Aus der Abteilung Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Herstellung und Charakterisierung einer Reporterzelllinie für chondrogene Differenzierung
und
Herstellung eines tetracyclinregulierten Genexpressionssystems in chondrogenen Zelllinien
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Thomas Wendlandt geboren am 09.02.1975 in Hannover
Hannover 2006
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 17.04.2007 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Professor Dr. Dieter Bitter-Suermann Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. Georg Brabant Referent: Prof. Dr. Henning Windhagen Korreferent: Prof. Dr. Ludwig Wilkens Tag der mündlichen Prüfung: 17.04.2007
Promotionsausschussmitglieder: - Prof. Dr. Tobias Hüfner - Prof. Dr. Hans-Rudolf Raab
- Prof. Dr. Dirk Berens von Rautenfeld
Inhalt
SeiteInhaltsverzeichnis 1
Kapitel 1: Zusammenfassung 4
Kapitel 2: Einleitungen 5 2.1 Einleitung zu Teil 1 der Arbeit: Herstellung und Charakterisierung 5
einer Reporterzelllinie für chondrogene Differenzierung
2.2 Einleitung/Überleitung zu Teil 2 der Arbeit: Herstellung eines 8 tetracyclinregulierten Genexpressionssystems in chondrogenen Zelllinien
Kapitel 3: Materialien und Methoden 9
3.1 Zelllinien 9
3.2 Plasmide 10
3.3 Enzyme und Bakterien 11
3.4 Längenstandards 11
3.5 Medien und Zusätze für die Zellkultur 11
3.6 Chemikalien 12
3.7 Standardpuffer und –lösungen 13
3.8 Standardisierte Kits 14
3.9 Sonstige Materialien und Gerätschaften 14
3.10 Molekularbiologische Methoden 15
3.10.1 Transformation der Plasmide in das Bakterium DH5alpha E. coli 15
3.10.2 Plasmidpräparation (Miniprep) 15
3.10.3 Plasmidpräparation (Maxiprep) 15
3.10.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 16 3.10.5 Linearisierung von Plasmid-DNA durch Restriktionsendonukleasen 16
3.10.6 Agarosegelelektrophorese 17
3.10.7 Phenol/Chloroform-Extraktion 17
3.11 Zellbiologische Methoden (Allgemeiner Teil) 17
3.11.1 Kultivierung von Zellen 17
3.11.2 Auftauen von Zellen 18
3.11.3 Einfrieren von Zellen 18
3.11.4 Trypsinierung mit Collagenase und Hyaluronidase 19 3.11.5 Zählung von Zellen in der Thoma-Zählkammer 19
3.11.6 Transfektion 19
3.11.6.1 Transiente Transfektion mit FuGene 19
3.11.6.2 Stabile Transfektion mit Clonfektin 20
3.11.7 Testung der zytotoxischen Eigenschaften von Hygromycin B 20 3.11.8 Selektion und Picken einzelner Klone der transfizierten Zellen 21 3.11.9 Spezielle Vorgehensweisen für das Plasmid pColl(II)-EGFPpolyA 21
(zu Teil 1 der Arbeit)
3.11.9.1 Transfektion des Plasmides pColl(II)-EGFPpolyA in RCJ-Zellen 21
3.11.9.2 Anlage einer CAG-Kultur 22
3.11.9.3 Anlage einer Softagarkultur 22
3.11.9.4 Monolayerkulturen unter Verwendung von konditioniertem Medium 23 3.11.9.5 CAG-Kulturen unter Verwendung von konditioniertem Medium 23
3.11.10 Spezielle Vorgehensweisen für die Plasmide pUHD15.1 und 24 pBI-EGFP/Luc (zu Teil 2 der Arbeit)
3.11.10.1 Stabile Transfektion des Tetracyclintransaktivators (tTA) in 24 RCJ-Zellen
3.11.10.2 Charakterisierung der Stammzelllinien R-tTA-12, -17, -18, -21, -24, 24 -28, -30 und -31
3.11.10.3 Testung der zytotoxischen Eigenschaften von Neomycin auf 25 R-tTA-Zellen
3.11.10.4 Transfektion des Plasmides pBI-EGFP/Luc in die unterschiedlichen 25 Klone der R-tTA-Zellen
3.11.10.5 Trennung EGFP-regulierender von nicht regulierenden Zellen 25 3.11.10.6 Subklonierung besonders stark leuchtender Zellklone 26
3.11.10.7 Ermittlung einer Tetracyclinstandardkurve 26
3.12 Versuchsauswertung und Dokumentation 27
3.12.1 Alcian-Blau-Färbung 27
3.12.2 Proliferationsassay 27
3.12.3 Größenvergleiche zwischen den Kolonien in der Softagarose 27 3.12.4 Vergleich der Leuchtintensität der EGFP-exprimierenden Kolonien 28
3.12.5 Luziferaseaktivitätsmessung 30
3.12.6 Fotodokumentation der Zellkulturexperimente 30
Kapitel 4: Ergebnisse 31
4.1 Ergebnisse zu Teil 1 der Arbeit: Herstellung und Charakterisierung 31 einer Reporterzelllinie für chondrogene Differenzierung
4.1.1 Stabile Transfektion des Plasmides pColl(II)-EGFPpolyA in RCJ-Zellen 31 4.1.2 CAG-Kulturen und Monolayerkulturen der Klone R-Coll(II)-EGFP-3, 31
-5 und -6
4.1.3 Differenzierung und Dedifferenzierung 32
4.1.4 Differenzierung der Monolayerkulturen und CAG-Kulturen des Klones 32 R-Coll(II)- EGFP-5 mit Zusatz des Proteinkinase C-Aktivators PMA
sowie unter Zusatz von Retinsäure und 8-Bromo-cAMP
4.2 Untersuchung des Effekts verschiedener Wnt-Peptide auf das 33 Wachstum und die Differenzierung der etablierten, chondrogenen
Rezeptorzelllinie R-Coll(II)-EGFP-5
4.2.1 CAG-Kulturen von R-Coll(II)-EGFP-5 geschichtet über den 33 Monolayern von allen sieben NIH-wnt-Klonen und NIH-LacZ
4.2.2 Monolayer- und CAG-Kulturen von R-Coll(II)-EGFP-5 unter 34 Verwendung von konditioniertem Wnt-Medium
4.2.3 Softagarkulturen des Klones R-Coll(II)-EGFP-5 mit Monolayern 35 von NIH-wnt7a und -LacZ unter der Agaroseschicht
4.2.4 Softagarkulturen von R-Coll(II)-EGFP-5 in Cokultur mit 37 Monolayern aus Kombinationen von NIH-wnt7a, NIH-LacZ
und sFRP2
4.2.5 Softagarkulturen des Klones R-Coll(II)-EGFP-5 mit Monolayern 39 von NIH-LacZ, sFRP2 und allen sieben NIH-wnt-Klonen
4.2.6 Softagarkulturen mit kombinierten Monolayern aus NIH-wnt5a, 41 -wnt7a, -wnt11 und -LacZ
4.2.7 Softagarkulturen mit Monolayern aus Zellen der Klone NIH-wnt5a, 43 -wnt11, -LacZ und sFRP2
4.2.8 Softagarkulturen mit Zusatz von drei verschiedenen Proteinkinase C- 45 Inhibitoren (Staurosporin, Bisindolyl und Go6976) sowie eines
Aktivators der PKc (PMA)
4.2.9 Diskussion zu Teil 1 47
4.3 Ergebnisse zu Teil 2 der Arbeit: Herstellung eines tetracyclinregulierten 53 Genexpressionssystems in chondrogenen Zelllinien
4.3.1 Herstellung von stabil mit dem tet-Transaktivator transfizierten 53 RCJ-Zellen
4.3.2 Testung der zytotoxischen Eigenschaften von G418 (Neomycin) 53 auf R-tTA-Zellen
4.3.3 Charakterisierung des chondrogenen Potentials der Zelllinien 53 R-tTA-12, -17, -18, -21, -24, -28, -30 und -31
4.3.4 Tetracyclin regulierte Reportergenexpression in R-tTA-Zellen 55 4.3.5 Ergebnisse der Luziferaseaktivitätsmessungen 56 4.3.6 Charakterisierung der Stammzelllinie R-tTA-24 und ihrer Subklone 59
R-tEL24.5, R-tEL-24.7 und R-tEL-24.8
4.3.7 Diskussion zu Teil 2 59
Kapitel 5: Zusammenfassende Diskussion und Ausblick 61
Kapitel 6: Fotodokumentation 63
Kapitel 7: Literaturverzeichnis 66
Kapitel 8: Danksagungen und Lebenslauf 79
Kapitel 9: Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 der Promotionsordnung 82
1 Zusammenfassung
In dieser aus zwei Teilen bestehenden Arbeit wurde zunächst im ersten Teil eine Reporterzelllinie für die chondrogene Differenzierung hergestellt und charakterisiert, mit deren Hilfe dann im Anschluss die Effekte verschiedener Wnt-Moleküle auf die Chondrozytendifferenzierung untersucht werden konnten. Hierbei sollten vordergründig die Reportereigenschaften dieser Zelllinie dargestellt werden, während die Charakterisierung der Wnt-Eigenschaften weiterführender Experimente bedarf.
Zunächst wurde eine aus fetalen Rattenkalvarien gewonnene chondrogene Zelllinie (RCJ3.1(C5.18)) mit dem Reporterplasmid pColl(II)-EGFPpolyA transfiziert, welches die für das enhanced green fluorescene protein codierende Sequenz enthält und dadurch erlaubt, die Grünfluoreszenz als Marker für die Produktion von Kollagen Typ II zu verwenden. Die von uns aus den stabil transfizierten Klonen ausgesuchte Zelllinie R-Coll(II)-EGFP-5 zeigte dabei eine schnelle Proliferation bei gleichzeitig starker Grünfluoreszenz nach erfolgter chondrogener Differenzierung.
Sodann wurden diese R-Coll(II)-EGFP-5-Zellen zusammen mit mehreren Wnt-sezernie- renden Zelllinien in unterschiedlichen Cokultursystemen (im Monolayer, auf CAG und eingebettet in Softagarose) auf Ihre Eigenschaft als Reporterzelllinie für die chondrogene Differenzierung hin untersucht. Dabei konnte für die ausgesuchte Zelllinie insbesondere eine sowohl verlässliche als auch quantifizierbare Reportereigenschaft nachgewiesen werden, zumal die von uns beobachteten Wnt-Effekte überwiegend mit den in der Literatur beschriebenen Beobachtungen korrelierten. Meine Experimente sprechen für die Existenz zweier Wnt-Klassen (die Wnt1- und die Wnt5-Klasse), ferner gab der Einsatz eines fz-related Wnt-Antagonisten (sFRP2) sowie von drei PKc-Inhibitoren und eines PKc-Aktivators Hinweise auf das Vorhandensein unterschiedlicher Pathways für die Signaltransduktion der einzelnen Wnt-Effekte. Dabei zeigten diese Experimente vor allem, dass die Wnts das Koloniewachstum und die Differenzierung chondrogener Zelllinien beeinflussen. Andere Literaturangaben haben dies zwischenzeitlich bestätigt, wie in der folgenden Einleitung näher ausgeführt wird.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein tetracyclinreguliertes Genexpressionssystem in einer chondrogenen Zelllinie hergestellt und anschließend charakterisiert. Die hieraus hervorgegangene Mutterzelllinie R-tTA-24 hat ihr chondrogenes Potential dabei erhalten und erlaubt die stabile Transfektion mit dem bidirektionalen Plasmid pBI-EGFP/Luc, in dem eines oder beide Reportergene durch andere Gene ersetzt werden können. Dabei ist für die einzelnen Subklone ein Regulationsfaktor von zum Teil mehr als 100 % für die Expression der einzelnen Gene zu erwarten.
2 Einleitungen
2.1 Einleitung zu Teil 1 der Arbeit: Herstellung und Charakterisierung einer Reporterzelllinie für chondrogene Differenzierung
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung des Mechanismus der Chondrozytendifferenzierung und hierbei im Besonderen mit den Einflüssen von Adhäsionsmolekülen und deren Signaltransduktion. Eine Klasse von Adhäsionsmolekülen in der Zellmembran, die Klasse der Cadherine, koppelt an Catenin, welches ein zentraler Bestandteil der Signaltransduktionskaskade der Hormonklasse der Wnts (wingless und int- related) ist. Wnts nehmen eine zentrale Rolle in einer Reihe von entwicklungsbiologischen Prozessen ein1, so unter anderem auch in der Differenzierung von Osteoblasten und Chondrozyten.
Im ersten Teil der Arbeit wurde zunächst eine stabile Rezeptorzelllinie hergestellt und charakterisiert, mit welcher unterschiedliche Einflüsse auf die chondrogene Differenzierung dieser Rezeptorzelllinie anhand eines potenten Markers erkannt und quantifiziert werden konnten. Mit Hilfe dieses Markers wurde dann der Einfluss von Wnts auf die chondrogene Differenzierung dieser Zelllinie untersucht. Bisher existieren nur wenige permanente Zelllinien, die eine in-vitro-Untersuchung der chondrogenen Differenzierung, die sowohl im Rahmen der enchondralen Knochenbildung während der Skelettentwicklung als auch in der Frakturheilung und Regeneration eine wichtige Rolle einnimmt2, erlauben. Hierbei sind neben der von uns verwandten Zelllinie RCJ3.1(C5.18)3 u. a. noch die Zelllinien CFK4, MC3 T101/25, C16 und ATDC57 zu nennen.
Zur Herstellung unserer Reporterzelllinie verwendeten wir die durch limited-dilution aus fetalen Rattenkalvarien gewonnene monopotente, chondrogene Zelllinie vom Typ RCJ3.1(C5.18), im Folgenden nur noch kurz RCJ genannt (Quelle: J. E. Aubin, Toronto, Kanada).8 Diese Zellen erscheinen zunächst pleomorph und nach Konfluenz kubisch. Dabei sind sie von einer refraktilen Matrix umgeben. Die chondrogene Differenzierung der RCJ- Zellen ereignet sich im Monolayer bei Langzeitkultur der Zellen und ist begleitet von einer Downregulation des Kollagens Typ I, einer Upregulation des Bindungsproteins Aggrecan und des Kollagens Typ II9 sowie von einer Ablagerung knorpelspezifischer Proteoglykane.10 Bei Kultur über die Konfluenz hinaus bilden die Zellen spontan dreidimensionale Knorpelknötchen11, die eine charakteristische Anfärbung mit Alzian Blau12 (und anti- Kollagen Typ II) zeigen, während die umgebenden Zellen negativ für diese Marker sind. Die Produktion des Kollagens Typ II ist hierbei insb. auch von der verwendeten Trägermatrix abhängig. So bildeten RCJ-Zellen kultiviert im Monolayer auf einer Plastikunterlage (vor Konfluenz) nur <5 % Kollagen Typ II (bei >80 % Typ I-Kollagen), nach Übertragung auf
1 Nusse: The Wnt-homepage; Miller, 2002; Nusse et Varmus, 1992
2 zur Übersicht siehe Reddi, 1994; Erlebacher et al., 1995; Favus, 1996
3 Grigoriadis et al., 1988
4 Bernier et Goltzmann, 1993; Bernier, Dejardines et al., 1990
5 Taylor et Jones, 1979
6 Poliard et al., 1995
7 Atsumi et al., 1990
8 Girgoriadis, Aubin et al., 1989; Grigoriadis, Heersche et al., 1990
9 McDougall et al., 1996
10 Grigoriadis et al., 1989
11 Lunstrum, Keene, Weksler et al., 1999; Grigoriadis, Heersche et Aubin 1996
12 Bancroft et Stevens 1990
Kollagen-Agarosegel (im Folgenden kurz CAG genannt) zeigte sich nach 7 Tagen ein Anstieg des Kollagen Typ II-Anteils auf 79 % bei nur noch 8 % Kollagen vom Typ I.13
Dexamethason stimuliert dabei die Bildung der Knorpelknötchen dosisabhängig (EC50 = 10-9 M) und verhindert die Degeneration der vorhandenen Knorpelknötchen.14 Daher ist eine kontinuierliche Anwesenheit von Dexamethason im Kulturmedium erforderlich.
Demgegenüber hemmt u. a. die Zugabe von 1,25(OH)2-Vitamin D315 sowie von Retinsäure16 (in einer Konzentration von 0,01-100 nM) die Knorpeldifferenzierung und die Glukosaminoglykansynthese in den RCJ-Zellen.17 Dabei blockiert Retinsäure das Fortschreiten der Kondensation von der Knorpelvorstufe zur Formation des Knorpelknötchens durch Aufrechterhalten der Expression von N-Cadherin und damit Stabilisierung der Zell-Zellinteraktionen auf der Stufe der Kondensation später Knorpelvorläuferformationen („post-precartilage condensation“).18 Die hormonelle Empfindlichkeit für Parathormon (PTH) steigt mit zunehmender Differenzierung der Zellen19, während sie für Prostaglandin (PG) E2 zunehmend absinkt20. PGE2 und PGF2a steigern, PGE1 hingegen hemmt die Proliferation. Prostaglandine stimulieren die Aufnahme von 35SO4 in die Matrix der RCJ-Zellen.21
RCJ-Zellen wurden mit dem Reporterplasmid pColl(II)-EGFPpolyA transfiziert, welches die für das enhanced green fluorescence protein (kurz: EGFP) codierende Sequenz enthält, und damit ermöglicht, Grünfluoreszenz als Marker für die Produktion von Kollagen Typ II zu verwenden. Die Grünfluoreszenz erlaubt hierbei die kontinuierliche Beobachtung der Differenzierung dieser Zelllinie in vitro, wie exemplarisch mit der Untersuchung von Wnt- Effekten auf die chondrogene Differenzierung in unterschiedlichen Cokulturmodellen (als Monolayerkultur, auf Kollagenagarose und in den späteren Experimenten auch innerhalb eines Softagars) im zweiten Abschnitt des ersten Teils dieser Arbeit gezeigt wird.
Die wichtigste Rolle des Wnt-signalings scheint die Förderung der Osteoblasten- und der Chondrozytendifferenzierung aus mesenchymalen Stammzellen (mesenchymal stem cell) bei gleichzeitiger Hemmung der Adipozytendifferenzierung zu sein.22 Dabei ist die Signaltransduktion der Wnts mittlerweile sehr umfangreich und recht komplex geworden23 (Eine gute Übersicht hierzu findet sich auf „The Wnt Homepage“ von R. Nusse.24). Die Wnts vermitteln ihre Signale durch Bindung an Rezeptoren aus der frizzeled Familie (fz).25 Die cystein-rich domain (CRD) am aminoterminalen Ende des Rezeptors ist extrazellulär gelegen und vermittelt die Bindung der Liganden.26 Sie ist Teil einer fz-related gene Familie, durch welche die Wnt/Rezeptor Interaktionen moduliert werden.27 Sulfatierte Glucosaminoglykane fungieren dabei als Corezeptoren der Wnts28 und scheinen für die eigentliche Transduktion
13 McDougall, Fu, Lowe et al., 1996
14 Grigoriadis, Heersche et al., 1988; Grigoriadis, Aubin et al., 1989; Grigoriadis, Heersche et Aubin 1996
15 Grigoriadis et al., 1989
16 Cash et al., 1997
17 Lau, Tertinegg, et al. 1993; Schroeder, Hashimoto et al., 1994
18 Cho et al., 2003
19 Grigoriadis et al., 1989; McDougall et al., 1996
20 Grigoriadis et al., 1989
21 McDougall et al., 1996
22 Etheridge et al., 2004; de Boer et al., 2004; Nuttall et Gimble, 2004; Gregory et al., 2005; Bennett et al., 2002;
Ross et al., 2000
23 u. a. Koboyashi et Kronenberg, 2005; Johnson et al., 2004
24 Nusse auf: www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html
25 Moon et al., 1997
26 Hsieh et al., 1999
27 Moon et al., 1997
28 Binari et al., 1997
des Signals wesentlich zu sein.29 Die Hormonklasse besteht aus 19 Liganden und 7 Rezeptoren (Stand vom Januar 2006 lt. Homepage von R. Nusse30). Die Wnts zeigen ein gewisses Maß an funktioneller Redundanz und vermögen sich daher in ihrer Funktion teilweise gegenseitig zu ersetzen. Allerdings lassen sich (mindestens) zwei funktionelle Gruppen von Wnts unterscheiden, wobei diese funktionelle Vielfalt z. T. in der Aktivierung von unterschiedlichen Rezeptor/Signal-Transduktionskaskaden begründet sein mag.31 Neuere Arbeiten zeigen die zusätzliche, z. T. auch gegenläufige Regulation des Wnt-Signals durch die wechselnde Verfügbarkeit der Rezeptoren.32
Die Wnts werden in einer lipid-modifizierten und daher sehr hydrophoben Form sekretiert33, zudem ist die Aufreinigung von Wnt-Proteinen aufgrund ihrer komplexen, cysteinreichen Sequenz schwierig.34 Synthetische Wnt-Proteine waren zum Zeitpunkt der experimentellen Phase dieser Arbeit noch nicht verfügbar. Um die Effekte der verschiedenen Wnts auf die chondrogene Differenzierung und Proliferation zu testen, benutzten wir daher polyklonale, mit einem retroviralen System stabil transfizierte NIH3T3-Zelllinien, welche Wnt1, -3a, -4, - 5a, -7a, -7b oder -11 sekretierten.35
29 Dierick et Bejsovec, 1999
30 www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html
31 Cox et Peifer, 1998; Pennisi, 1999
32 Mikels et Nusse, 2006
33 Willert et al., 2003, Nusse 2003
34 Hsieh et al., 1999
35 Kispert et al., 1998
2.2 Einleitung/Überleitung zu Teil 2 der Arbeit: Herstellung eines tetracyclin- regulierten Genexpressionssystems in chondrogenen Zelllinien
Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte ausgehend von derselben Mutterzelllinie RCJ3.1(C5.18) ein tetracyclinreguliertes Genexpressionssystem in einer chondrogenen Zelllinie hergestellt werden. Diese Zelllinie wurde anschließend exemplarisch mit einem Reportergen für EGFP und Luziferase stabil transfiziert, welches dann durch die Zugabe von Tetracyclin reguliert werden kann.
RCJ3.1(C5.18)-Zellen (im Folgenden kurz RCJ genannt) wurden – wie oben bereits erwähnt – ursprünglich durch limited-dilution aus primären Rattenkalvarien isoliert.36 Sie gehören zu einer bislang geringen Zahl von permanenten Zelllinien, welche zur in-vitro- Untersuchung des Prozesses der chondrogenen Differenzierung geeignet sind.
Transiente Transfektionsmethoden eignen sich nur bedingt, die Einflüsse unterschiedlicher Gene während der mehrere Wochen dauernden Knorpeldifferenzierung in vitro zu untersuchen. Nach stabiler Transfektion kann jedoch die Interpretation der Ergebnisse durch die phenotypische Variabilität aufgrund von Selektion eines Zellklons und unter Umständen auch durch die Integration des Konstruktes an unterschiedlichen Stellen in das Genom schwierig sein. Um dieses Problem zu umgehen, verwendeten wir ein tetracyclinreguliertes Genexpressionssystem (TRES, tet-Off-System)37, welches bereits im Vorfeld stabil in RCJ- Zellen transfiziert worden war. Dieses System besteht aus einem Tetracyclin- Repressor/Virionprotein V16-Fusionsprotein (Tetracyclintransaktivator, tTA). Im ersten Schritt wurden durch Transfektion des Tetracyclintransaktivators (tTA) in RCJ-Zellen die stabilen Linien der Knorpelzellreihe R-tTA hergestellt und anschließend von uns zunächst auf ihre weiterhin bestehenden chondrogenen Eigenschaften hin untersucht. Diese Zelllinien wurden daraufhin im zweiten Schritt stabil mit dem bidirektionalen Vektor pBI-EGFP/Luc transfiziert. Dieses Konstrukt enthält einen minimalen CMV-Promotor mit sieben Repeats des tet-Operons (Ptet). Tetracyclin hemmt dabei die Bindung des Hybridproteins tTA an Ptet und erlaubt dadurch die Regulation der Promotoraktivität. pBI-EGFP/Luc enthält dabei gleichzeitig enhanced green fluorescence protein (EGFP) und Luziferase, zwei häufig verwendete Reportergene.
36 Grigoriadis et al., 1988
37 Gossen et Bujard, 1992
3 Materialien und Methoden
3.1 Zelllinien
RCJ3.1(C5.18): monopotente, chondrogene Zelllinie, durch limited-dilution Klonierung nach Verdau von fetalen Rattenkalvarien gewonnen;
Quelle: Dr. Jane Aubin, Dept of Anatomy and Cell Biology, University of Toronto, Medical Science Bldg., Room 6255, Toronto, M5S1A8.
Die Kultur dieser Zellen erfolgte in Minimal Eagles Medium alpha (im Folgen nur noch kurz als αMEM geschrieben; dieses enthält bereits RNA/DNA und Glutamax I) mit einem Zusatz von 15 % hitzeinaktiviertem fetalen Kälberserum (im Folgenden kurz FBS) und 10-7 M Penicillin/Streptomycin.
R-Coll(II)-EGFP-3, R-Coll(II)-EGFP-5 und R-Coll(II)-EGFP-6:
durch Transfektion des Plasmides pColl(II)-EGFPpolyA in RCJ-Zellen entstandene Zellklone, welche den Differenzierungsmarker EGFP unter dem Collagen-Typ II-Promotor exprimieren. Zur Selektionierung wurden die Zellen mit dem Plasmid pTK-Hyg cotransfiziert und anschließend die stabil transfizierten Zellen mit 200 µg/ml Hygromycin B im Kulturmedium selektioniert.
Die Kultur erfolgte ebenfalls in αMEM mit 15 % FBS und 10-7 M P/S sowie mit dem o. g. Hygromycinzusatz von 200 µg/ml.
NIH-3T3pLNCXwnt1, -wnt3a, -wnt4, -wnt5a, -wnt7a, -wnt7b und -wnt11:
sieben unterschiedliche Zellklone, die jeweils ein Protein aus der Familie der wingless- and int-related proteins (=Wnt) sezernieren; diese sind durch stabile Transfektionen einer Mauszelllinie (NIH-3T3) mit einem retroviralen Expressionsvektor für das jeweilige Wnt-Protein der Maus und einem Neomycinresistenzgen entstanden; die Kultur der Zellen erfolgte in Dulbecos Minimal Eagles Medium (im nachfolgenden mit DMEM bezeichnet) mit 10 % FBS-Zusatz, sowie 10-
7 M Penicillin/Streptomycin und zusätzlich 200 mg/ml G418 (Neomycin) zur Aufrechterhaltung des Selektionsdrucks der ersten Transfektion.
Quelle: Prof. Dr. Andreas Kispert, Medizinische Hochschule Hannover, Abteilung Molekularbiologie, Carl-Neuberg-Straße1, 30625 Hannover, Germany. Email: kispert.andreas@mh-hannover.de
NIH-3T3pLNCXLacZ:
parallel zu den Wnt-Zellen entstandener Klon, bei dem, anstatt des für die Wnt-Faktoren exprimierenden Vektorabschnittes, eine Sequenz für LacZ in den selben Vektor eingefügt wurde. Diese Zelllinie wurde in den erfolgten Experimenten als Kontrollzelllinie benutzt, um weitestgehend auszuschließen, dass eine Konzentrationsverschiebung im Vergleich zwischen den bei jedem Experiment mitgeführten leeren Nullkontrollwells und den doppelt belasteten Schalen, in denen z. B.
Monolayer und CAG-Kulturen übereinander geschichtet kultiviert wurden, für die beobachteten Effekte verantwortlich war.
Quelle und Kultur der LacZ-Zellen wie bei den oben beschriebenen NIH-3T3pLNCXwnt-Linien.
sFRP2: secreted frizzled-related protein 2; für diese von der Arbeitsgruppe um Dr. Kispert in Freiburg erarbeitete Zelllinie wurde derselbe retrovirale Vektor wie bei der Transfektion der NIH-wnt-Zellen verwandt. Das von den sFRP2-Zellen sezernierte Protein sollte, laut Aussage von Herrn Dr.
Kispert, als Fragment des eigentlichen Wnt-Rezeptors die Signaltransduktion an den transmuralen Wnt-Rezeptoren der cokultivierten Zellen durch kompetetive Hemmung beeinflussen.
Quelle und Kultur der sFRP2-Zellen wie bei den weiter oben beschriebenen NIH-wnt-Linien.
R-tTA-12, R-tTA-17, R-tTA-18, R-tTA-21, R-tTA-24, R-tTA-28, R-tTA-30 und R- tTA-31:
durch stabile Transfektion des Plasmides pCMV-tTA in RCJ-Zellen entstandene Subklone, wobei dieses Plasmid die Regulationsdomäne des Tetracyclinrepressors von E. Coli mit der Aktivierungsdomäne des Virionproteins VP 16 kombiniert. Ein Promotor, bestehend aus sieben Tet-Operon-Sequenzen (tetO) und einem minimalen CMV-Promotor, kann durch das Hybridprotein tTA aktiviert werden. Tetracyclin hemmt die Bildung von tTA und erlaubt dadurch die Regulation der Promotor- aktivität.
Quelle des Plasmides pUHD15.1 = pCMV-tTA: Arbeitsgruppe Bujard38 Die R-tTA-Zellen wurden ebenso wie auch die oben beschriebene Mutterzelllinie in αMEM mit Zusatz von 15 % FBS, 10-7 M P/S und bei einer längeren Kulturdauer zur ständigen Aufrechterhaltung des Selektionsdrucks mit zusätzlich 200 µg/ml Hygromycin B kultiviert.
R-tEL-12, R-tEL-17, R-tEL-18, R-tEL-21, R-tEL-24, R-tEL-28, R-tEL-30 und R-tEL- 31:
diese Zellklone sind durch stabile Transfektion des Plasmides pBI- EGFP/Luc in die oben beschriebenen Zellklone der R-tTA-Stammreihe neu entstanden.
Die Selektionierung der stabilen Klone erfolgte durch Cotransfektion mit dem Resistenzplasmid pSV-neo und durch anschließende Zugabe von 200 µg/ml G418 (Neomycin) zu den Kulturen.
Kultur in αMEM mit 15 % FBS, 10-7 M P/S und als Antibiotika 200 µg/ml Hygromycin B und zusätzlich 200 µg/ml G418 im Medium.
3.2 Plasmide
pUHD15.1: = pCMV-tTA; Plasmid für den tet-Transaktivator, dieser Vektor war im ersten Schritt stabil in das Genom der oben beschriebenen R-tTA- Zellreihen integriert worden.
Quelle für das Plasmid: Arbeitsgruppe Bujard39
pColl(II)-EGFPpolyA: Vektor für die Expression des Differenzierungsmarkers EGFP unter dem Kollagen-Typ II-Promotor, linearisiert mit Age I
pTK-Hyg: Hygromycin B-Resistenzplasmid, linearisiert mit HindII
38 Gossen et Bujard, 1992
39 Gossen et Bujard, 1992
pBI-EGFP/Luc: linearisiert mit XmnI, Vektor mit bidirektionalem Promotor, durch dessen gegenläufige Sequenz parallel sowohl die Expression von EGFP als auch von Luziferase aktiviert wird
pSV2-neo: Neomycin-Resistenzplasmid, linearisiert mit EcoRI
pEGFP-C1: in diesem Vektor steht die Expression von EGFP unter dem Einfluss eines konstitutiven Promotors, so dass dieses Plasmid zur frühzeitigen Erfolgskontrolle bei den Transfektionen genutzt werden konnte 3.3 Enzyme und Bakterien
AgeI : 2000 U/ml Biolabs 552S
EcoRI: 10000 U/ml TaKaRa 1040A
HindII: 8000 U/ml TaKaRa 1060A
XmnI: 6000 U/ml Biolabs 194S DH5alpha E. Coli,
mit dem dazugehörigen Nährmedium SOC 3.4 Längenstandards
Loading-buffer: 10x TaKaRa A.105
Lambda DNA: BstEII digested, mit Fragmentgrößen von 8454, 7242, 6369, 5686, 4822, 4324, 3675, 2323,
1929, 1371, 1264 und 702 bp NE Biolabs 301-4S
φX174: HaeIII digested, mit Fragmentgrößen von 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118
und 72 bp TaKaRa 3405A
3.5 Medien und Zusätze für die Zellkultur
αMEM: 1x mit Glutamax, mit DNA/RNA Gibco 32561-029
8-Bromo-cAMP: Sigma B-7880
Natrium-Chlorat: (Stock 30 mM) Sigma C-3171
Collagenase: (Stock 100 µg/ml) Boehringer 103 578
Dexamethason: Sigma D-1756
DMEM: Gibco 31966-021
Fetal Bovine Serum: Lot # AGB6178 + AFE5253 HyClone SH30017
G418: Neomycin Stratagene 200 399
β-Glycerophosphat: Sigma G-6251 Hyaluronidase: (Stock 100 µg/ml) Boehringer 106 500 Hygromycin B: (Stock 50 mg/ml in PBS) Clontech 8057-1 P/S: Penicillin/Streptomycin, je 5000 U/ml Gibco 15070-022
RPMI 1640: 1x Gibco 61870-028
Tetracyclin: Sigma T-7660
Trypsin-EDTA: 1x Gibco 25300-054
Vitrogen 100: 3 mg/ml Kollagen Typ I vom Rind Collagen Corp.PC 0702
3.6 Chemikalien
Agarose: Roth 2267.3
Alcian Blau: Sigma A-3157
Bisindolylmaleat (aus Beständen von Dr. Chr. Schöfel)
Bromphenol-Blau: Sigma B-5525
Calcium-Chlorid: Merck 2382.0500
Chloroform: Merck 1.2445.2500
Diethyl-Pyrocarbonat: Sigma D-5758
Dinatrium-Ethylendiamidtetraessigsäure: (EDTA) Sigma ED2SS
DMSO: Sigma D-5879
Essigsäure, rauchende Baker 200.580.7
Ethanol: Baker 200.578.6
Ethidiumbromid: Sigma E-7637
Formalin: 3,7 %ig Merck 1.04002.1000
Glucose: Merck 1.261442.1000
Glycerol: Merck 1.04094.1000
Go6976 (ebenfalls aus Beständen von Dr. Chr. Schöfel)
Guanidinium-Thiocyanat: Sigma G-9277
Hepes: Serva 25245
Isopropanol: Merck 1.09634.2500
Kaliumacetat: Merck 1.04820.1000
Kalium-Chlorid: Merck 4936.1000
Kaliumdihydrogenphosphat: Merck 4876.1000
Kristallviolett: Sigma C-3886
Loading buffer: TaKaRa A.105
LMP-Agarose: (low-malting-point-agarose) Bio-Rad 9012-36-6
Magnesium-Chlorid: Merck: 1.05835.0100
β-Mercaptoethanol: Sigma M-3148
Natriumacetat: Sigma S-2889
Natrium-Chlorid: Merck 1.06404.5000
Natriumcitrat: C6H5Na3O7 Merck 1.06431.1000
Natriumdihydrogenphosphat: Merck 6346.0500
Natriumdodezylsulfat: (SDS) Fluka 71725
Natriumhydroxid: Merck 1.06498.1000
Natriumlauroylsarcosin: Sigma L-9150
Phenol: Fluka 77631
Phorbol 12-myristate 13-acetate in DMSO: (PMA) Biomol PE-160
Retinsäure: all trans Retinoic acid Biomol GR-100
RNAse: Sigma R-5503
Staurosporin (aus Beständen von Dr. Chr. Schöfel)
Tris-Base: fest Sigma T-1503
Wasser: ddH2O aus dem Filtersystem Milli-Q, Millipore
3.7 Standardpuffer und -lösungen
EDTA: 0,5 M, pH 8,0; dazu wurden 186,1 g Dinatrium-Ethylendiamidtetraessigsäure (*2H2O) in 800 ml H2O gelöst, der pH-Wert durch Zugabe von ca. 20 g NaOH- Pellets auf 8,0 justiert und die Lösung mit dem Magnetrührer gut durchgemischt. Anschließend wurde die EDTA-Lösung in eine saubere Flasche abgefüllt und im Autoklaven sterilisiert.
Lämmli-Buffer: Dieser 2x Reduktionspuffer enthält in der Endkonzentration 125 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 4 % SDS, 20 % Glycerol, 10 % Mercaptoethanol und zur Anfärbung der Pufferlösung 0,05 % Bromphenol-Blau. Die entstandene Pufferlösung wurde auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt und eingefroren.
MgCl2: Die 1 molare Lösung wurde vor allem für die unten beschriebene Alcian-Blau Färbung verwendet. Dazu wurden 203,3 g MgCl2 (*6 H2O) in 800 ml H2O gelöst. Das Volumen wurde mit H2O auf 1 l aufgefüllt, die Lösung in eine saubere Flasche abgefüllt und autoklaviert.
Natriumacetat: Die 3 M Lösung (pH 7,0) wurde ebenfalls hauptsächlich für die Alcian- Blau-Färbung verwendet. Dazu wurde 408,1 g Natriumacetat (*3 H2O) in 800 ml H20 gelöst und der pH-Wert durch Zugabe von flüssiger Essigsäure auf 7,0 eingestellt. Nachdem das Volumen durch Zugabe von weiterem Wasser auf einen Liter aufgefüllt worden war, konnte die Lösung in eine Flasche gefüllt und ebenfalls autoklaviert werden.
Phenol: auf pH 7,4 eingestellt; in einem 15-ml-Röhrchen wurden 7 ml Phenol mit 3 ml Tris-Lösung (1M, pH 7,4) kräftig gemischt und anschließend zum Erreichen einer schnelleren Phasentrennung kurz bei 1000 rpm in der Hettich-Zentrifuge anzentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt, das Phenol einmal mit Wasser gespült und unter einer neuen Wasserphase bei Raumtemperatur und lichtgeschützt in Aluminiumfolie verpackt gelagert.
PBS: 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,76 mM KH2PO4 wurden in 1000ml dd Wasser gelöst, der pH-Wert auf 7,4 einstellen und die Lösung nach Autoklavierung bei Raumtemperatur gelagert.
Solution D: (lt. Maniatis) enthält Guanidinium-Thiocyanat 4,0 M, Na-Citrat 50 mM, 0,5% Na-Lauroyl Sarcosin (SLS), DEPC-Wasser und β-Mercaptoethanol (720µl/100ml); entsprechend wurde für einen 200 ml Stock 94,56 g Guanidinium-Thiocyanat mit 10 ml 1M Na-Citrat (steril) und 10 ml 10 % SLS (steril) gut gemischt und mit DEPC-Wasser auf das Endvolumen von 200 ml aufgefüllt. Nach Filtration durch einen 0,22 µm Filter in eine sterile Flasche wurden der Lösung noch 1440 µl Mercaptoethanol hinzugefügt. Die Flasche wurde lichtgeschützt und bei Raumtemperatur gelagert.
Solution I, II und III für Plasmidpräparation: Solution I enthält 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, 50 mM Glucose und 100 µg/ml RNAse.
Solution II besteht aus 200 mM NaOH (entspr. 4g), 1% SDS (entspr. 5g) auf 500 ml Wasser.
Solution III enthält Kaliumacetat in einer Konzentration von 3 M in 500 ml Wasser und ist auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt.
TAE: Um einen 10 x Stock TAE anzulegen, wurden pro Liter Endvolumen 48,4 g Tris-Base abgewogen (entsprechend 0,4 Mol Tris/Liter Endvolumen), mit 11,4 ml rauchender Essigsäure (98 %ig) und 10 ml 0,5 molarem EDTA vermischt.
Nach Auffüllen mit Wasser auf 80 % des Endvolumens erfolgte die pH- Werteinstellung auf 8,0. Die auf das Endvolumen aufgefüllte Lösung wurde bei Raumtemperatur gelagert und bei Bedarf zu einem 1 x Stock verdünnt, um bei der Agarosegelelektrophorese als Laufpuffer zu dienen.
TE: enthält 10 mM Tris (pH 7,4) und 1 mM EDTA
Tris: Für die 1 M Lösung wurde 121,1 g Tris Base in 800 ml Wasser gelöst. Die pH- Werteinstellung auf pH 7,4 erfolgte bei Raumtemperatur der Lösung durch Zugabe von etwa 70 ml konzentrierter Salzsäure. Nachdem das Volumen wiederum auf einen Liter aufgefüllt worden war, erfolgte die Abfüllung in eine Flasche mit anschließender Autoklavierung.
3.8 Standardisierte Kits
Alkalische Phosphatase Kit von Sigma: Kat. # 86-C
Clonfektin: Liposomenpräparation der Firma Clontech mit zugehörigem Hepespuffer FuGene 6: Transfektionsreagenz von Boehringer Mannheim, Lipide mit Zusätzen in
80% Ethanol, steril filtriert, Kat. # 1 814 443
Luziferase Assay System der Firma Promega: Kat. # E-1501, enthält 5x Cell Culture
Lysis Reagent, Luziferase Assay Substrate (lyophilized) und Luziferase Assay Buffer
3.9 Sonstige Materialien und Gerätschaften
Begasungsbrutschrank: Heraeus BB16
Einfrierröhrchen: Cryovials 1,2 ml Roth E308.1
Einfrierbox: mit Isopropanol gefüllt Nalgene 5100-0001 Einmalpipetten: 10 ml, einzeln steril verpackt Renner 06 027
25 ml, einzeln steril verpackt Renner 06 028 Filme: Kodak 200 ASA und Kodak Gold 800 ASA
Kulturflaschen: Tissue Culture Flasks Becton-Dick. 3111
Kulturschalen: 96-well Nunc 442404
24-well Becton-Dick. 3047
6-well Becton-Dick. 3224
35 mm Becton-Dick. 3001
10 cm Becton-Dick. 3003
15 cm Becton-Dick. 3005
Parafilm
Pasteurpipetten: zum einmaligen Gebrauch Brand 7477 20
Pipetman: 20, 200 und 1000 µl Gilson
Pipettierhilfe: Pipettus Akku
Polystyreneröhrchen: Roth 000-2058-STR
Reagiergefässe: Sarstedt 72.690.550
Röhrchen mit Schraubverschluss: 15 ml Sarstedt 62.554.502
50 ml Sarstedt 62.547.254
Röhrchen: für die Luziferaseaktivitätsmessung Sarstedt 55.476 Silikonfett:
Skalpelle: steril, für den Einmalgebrauch Spritzen, steril
Sterilfilter: 0,22 µm Celluloseacetat Roth C450.1
Thoma-Zählkammer
Verwendete Geräte werden bei den entsprechenden Methoden beschrieben.
3.10 Molekularbiologische Methoden
3.10.1 Transformation der Plasmide in das Bakterium DH5alpha E. coli
Die DNA der verwendeten Plasmide wurden mir durch die Arbeitsgruppe um Dr. Bergwitz bereits weitgehend aufgearbeitet zur Verfügung gestellt, entweder in Form eines auf Filterpapier aufgebrachten Tropfens oder als in ausreichender Konzentration in Wasser gelöste Plasmidpräparation.
Die als Spot auf Filterpapier eingetrocknete DNA musste zunächst in Bakterien des Typs DH5alpha E. coli transformiert werden, um durch diese vervielfältigt zu werden. Dazu wurde das markierte Areal des Filterpapiers, auf dem der Tropfen aufgetragen worden war, mit einer abgeflammten Schere ausgeschnitten und mit 50 µl sterilem TE in ein Eppendorftube gegeben, um die DNA in Lösung zu bringen. 2 µl dieses resuspendierten Plasmids wurden mit 20 µl DH5alpha zunächst für 30 min auf Eis inkubiert, dann kurzzeitig für 45 sec auf 42 °C erwärmt und anschließend wieder zurück auf Eis gegeben. Durch diesen Temperaturschock wurde die Aufnahme der Plasmid-DNA durch die Bakterien stark gefördert. Nach Zugabe von SOC und Inkubation für eine Stunde wurde die Bakteriensuspension auf vorbereiteten, mit Ampicillin behandelten Kulturplatten in zwei unterschiedlichen Konzentrationen ausgestrichen. Nach Bebrütung der Platten bei 37 °C über Nacht konnten die entstandenen Kolonien am nächsten Tag geerntet und für die Plasmidpräparationen weiter verwandt werden.
3.10.2 Plasmidpräparation (Miniprep)
Sowohl die DNA der zu untersuchenden Arbeitsplasmide (pColl(II)-EGFPpolyA, pBI- EGFP/Luc) als auch die DNA der für die stabilen Transfektionen nötigen Resistenzplasmide (pTK-Hyg, pSV2-neo etc.) wurden im Vorfeld für die Transfektionen vervielfältigt und in ausreichenden Konzentrationen eingefroren.
Pro Plasmid wurde in zwei 15 ml Falcons jeweils 5 ml LB-Medium vorgelegt und im Bakterienbrutschrank auf 37 °C vorgewärmt. Von den bebrüteten LB-Platten wurden mit Hilfe steriler Pipettenspitzen je eine gut entwickelte Kolonie gepickt und das aufgenommene Bakterienpellet in einem der vorbereiteten Röhrchen aufgeschwemmt. Die gut verschlossenen Falconröhrchen wurden bei 37 °C über Nacht im Bakterienbrutschrank inkubiert. Eine kleine Probe aus jedem Ansatz wurde für die Plasmid-Maxipräparation verwandt, der Rest zur späteren Verwendung eingefroren.
3.10.3 Plasmidpräparation (Maxiprep)
Für die Plasmid-Maxipräparation wurden je 100 µl der Bakteriensuspension aus den vorausgegangenen Minipräparationen in einen 50 ml Falcon mit 25 ml LB-Medium gegeben und ebenfalls bei 37 °C über Nacht inkubiert. Anschließend wurden die Ansätze für 15 min bei 4000 rpm und 4 °C zentrifugiert, die entstandenen Überstände dekantiert und die verbleibenden Pellets gut abgetropft. Die Pellets wurden in 5 ml Solution I resuspendiert, nach Zugabe von je 5 ml Solution II und Solution III kräftig gemischt und wiederum bei 4000 rpm für 15 min zentrifugiert. Die klaren Überstände wurden in neue Röhrchen überführt und mit 15 ml äquilibriertem Phenol versetzt. Nach erneuter Zentrifugation (1 min bei 4000 rpm) wurden die Überstände wiederum überführt, mit je 15 ml Phenol und Chloroform gemischt und wiederum zentrifugiert. Anschließend wurde den Überständen analog den vorausgegangenen Schritten 30 ml Chloroform zugefügt. Die aus dem letzten
Aufreinigungsschritt gewonnenen Überständen wurden nun mit 15 ml Isopropanol gemischt und mit 4000 rpm bei 4 °C für 30 min runterzentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert, die gewonnenen Pellets mit der darin enthaltenen Plasmid-DNA mit einer kleinen Menge Ethanol aufgeschwemmt und in ein Eppendorftube überführt. Nach Zentrifugation sowie vorsichtigem Spülen mit Ethanol und Trocknen in der SpeedVac wurde die DNA in 100 µl TE mit RNAse-Zusatz gelöst.
3.10.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Die Extensionsmessung gelöster DNA bei 260 nm gegen Wasser erlaubte die photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration. Die Messung erfolgte im Spectrophotometer Ultrospec K 80-2010-78. Eine Extinktion von 1,0 entspricht dabei etwa einer Konzentration von 50 µg/ml doppelsträngiger bzw. 40 µg/ml einzelsträngiger DNA. Mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten E260/E280 wurde die Reinheit der DNA geprüft. Bei einer nur geringen Beimengung von RNA sollte der Koeffizient zwischen 1,6 und 1,8 liegen.
3.10.5 Linearisierung von Plasmid-DNA durch Restriktionsendonukleasen
Die Plasmide wurden als Vorbereitung auf die Transfektionen zunächst mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen linearisiert, um eine Integration der Plasmid-DNA in das Genom der Zellen zu ermöglichen. Die Linearisierung erfolgte dabei durch Restriktionsendonukleasen, die das jeweilige Plasmid an einer einzigen vorgegebener Stelle einmal aufspalteten.
Für den Verdau von Plasmid pColl(II)-EGFPpolyA wurde das Enzym AgeI verwandt. Dazu wurden 100 µg Plasmid im entsprechenden Puffer NEB I mit 100 U Enzym bei 25 °C über Nacht verdaut. Am folgenden Tag wurde noch einmal dieselbe Menge Enzym zugegeben, für weitere 4 Stunden inkubiert und anschließend die Vollständigkeit der Verdaus durch Auftragen einer Probe auf einem Agarosegel kontrolliert. Bei vollständiger Restriktion der gesamten Plasmidmenge zeigte sich auf dem Gel eine einzelne Bande im Bereich von 7000 Basen.
Das Plasmid pBI-EGFP/Luc sollte stabil in Tochterzellen der RCJ-Mutterlinie transfiziert werden, welche bereits den Tetracyclintransaktivator stabil exprimierten. Als Vorbereitung für diese Transfektionen des pBI-EGFP/Luc musste die durch Transformation und Plasmidpräparation gewonnene Plasmid-DNA zunächst ebenfalls linearisiert werden. Die Linearisierung des Plasmides erfolgte entsprechend dem oben beschriebenen Versuchsprotokoll mit dem Enzym XmnI, dem zugehörigen Puffer und dem ebenfalls mitgelieferten 100x BSA-Stock. Nach vierstündiger Inkubation mit XmnI wurde eine Probe des Verdaus auf einem 1 %igen Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt.
Auf dem Gel zeigte sich wiederum eine einzelne Bande mit der erwarteten Größe des linearisierten Plasmides. Die gewonnene, linearisierte DNA wurde ebenfalls für die spätere Verwendung bei –20 °C eingefroren und vor einer Transfektion aufgetaut.
Auch die beiden Resistenzplasmide pTK-Hyg (mit HindII) und pSV-neo (mit EcoRI) wurden in gleicher Weise mit den oben genannten Enzymen und den jeweils entsprechenden Puffern vor Verwendung linearisiert.
3.10.6 Agarosegelelektrophorese
Jeweils 2 µl des Plasmidverdaus wurden in einer Multiwellschale mit 7 µl Wasser und 1µl Loading-buffer vermischt und auf das vorbereitete Gel aufgetragen.
Die Auftrennung der Proben erfolgte auf einem 1 %igen Agarosegel in 1x TAE-Puffer, bei einer Stromspannung von 120 Volt über 45 Minuten. Parallel wurden die beiden in Kapitel 3.4 aufgeführten Längenstandards mitgeführt. Nach Färbung mit Ethidiumbromid konnte das Ergebnis auf dem UV-Tisch (TFX-35M von Intas) betrachtet und ggf. mit der zugehörigen Polaroidkamera (MP-4+ ebenfalls von Intas) in einem Foto festgehalten werden.
3.10.7 Phenol/Chloroform-Extraktion
Die Aufreinigung der enzymatisch geschnittenen Plasmide erfolgte durch die Extraktion mit Phenol (kallibriert auf pH 7,4) und Chloroform. Dafür wurde zu dem Ansatz des Restriktionsverdaus zunächst das zweifache Volumen an Phenol gegeben. Nach kräftiger Durchmischung und anschließender Zentrifugation (gekühlte Zentrifuge 1K15 von Sigma) mit 13000 rpm bei 4 °C für 15 min wurde der Überstand vorsichtig in ein neues Reaktionstube überführt. Die Extraktion mit Phenol wurde einmal wiederholt, gefolgt von einer zweifachen Extraktion mit einem Phenol-Chloroformgemisch (1:1) und zweifacher Chloroformextraktion. Nach der letzten Phasentrennung wurde die DNA durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und mit 1Volumen Isopropanol gefällt. Daraufhin wurde dieser Ansatz über Nacht bei -20 °C eingefroren. Am darauffolgenden Tag wurde nach einer weiteren Zentrifugation der gesamte Überstand von dem gebildeten Pellet abgesaugt, das Pellet vorsichtig mit 70 %igem Ethanol gewaschen und in der Speed Vac Concentrator (SVC 200H von Savant) getrocknet. In TE (10 mM Tris pH 7,4 und 1 mM EDTA) wurde das Pellet resuspendiert. Die Konzentration der gewonnenen DNA wurde durch Messung der optischen Dichte bei 260 nm (siehe 2.10.4) ermittelt und die Plasmid-DNA bis zur Verwendung für Transfektionen bei -20 °C gelagert.
3.11 Zellbiologische Methoden (Allgemeiner Teil) 3.11.1 Kultivierung von Zellen
Alle Zellklone, welche durch Transfektionen aus der RCJ-Zelllinie hervorgegangen waren, wurden, wie auch die Mutterzelllinie, in αMEM unter Zusatz von 15 % hitzeinaktiviertem fetalen Kälberserum, je 50 U/ml Penicillin und Streptomycin, sowie 10-7 M Dexamethason bei 37 °C unter 5 % CO2-Begasung in unserem Brutschrank BB16 der Firma Heraeus kultiviert. Dabei war bei allen transfizierten Zellen ein konstanter Selektionsdruck durch Zugabe der entsprechenden Antibiotika notwendig. Die Zellen der R-tTA-Linien wurden daher mit 200 µg/ml Hygromycin B im Medium kultiviert, die doppelt transfizierten R-tEL- Linien zusätzlich noch mit 200 µg/ml G418 (Neomycin).
Die stabil transfizierten Zellen von R-Coll(II)-EGFP-3, -5 und -6 wurden alle ebenfalls mit 200 µg/ml Hygromycin B im Medium selektioniert. Die Kulturbedingungen aller Zelllinien sind unter den Beschreibungen der einzelnen Zellen in Kapitel 3.1 genau aufgeführt.
Die erforderliche Antibiotikamenge für die Selektionierung wurde ermittelt, indem die nativen Zellen in parallelen Ansätzen mit steigenden Konzentrationen des jeweiligen Antibiotikums behandelt wurden. Zur Selektionierung der Transfektanten wurde die Konzentration eingesetzt, die dem Doppelten der Menge entsprach, bei der nach 10-14 Tagen 100 % der nativen Zellen abgetötet waren.
Die adhärent wachsenden Zellen wurden bei Erreichen der Konfluenz, spätestens aber alle sieben Tage, passagiert, indem die Zellen nach Absaugen des Altmediums und zweimaligem Spülen mit PBS für 5-10 Minuten mit Trypsin bei 37 °C inkubiert wurden. Die Wirkung des Trypsins wurde durch Zugabe von Medium beendet. Die abgelösten Zellen wurden dann in der erforderlichen Dichte neu ausgesät und/oder dem weiteren Verwendungszweck in einem Experimentansatz zugeführt.
Die maximale Kulturdauer für eine Zellreihe betrug zehn Passagen, entsprechend etwa zehn Wochen, um einen möglichst gleichbleibenden Zellpool zu gewähren. Deshalb wurden möglichst früh Proben einer jeden Zelllinie eingefroren und nach dem Erreichen der zehnten Passage der vorherigen Zellreihe wiederum frisch aufgetaut.
3.11.2 Auftauen von Zellen
Die Vials mit den entsprechenden Zellen wurden aus dem flüssigen Stickstoff, in dem sie lagerten, direkt in ein etwa 37 °C warmes Wasserbad gegeben, wo sie in zwei bis drei Minuten auftauten. Die Zellen wurden dann in 10 ml Medium aufgenommen und gut durchmischt. Nach Pelletrierung durch Zentrifugation in der Hettich Zentrifuge mit 600 rpm bei 4 °C für 15 Minuten wurde das entstandene Pellet in Vollmedium mit entsprechendem Zusatz von FBS und Antibiotika resuspendiert und in die jeweilige Kulturschale gegeben.
3.11.3 Einfrieren von Zellen
Als Vorbereitung für das Einfrieren der Zellen wurde die Einfrierbox für ca. 30 Minuten bei -20 °C gelagert, um das Isopropanol in der Box vorzukühlen. Nach Absaugen des Mediums wurden die Zellen zunächst zweimal mit PBS gespült, anschließend knapp mit Trypsin-EDTA bedeckt, d. h. Zugabe von 1 ml Trypsin auf eine 10 cm-Schale oder 200 µl pro Well einer 6- Well-Platte, und dann für 5-10 Minuten bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Durch leichtes Klopfen der Schale wurden die Zellen abgelöst und unter dem Mikroskop kontrolliert. Falls sich die Zellen in größeren Aggregaten gelöst hatten, wurden sie vorsichtig mit einer 1000 µl Pipette durch auf- und abpipettieren geschert. Die auf diese Weise vereinzelten Zellen wurden in neuem Medium gelöst und in ein 15 ml Röhrchen überführt. Bei der Zentrifugation in der Hettich Zentrifuge Rotaxia/Rp, 15 Minuten lang bei 600 rpm und 4 °C, wurden die Zellen pelletriert und anschließend der Überstand abgesaugt, um Reste des Trypsins zu entfernen.
Währenddessen wurde das Einfriermedium angesetzt. Dazu wurden pro geplantem Einfriervial 500 µl Medium mit 400 µl fetalem Kälberserum und 100 µl DMSO (entspr.
5:4:1) in einem separaten Röhrchen gemischt, wobei die Zellen einer konfluenten 10 cm Schale in der Regel auf drei Vials aufgeteilt wurden. Das Einfriermedium wurde mittels einer sterilen Spritze durch einen Sterilfilter gegeben und bis zur Verwendung auf Eis gelagert. Die vorbereiteten Pellets wurden dann mit dem sterilen Einfriermedium gemischt und in beschriftete Vials überführt. Diese Vials wurden in die Einfrierbox gegeben und für mindestens vier Stunden bei -70 °C eingefroren. Daraufhin, spätestens aber am folgenden Tag, wurden die gefrorenen Zellen in flüssigen Stickstoff bei -180 °C Temperatur umgelagert.
3.11.4 Trypsinierung mit Collagenase und Hyaluronidase
Um Zellen, die bereits über einen längeren Zeitraum in einer Schale kultiviert wurden und dabei durch die Bildung extrazellulärer Matrix miteinander einen festen Zell-Zellkontakt eingegangen waren, aus diesem Verbund wieder herauszulösen und zu vereinzeln, wurden zunächst durch Inkubation mit Hyaluronidase und Collagenase die gebildeten Knorpelknötchen aufgelöst und die vereinzelten Zellen anschließend durch Behandlung mit Trypsin von der Platte gelöst. Dazu wurde die Platte zunächst zweimal mit PBS gespült, um Reste des Mediums zu beseitigen, anschließend wurde auf eine 10-cm-Schale 2,5 ml PBS gegeben und 10 µl Collagenase sowie 2,5 µl Hyaluronidase (jeweils von einem Stock der Konzentration 100mg/ml) beigefügt. Dies entsprach einer Endkonzentration von 0,04 % Collagenase bzw. 0,01 % Hyaluronidase auf die entsprechende Menge Puffer. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37 °C wurde 1 ml Trypsin hinzugefügt und die Zellen für ca. 5 Minuten angelöst. Durch vorsichtiges Klopfen der Platte und ggf. durch mehrmaliges Scheren mit einer Pipette wurden die Zellen vereinzelt und die Zellsuspension konnte nach Kontrolle unter dem Mikroskop je nach darauffolgendem Experiment weiterverwendet werden.
3.11.5 Zählung von Zellen in der Thoma-Zählkammer
Im Vorfeld aller Experimente wurde die Anzahl der Zellen in der aufgeschwemmten Zellsuspension durch Auszählung in der Thoma-Zählkammer ermittelt, um eine gleichbleibende Zellzahl in den einzelnen Versuchen zu gewährleisten. Dafür wurde ein Tropfen der Zellsuspension vorsichtig an den Rand des auf der Kammer liegenden Deckgläschens gesetzt, so dass der Tropfen nach dem Aufsetzen durch Kapillarwirkung in den Spalt zwischen Deckgläschen und Kammer eingesaugt wurde. Je nach Dichte der Zellen wurde eine Reihe der Kammer oder aber die gesamte markierte Fläche ausgezählt. Die Zellzahl im gesamten markierten Feld der Zählkammer mit 10 multipliziert entspricht der Anzahl an Zellen pro Milliliter.
3.11.6 Transfektion
3.11.6.1 Transiente Transfektion mit FuGene
Die transiente Transfektion mit FuGene wurde dazu verwendet, die Funktionsfähigkeit eines klonierten Plasmides vor der stabilen Transfektion zu testen. Auf einer 24-Well-Platte wurden pro Well 50.000 RCJ-Zellen ausgesät und über Nacht kultiviert. Pro Well wurden 100 µl des für die Zellen entsprechenden Mediums ohne Serum mit 4µl FuGene-Reagenz und 2 µg des zu testenden Plasmides in einem sterilen Tube bei 25 °C vorinkubiert.
Zwischenzeitlich wurde das Medium von den Wells abgesaugt, pro Well 400 µl Medium mit Serum vorgelegt und dann wurden je 100 µl des Transfektionsansatzes zu den Zellen gegeben. Die Kulturen wurden im Inkubator bei 37 °C für 24 Stunden belassen. Zur Kontrolle der Effizienz der Transfektion wurde parallel eine Reihe auf der Platte mit jeweils 2 µg des Plasmides pEGFP-C1 pro Well transfiziert, dessen Fluoreszenz mit dem Mikroskop beurteilt werden konnte. Die Fortsetzung der Kultur für 48 Stunden jeweils mit Serum wurde mit einer Bewertung unter dem Mikroskop und ggf. durch Fotos abgeschlossen.
3.11.6.2 Stabile Transfektion mit Clonfektin
Als Vorbereitung auf die stabile Transfektion wurden die Zellklone zunächst trypsiniert, in neuem Medium resuspendiert, in 15-ml-Röhrchen überführt und bei 600 rpm und 4 °C in 15 min runterzentrifugiert. Nach Auflösung der Pellets in Medium wurden die Zellen gezählt und jeweils 1,5 Millionen auf vorbereiteten 10-cm-Schalen ausgesät. Diese Zellen wurden über Nacht kultiviert, um ihnen die Anheftung an die Platte zu ermöglichen. Parallel dazu wurden pro zu transfizierender Zelllinie vier Wells auf einer 24-Well-Platte mit jeweils 100.000 Zellen angelegt.
Am nächsten Tag wurde pro 10-cm-Schale 60 µl Hepes Puffer sowie 2,5 µl Puffer für jedes der Wells, die als positive Kontrolle für die Transfektion dienen sollten, auf dem 50 °C warmen Heizblock in einem Polystyreneröhrchen vortemperiert, anschließend mit der gut aufgemischten Liposomenfraktion gemischt und bis zur weiteren Verwendung auf Eis gelagert. Pro Schale wurden 500 µl serumfreies αMEM mit 60 µl der Clonfektin Suspension und entsprechend für jedes Well mit positiver Kontrollfunktion 50 µl αMEM mit 2,5 µl Clonfektin Suspension gemischt. Für die eigentliche Transfektion wurde das zu transfizierende Plasmid im Verhältnis 1:2 mit der Clonfektin Suspension gemischt und zusätzlich 1/5 Volumen des jeweiligen Resistenzplasmides zugegeben. Für die Erfolgskontrolle wurde das Plasmid pEGFP-C1 gleichfalls mit dem zweifachen Volumen an Liposomen-Puffermix gemischt und bei Raumtemperatur für etwa eine halbe Stunde inkubiert. Auf die vorbereiteten Platten wurde währenddessen ebenfalls serumfreies Medium gegeben und das anschließend hinzugefügte Plasmid-Transfektionsgemisch bei 37 °C für 4 Stunden auf den Platten belassen. Pro Klon wurden zwei der Kontrollwells ohne jede Zugabe von Plasmid als Negativkontrolle parallel mitgeführt. Nach der vierstündigen Inkubation folgte ein zweimaliges Spülen der Platten mit PBS und eine Fütterung mit Medium inklusive Serum.
3.11.7 Testung der zytotoxischen Eigenschaften von Hygromycin B
Hygromycin B wirkt durch eine Blockade der Polypeptidsynthese und hemmt darüber die Elongation der mRNA während der Selektionierung und weiterführenden Kultur sowohl in prokaryonten als auch in eukaryonten Zellen. Um die für eine sichere Selektionierung mit Hygromycin B nötige Konzentration zu ermitteln, wurden die RCJ-Mutterzellen in einer Standardreihe mit aufsteigender Antibiotikakonzentration für mindestens vierzehn Tage kultiviert, wobei jeden dritten Tag ein Mediumwechsel mit anschließender Neuzugabe von Hygromycin B erfolgte. Für die Standardreihe wurden Hygromycinstocks angelegt, welche nach Zugabe zum Medium in den Wells Endkonzentrationen von 10, 100, 200, 500 und 1000 µg/ml ergaben. Parallel wurde jeweils eine Spalte ohne Zugabe von Antibiotikum als Positivkontrolle mitgeführt.
Die durchgeführten Tests zur Ermittlung der halbmaximalen, letalen Dosis LD50 von Hy- gromycin B ergaben nach zwei Wochen Kulturdauer eine vollständige Selektion der noch nicht transfizierten RCJ-Mutterzellen ab einer Konzentration von größer oder gleich 100 µg/ml Medium. Um in späteren Experimenten eine wirklich sichere Selektionierung zu erreichen, wurde daher dem Medium in den sich anschließenden Transfektionen zur Selektionierung stabiler Klone und zur Aufrechterhaltung dieses Selektionsdrucks während längerer Kultur jeweils Hygromycin B in einer Konzentration von 200 µg/ml zugesetzt.
Das Plasmid pColl(II)-EGFPpolyA selbst wies keine in den Vektor integrierte Resistenz- codierung auf. Daher wurde den RCJ-Zellen das Hygromycin-Resistenzplasmid pTK-Hyg während der stabilen Transfektionen im Verhältnis 1:5 zum Plasmid pColl(II)-EGFPpolyA angeboten. Dieses Resistenzplasmid wurde als Kontrolle für den Erfolg der Transfektion und
zur Selektionierung der stabil transfizierten Zellklone parallel zu dem Arbeitsplasmid verwendet.
Das Plasmid pUHD15.1, welches den Vektor für den tet-Transaktivator in Kombination mit einem CMV-Promotor enthält, war im ersten Schritt stabil in RCJ-Zellen transfiziert worden.
Aus diesen Transfektionen gingen die einzelnen R-tTA-Stammreihen hervor, so etwa R-tTA- 12, -17, -18 usw. Durch die Verwendung von Hygromycin B wurden auch hierbei die erfolgreich transfizierten von den nicht transfizierten Zellen selektioniert. Die Zellen dieser Zelllinien wurden deshalb während ihrer gesamten Kultur und auch nach der darauffolgenden Transfektion mit dem zweiten Plasmid pBI-EGFP/Luc immer mit einem gleichmäßigen Zusatz von Hygromycin B in der o. g. Konzentration von 200 µg/ml gehalten, um den Selektionsdruck für diese erste Transfektion weiterhin aufrecht zu erhalten.
3.11.8 Selektion und Picken einzelner Klone der transfizierten Zellen
Die Zellen auf den 10-cm-Schalen wurden 48 Stunden nach der Transfektion (und nach insgesamt zweimaligem Mediumwechsel) trypsiniert und auf jeweils drei 15-cm-Schalen verdünnt ausgesät. Bei der anschließenden Kultur für 14 Tage erfolgte die Selektionierung der stabil transfizierten Zellen durch Zugabe des entsprechenden Antibiotikums zum Medium.
Bei ausreichender Größe der einzelnen Kolonien erfolgte das Picken der Klone. Dazu wurde zunächst das Medium von der Platte abgesaugt, die Platte mehrmals mit PBS gespült und anschließend um die einzelnen Kolonien, die vorher mit einem wasserfesten Stift an der Unterseite der Platte markiert worden waren, mit Hilfe einer Pipettenspitze ein kleiner Kreis aus sterilem Silikonfett gezogen. Bei dieser Arbeit mussten die Kolonien auf der Platte zwischendurch immer wieder mit einem kleinen, auf der Platte verbliebenen Rest des PBS befeuchtet werden, um eine Austrocknung und damit das Absterben der Zellen zu verhindern.
In die einzelnen Kreise wurde eine geringe Menge Trypsin gegeben und die Platte dann für kurze Zeit im Brutschrank inkubiert. Nachdem sich die Zellen auf der Platte gelöst hatten (Kontrolle unter dem Mikroskop), wurden sie Kreis für Kreis in separate Wells auf einer 6- well-Platte überführt.
Nach weiterer Kulturzeit und bei Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen auf größere Schalen überführt und bei genügender Menge eingefroren.
3.11.9 Spezielle Vorgehensweisen für das Plasmid pColl(II)-EGFPpolyA (zu Teil 1 der Arbeit)
3.11.9.1 Transfektion des Plasmides pColl(II)-EGFPpolyA in RCJ-Zellen
Das Plasmid pColl(II)-EGFPpolyA wurde nach seiner Linearisierung zusammen mit dem Hygromycin B-Resistenzplasmid pTK-Hyg unter Verwendung von Clonfektin-Reagenz stabil in RCJ-Zellen cotransfiziert. Zur Selektionierung stabiler Klone und zur Aufrechterhaltung dieses Selektionsdrucks während längerer Kultur wurde Hygromycin B in der Konzentration von 200 µg/ml verwandt. Die aus dieser Transfektion hervorgegangenen Zellklone, welche während der Differenzierung zusammen mit der Bildung von Kollagen Typ II auch EGFP produzierten und damit anfingen unter UV-Bestrahlung grün zu leuchten, wurden nach ihren Wells nummeriert und benannt.
3.11.9.2 Anlage einer CAG-Kultur
Zur Anlage der CAG-Kulturen wurden zunächst 1,6 g LMP-Agarose in eine saubere, kleine Flasche abgewogen, mit 100 ml Wasser aufgefüllt, im Autoklaven sterilisiert und anschließend gut verschlossen gelagert.
Bei Bedarf wurde die Agarose in der Mikrowelle bis auf etwa 45 °C erhitzt und durch Schütteln gut durchmischt. In einem sterilen Röhrchen wurde die lauwarme LMP-Agarose im Verhältnis 1:1 mit Kollagen (Vitrogen 100) gemischt und dünn auf die vorbereiteten Platten aufgebracht. Für eine 35-mm-Schale bzw. das entsprechende Well auf einer 6-Well-Platte wurden dabei 500 µl Agarose-Kollagengemisch benötigt. Die Platten wurden zum vollständigen Aushärten der Agarose für eine halbe Stunde auf Eis gelagert. Anschließend wurden die Reste der Säure, in welcher das Kollagen gelöst war, durch Spülen der Platte mit Medium entfernt. Auf die so vorbereitete Agaroseschicht konnten jetzt je nach Experimentansatz die entsprechenden Zellen gegeben und weiterhin wie oben beschrieben kultiviert werden. Bei einem Mediumwechsel musste das alte Medium mit besonderer Vorsicht abgesaugt werden, um eine Beschädigung der Agaroseschicht zu vermeiden.
Für die Cokulturexperimente, in denen die CAG-Schicht zur Trennung der unterschiedlichen Zelllinien diente, wurden die Zellen für den unteren Monolayer am Vortag gesplittet und in der jeweiligen Schale ausgesät, um ihnen über Nacht die Möglichkeit zum Anheften an den Boden der Platte zu geben. Das Auftragen der Kollagenagarose fand genau nach obiger Vorgehensweise statt, nur mit der Modifikation, dass die Platten für eine kürzere Zeit zum Aushärten aufs Eis gestellt wurde, damit die Zellen unter der Agarose nicht austrockneten. Nach nur etwa fünf Minuten wurde bereits vorsichtig frisches Medium zugefügt und die Platten dann weiter auf dem Eis gelagert, bis die volle Aushärtung nach wiederum ca. 30 Minuten erreicht war.
Dann erst wurden die Zellen der zweiten Zelllinie, welche als Klümpchen auf der Agarose kultiviert werden sollten, in das vorhandene Medium gegeben und die Platten in den Kulturschrank gestellt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Aufbaues einer CAG-Kultur
3.11.9.3 Anlage einer Softagarkultur
Über die Monolayer von am Vortag ausgesäten Zellen wurde ein Gemisch (1:1) aus erwärmter Agarose und frisch trypsinierten und in Medium gelösten Zellen aufgebracht. Die gewünschte Zelldichte konnte hierbei durch die veränderte Konzentrierung der verwendeten Zellsuspension erreicht werden. Die Zellen waren in der mit 0,8 Prozent recht weichen Agarose eingeschlossen, konnten sich aber ungehindert durch Wachstum und Vermehrung ausbreiten. Dadurch sollte der Kontakt der einzelnen Zellen untereinander und zu den Zellen des Monolayers verhindert werden. Auf die so eingegossenen Zellen konnten somit lediglich diffusible Faktoren Einfluss nehmen, welche durch die Agarose hindurch zu den einzelnen,
sich im Laufe des Experimentes bildenden Kolonien diffundierten. Im Einzelnen lehnte sich die Herstellung dieser Art von Cokulturen an die Herstellung der CAG-Kulturen an.
Abbildung 2: Schematische Darstellung einer Softagarkultur im Vergleich zum Aufbau einer CAG-Kultur
3.11.9.4 Monolayerkulturen unter Verwendung von konditioniertem Medium
Um herauszufinden, ob sich die von den NIH-wnt7a-Zellen gebildeten Faktoren u. U. mit dem Medium von einer Schale in eine andere überführen lassen, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, bei denen jeweils das Medium einer konfluenten Schale mit einem Monolayer aus NIH-wnt7a-Zellen dem Medium über Monolayerkulturen auf einer 24- Well-Platte beigefügt wurde. Als Positivkontrolle wurden Zellen nach dem selben Schema mit dem Medium, welches von Platten mit NIH-LacZ-Monolayern entnommen worden war, kultiviert. Ein Douplet mit derselben anfänglichen Zellzahl wurde als Negativkontrolle immer ohne Zusatz von konditioniertem Medium mitgeführt und jeweils zwei Wells pro Zelldichte wurden mit den Überständen der NIH-wnt7a- und der NIH-LacZ-Zellen behandelt. Das jeweilige Medium, welches zuvor mindestens für drei Tage auf einer 10-cm-Schale belassen worden war, wurde mit einer sterilen 10-ml-Spritze abgesaugt und durch einen Sterilfilter gegeben. Diese keimfreien Medien wurden anschließend alliquotiert und jeweils eine Probe ohne vorherige Behandlung sowie nach Einfrieren bei -20 °C und nach Erhitzen auf 95 °C als Zusatz von 1/5 Volumen zu den Medien in den unterschiedlichen Wells gegeben.
Um immer frisches Medium von einer konfluenten Platte zur Verfügung zu haben, mussten als Vorbereitung für diese Experimente mehrere 10-cm-Schalen mit NIH-wnt7a- bzw. -LacZ- Zellen parallel zueinander mit unterschiedlicher Ausgangsdichte angelegt werden. Die Zellen der Linie R-Coll(II)-EGFP-5 wurden dann auf 24-Well-Platten ebenfalls in mehreren unterschiedlichen Zelldichten ausgesät und für zwei Wochen mit täglichen Mediumwechseln und gleichzeitigen Zugaben von Medien, die wie oben beschrieben behandelt worden waren, kultiviert. Nach vierzehn Tagen mit täglicher Zugabe der behandelten Medien wurden die Zellen auf den 24-well-Platten fixiert, mit Kristallviolett gefärbt und die Ergebnisse jeweils durch Fotos und durch photometrische Messung der Farbintensität ermittelt.
3.11.9.5 CAG-Kulturen unter Verwendung von konditioniertem Medium
In identischer Weise wurde auch der eventuelle Einfluss des konditionierten Mediums auf die Entwicklung von CAG-Kolonien ermittelt. Dazu wurden in den Experimenten jeweils neben den Kontrollschalen (ohne Zusatz) weitere Kulturen mit frisch gewonnenem (lediglich steril filtriertem) Medium vom Überstand einer NIH-wnt7a-Kultur versetzt, entsprechendes Medium wurde nach Sterilfiltration bei –70°C eingefroren und jeweils vor Zugabe aufgetaut und drittens wurde eine weitere Probe des Mediums erhitzt, um eine Degeneration der Proteine zu erreichen. Die CAG-Kulturen wurden auf 6-Well-Platten angelegt, wobei pro
