zelllinien verringerten die Intensität des Leuchtens der Softagarkolonien deutlich. Ob die NIH-wnt5a und -wnt11-Zellen die Expression von EGFP ebenfalls über das Maß der NIH-LacZ-Zellen hinaus stimulierten, war bei den z. T. bereits sehr stark leuchtenden Kolonien schwer zu beurteilen und daher nicht ganz zu klären.⁴³

Der Zusatz von 30 mM Chlorat zum Kulturmedium bewirkte eine bei allen NIH-wnt-Klonen zu beobachtende Steigerung der EGFP-Expression. So waren die in der Chlorat freien Kultur beobachteten Effekte bei sFRP2, Wnt1, Wnt7a und Wnt7b wieder vollständig aufgehoben und speziell bei Wnt5a deutlich über die Intensität von den mit LacZ-Zellen cokultivierten Zellen hinaus gesteigert.

43 Vergleiche mit Fotodok. 6.5-6.14 im Kapitel 6.

Größenvergleich: Softagarkulturen von R-Coll(II)-EGFP-5 über Monolayern der sieben NIH-wnt-Klone sowie von NIH-LacZ und sFRP2

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

sFRP2 sFRP2 + Chl. LacZ LacZ + Chl. Wnt1 Wnt1+ Chl. Wnt3a Wnt3a + Chl. Wnt4 Wnt4 + Chl. Wnt5a Wnt5a + Chl. Wnt7a Wnt7a + Chl. Wnt7b Wnt7b + Chl. Wnt11 Wnt11 + Chl.

Monolayerkulturen mit und ohne Zusatz von Chlorat

Größe in Prozent (LacZ=100%)

Abbildung 9: Darstellung der relativen Intensität der Grünfluoreszenz, wobei den bereits oben beschriebenen Daten für alle NIH-wnt-Monolayer die entsprechenden Beobachtungen bei Zusatz von 30 mM Chlorat gegenübergestellt wurden ( Helle Balken = ohne Chloratzugabe, dunkle Balken = mit 30 mM Chlorat. Auf die Angabe von Standardabweichungen wurde auch in dieser Darstellung aufgrund des zugrundeliegenden Bewertungsschemas und der verhältnismäßig geringen Zahl der Einzeldaten in dieser Abbildung bewusst verzichtet. Vergleiche hierzu auch die Erklärung im Kapitel 3.12.4 Absatz 3.)

4.2.6 Softagarkulturen mit kombinierten Monolayern aus NIH-wnt5a, -wnt7a,