3.11.9.1 Transfektion des Plasmides pColl(II)-EGFPpolyA in RCJ-Zellen
Das Plasmid pColl(II)-EGFPpolyA wurde nach seiner Linearisierung zusammen mit dem Hygromycin B-Resistenzplasmid pTK-Hyg unter Verwendung von Clonfektin-Reagenz stabil in RCJ-Zellen cotransfiziert. Zur Selektionierung stabiler Klone und zur Aufrechterhaltung dieses Selektionsdrucks während längerer Kultur wurde Hygromycin B in der Konzentration von 200 µg/ml verwandt. Die aus dieser Transfektion hervorgegangenen Zellklone, welche während der Differenzierung zusammen mit der Bildung von Kollagen Typ II auch EGFP produzierten und damit anfingen unter UV-Bestrahlung grün zu leuchten, wurden nach ihren Wells nummeriert und benannt.
3.11.9.2 Anlage einer CAG-Kultur
Zur Anlage der CAG-Kulturen wurden zunächst 1,6 g LMP-Agarose in eine saubere, kleine Flasche abgewogen, mit 100 ml Wasser aufgefüllt, im Autoklaven sterilisiert und anschließend gut verschlossen gelagert.
Bei Bedarf wurde die Agarose in der Mikrowelle bis auf etwa 45 °C erhitzt und durch Schütteln gut durchmischt. In einem sterilen Röhrchen wurde die lauwarme LMP-Agarose im Verhältnis 1:1 mit Kollagen (Vitrogen 100) gemischt und dünn auf die vorbereiteten Platten aufgebracht. Für eine 35-mm-Schale bzw. das entsprechende Well auf einer 6-Well-Platte wurden dabei 500 µl Agarose-Kollagengemisch benötigt. Die Platten wurden zum vollständigen Aushärten der Agarose für eine halbe Stunde auf Eis gelagert. Anschließend wurden die Reste der Säure, in welcher das Kollagen gelöst war, durch Spülen der Platte mit Medium entfernt. Auf die so vorbereitete Agaroseschicht konnten jetzt je nach Experimentansatz die entsprechenden Zellen gegeben und weiterhin wie oben beschrieben kultiviert werden. Bei einem Mediumwechsel musste das alte Medium mit besonderer Vorsicht abgesaugt werden, um eine Beschädigung der Agaroseschicht zu vermeiden.
Für die Cokulturexperimente, in denen die CAG-Schicht zur Trennung der unterschiedlichen Zelllinien diente, wurden die Zellen für den unteren Monolayer am Vortag gesplittet und in der jeweiligen Schale ausgesät, um ihnen über Nacht die Möglichkeit zum Anheften an den Boden der Platte zu geben. Das Auftragen der Kollagenagarose fand genau nach obiger Vorgehensweise statt, nur mit der Modifikation, dass die Platten für eine kürzere Zeit zum Aushärten aufs Eis gestellt wurde, damit die Zellen unter der Agarose nicht austrockneten. Nach nur etwa fünf Minuten wurde bereits vorsichtig frisches Medium zugefügt und die Platten dann weiter auf dem Eis gelagert, bis die volle Aushärtung nach wiederum ca. 30 Minuten erreicht war.
Dann erst wurden die Zellen der zweiten Zelllinie, welche als Klümpchen auf der Agarose kultiviert werden sollten, in das vorhandene Medium gegeben und die Platten in den Kulturschrank gestellt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Aufbaues einer CAG-Kultur
3.11.9.3 Anlage einer Softagarkultur
Über die Monolayer von am Vortag ausgesäten Zellen wurde ein Gemisch (1:1) aus erwärmter Agarose und frisch trypsinierten und in Medium gelösten Zellen aufgebracht. Die gewünschte Zelldichte konnte hierbei durch die veränderte Konzentrierung der verwendeten Zellsuspension erreicht werden. Die Zellen waren in der mit 0,8 Prozent recht weichen Agarose eingeschlossen, konnten sich aber ungehindert durch Wachstum und Vermehrung ausbreiten. Dadurch sollte der Kontakt der einzelnen Zellen untereinander und zu den Zellen des Monolayers verhindert werden. Auf die so eingegossenen Zellen konnten somit lediglich diffusible Faktoren Einfluss nehmen, welche durch die Agarose hindurch zu den einzelnen,
sich im Laufe des Experimentes bildenden Kolonien diffundierten. Im Einzelnen lehnte sich die Herstellung dieser Art von Cokulturen an die Herstellung der CAG-Kulturen an.
Abbildung 2: Schematische Darstellung einer Softagarkultur im Vergleich zum Aufbau einer CAG-Kultur
3.11.9.4 Monolayerkulturen unter Verwendung von konditioniertem Medium
Um herauszufinden, ob sich die von den NIH-wnt7a-Zellen gebildeten Faktoren u. U. mit dem Medium von einer Schale in eine andere überführen lassen, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, bei denen jeweils das Medium einer konfluenten Schale mit einem Monolayer aus NIH-wnt7a-Zellen dem Medium über Monolayerkulturen auf einer 24-Well-Platte beigefügt wurde. Als Positivkontrolle wurden Zellen nach dem selben Schema mit dem Medium, welches von Platten mit NIH-LacZ-Monolayern entnommen worden war, kultiviert. Ein Douplet mit derselben anfänglichen Zellzahl wurde als Negativkontrolle immer ohne Zusatz von konditioniertem Medium mitgeführt und jeweils zwei Wells pro Zelldichte wurden mit den Überständen der NIH-wnt7a- und der NIH-LacZ-Zellen behandelt. Das jeweilige Medium, welches zuvor mindestens für drei Tage auf einer 10-cm-Schale belassen worden war, wurde mit einer sterilen 10-ml-Spritze abgesaugt und durch einen Sterilfilter gegeben. Diese keimfreien Medien wurden anschließend alliquotiert und jeweils eine Probe ohne vorherige Behandlung sowie nach Einfrieren bei -20 °C und nach Erhitzen auf 95 °C als Zusatz von 1/5 Volumen zu den Medien in den unterschiedlichen Wells gegeben.
Um immer frisches Medium von einer konfluenten Platte zur Verfügung zu haben, mussten als Vorbereitung für diese Experimente mehrere 10-cm-Schalen mit NIH-wnt7a- bzw. -LacZ-Zellen parallel zueinander mit unterschiedlicher Ausgangsdichte angelegt werden. Die -LacZ-Zellen der Linie R-Coll(II)-EGFP-5 wurden dann auf 24-Well-Platten ebenfalls in mehreren unterschiedlichen Zelldichten ausgesät und für zwei Wochen mit täglichen Mediumwechseln und gleichzeitigen Zugaben von Medien, die wie oben beschrieben behandelt worden waren, kultiviert. Nach vierzehn Tagen mit täglicher Zugabe der behandelten Medien wurden die Zellen auf den 24-well-Platten fixiert, mit Kristallviolett gefärbt und die Ergebnisse jeweils durch Fotos und durch photometrische Messung der Farbintensität ermittelt.
3.11.9.5 CAG-Kulturen unter Verwendung von konditioniertem Medium
In identischer Weise wurde auch der eventuelle Einfluss des konditionierten Mediums auf die Entwicklung von CAG-Kolonien ermittelt. Dazu wurden in den Experimenten jeweils neben den Kontrollschalen (ohne Zusatz) weitere Kulturen mit frisch gewonnenem (lediglich steril filtriertem) Medium vom Überstand einer NIH-wnt7a-Kultur versetzt, entsprechendes Medium wurde nach Sterilfiltration bei –70°C eingefroren und jeweils vor Zugabe aufgetaut und drittens wurde eine weitere Probe des Mediums erhitzt, um eine Degeneration der Proteine zu erreichen. Die CAG-Kulturen wurden auf 6-Well-Platten angelegt, wobei pro
Well jeweils 250 µl Agarose und Kollagen aufgebracht wurden. Nach Aussaat von 5 Mio.
Zellen von R-Coll(II)-EGFP-5 auf jedem dieser Wells, wurden die Zellen für zwei Wochen mit täglicher Zugabe von 1/5 Volumen der behandelten Medien kultiviert. Dabei erfolgte zwei Mal ein kompletter Mediumwechsel. Nach 7 und nach 14 Tagen wurden die Größenunterschiede und Veränderungen in den Kontrollwells und in den mit Wnt7a- bzw.
LacZ-Medium behandelten Wells bewertet und durch Fotos festgehalten.
Als Erweiterung zu diesen Experimenten wurden bei der dritten und vierten Wiederholung parallel zu den bisherigen Wells jeweils noch zwei Wells mitgeführt, bei denen einen Tag vor dem Anlegen der CAG-Kulturen in den Schalen ein Monolayer von 50.000 Zellen der Linien NIH-wnt7a- und -LacZ angelegt worden war. Dadurch sollte der direkte Vergleich zwischen Zellen, die mit den Monolayern der o. g. Zelllinien cokultiviert wurden, zu den Zellen, die allein mit dem entsprechenden Medium versorgt worden waren, ermöglicht werden.
3.11.10 Spezielle Vorgehensweisen für die Plasmide pUHD15.1 und pBI-EGFP/Luc