Verfahrenstechniken

2.5.1. Bronchoalveoläre Lavage

Die BAL ist eine Methode, um zelluläre und nicht-zelluläre Bestandteile der Lungenflüssigkeit des unteren Atemtrakts zu sammeln. Dazu werden physiologische Salzlösungen in die Lunge bronchial oder tracheal instilliert und durch Aspiration rückgewonnen (RENNARD et al. 1986; DAWSON et al. 2005).

Generell ist zwischen intravitaler und postmortaler BAL zu unterscheiden. Bei der intravitalen BAL werden nur kleine Areale lavagiert, da durch das verwendete Bronchoskop das Bronchiallumen abgedichtet wird, um einen optimalen Flüssigkeitsrückgewinn zu ermöglichen. Erst dann wird die ungepufferte, sterile, physiologische Kochsalzlösung appliziert (COSTABEL 1994). Eine intravitale BAL kann bei unsedierten Schafen unter Oberflächenanästhesie der Nasen- und Laryngealschleimhaut unter Sichtkontrolle mit einem flexiblen Endoskop durchgeführt werden. Dazu wird das Endoskop über den ventralen Nasengang eingeführt.

Anschließend erfolgt ein Vorschieben des Endoskops in die Bronchien bis das Instrument das Bronchiallumen abdichtet. In dieser Position finden Spülungen mit körperwarmer physiologischer Kochsalzlösung statt, welche im Anschluss wieder aspiriert wird (GANTER 1996). Des Weiteren ist es möglich, eine BAL bei Schafen nach Immobilisation durchzuführen. Dazu wird das Schaf in eine Brust-Bauchlage verbracht und der Kopf wird überstreckt. Ein Laryngoskop wird zur Darstellung des Kehlkopfes eingeführt, durch welches ein Tubus in die Trachea geschoben wird.

Durch diesen Tubus wird eine Ernährungssonde in die Bronchien vorgeschoben.

Dort findet die BAL ohne Sichtkontrolle durch Eingabe steriler 0,9% Kochsalzlösung und anschließender Rückgewinnung statt (VOIGT et al. 2007a).

Unter Anderem nach postmortaler BAL kann anhand der BALF eine Auswertung der Surfactant-Subtypen stattfinden (GROSS u. NARINE 1989a). Der Vorteil der postmortalen BAL ist, dass davon ausgegangen wird, dass alle Lungenareale gleichmäßig lavagiert werden können. Die Lunge wird dazu aus dem Brustkorb

entnommen und nach Instillation der Spülflüssigkeit geschwenkt (DAWSON et al.

2005).

WALTERS u. GARDINER (1991) unterstreichen die sinnvolle Nutzung von BAL als Werkzeug zur quantitativen Analyse von Lungenerkrankungen. Grundsätzlich wird davon ausgegangen, dass die eingegebene Flüssigkeit bei einer BAL ihren Zielort erreicht und somit auch die erkrankten Areale erreicht werden. Prozessbedingte Artefakte werden oftmals nicht berücksichtigt. Bei der intravitalen BAL konnte gezeigt werden, dass bei geringen Flüssigkeitsmengen (60ml) nur ein Teil der Flüssigkeit zurückgewonnen werden kann. Dieser Teil stammt aus den luftleitenden Wegen.

Nutzt man größere Flüssigkeitsmengen, werden auch periphere Bereiche mit in die Probenentnahme involviert (WALTERS u. GARDINER 1991). Bei diffusen Veränderungen ist die BAL repräsentativer als eine Biopsie, da sie mehr Fläche in der Lunge mit einbezieht (COSTABEL 1994).

Es wird beschrieben, dass die Ergebnisse aus verschiedenen BALF-Proben sowohl zwischen Versuchspersonen als auch innerhalb einer Versuchsperson stark schwanken. Daher sollten die BALF–Ergebnisse, insbesondere wenn sie abnorm sind, vorsichtig interpretiert werden (ETTENSOHN et al. 1988).

Ursprünglich findet die BAL lediglich bei interstitiellen Lungenerkrankungen Verwendung, aufgrund der einfachen Anwendungsweise erfolgt zunehmend der Einsatz bei Atemwegserkrankungen und Asthma (WALTERS u. GARDINER 1991).

Die Bestimmung der BALF-Zusammensetzung von gesunden Probanden ist eine Grundvoraussetzung, um Veränderungen während Lungenerkrankungen inter-pretieren zu können (RATJEN et al. 1994). Daher erscheint die Erarbeitung von Daten gesunder Tiere jeder Tierart für nötig, um Daten von Tieren mit einer Grund-erkrankung interpretieren zu können.

Die BALF eignet sich für die Messung von Immunmediatoren, Immunoglobulinen, Enzymen, Proteinen, Surfactantbestandteilen und der Zellzusammensetzung des Bronchoalveolarraums (WALTERS u. GARDINER 1991; RATJEN et al. 1994).

Die epitheliale Grenzflüssigkeit hat eine Dicke von ca. 1-10µm in den oberen Atemwege gegenüber 0,2-0,5µm in distalen bronchoalveolären Bereichen (KELLY u.

MUDWAY 2003). Nach der Rückgewinnung der eingegebenen Flüssigkeit liegen die

zu untersuchenden Bestandteile stark verdünnt vor. Surfactant bildet ca. 1% der bronchoskopisch rückgewonnenen BALF. Je nach Verweildauer der Spüllösung in der Lunge diffundieren weitere Moleküle in die BALF. Um dies zu vermeiden sollte diese Zeit so kurz wie möglich andauern (RENNARD et al. 1986; WALTERS u.

GARDINER 1991; KELLY u. MUDWAY 2003). Ein Nachteil der BALF besteht darin, dass diese nur intraalveolären Surfactant beinhaltet, dessen exakte Herkunft hinsichtlich der Lungenlokalisation unklar ist (OCHS 2010).

2.5.2. Pulsating Bubble Surfactometrie

Innerhalb der Lunge wirken verschiedene Kräfte, welche sich anhand des La Place´schen Gesetzes erklären und berechnen lassen, da die Lunge mit ihren luftleitenden Wegen und Alveolen mit Röhrchen und Blasen vergleichbar ist. Die OFS in einer Blase versucht diese zu komprimieren, während die Luft sie zu erweitern versucht. Sind zwei Blasen von ungleicher Größe durch ein Röhrchen verbunden, wird die kleinere sich immer in die Größere entleeren. Gleiches würde in der Lunge passieren, so dass letztlich nur eine große Blase übrig bliebe. Verhindert wird dies durch den Surfactant. Dieser bildet eine dünnere Schicht, wenn die Alveolen größer sind und eine dichtere Schicht, welche die OFS erniedrigt, wenn die Alveolen kleiner sind. Somit werden die Alveolen stabilisiert, so dass sie die gleiche Größe beibehalten können (BANKS 1986). Je kleiner eine Blase ist, desto größer ist ihre OFS. Die OFS ist die Tendenz einer flüssigen Oberfläche aufgrund der Anziehungskräfte von Molekülen an und in dieser Oberfläche zu kontrahieren (CLEMENTS 1997).

Das PBS ist ein Apparat, der den Druck an der Oberfläche einer Luftblase aufzeichnet, welche sich in einer Testflüssigkeit ausbreitet und mit Raumluft in Verbindung steht (ENHORNING 1977). Es simuliert den ersten Atemzug eines Neonaten, sowie die Atmungsdynamik (ENHORNING 2001). Mit ihm können innerhalb einer pulsierenden Blase die Druck–Volumen–Verhältnisse gemessen werden (MOTTAGHIAN 1999). Die Pulsationen entsprechen der Atemfrequenz. Der

Vorteil des PBS ist, dass die benötigten Probenmengen sehr gering sind und innerhalb von wenigen Minuten bereits Ergebnisse vorliegen können (ENHORNING 2001). Vor der Untersuchung mit dem PBS muss die zu beprobende BALF aufkonzentriert und durch Zentrifugation gereinigt werden. Anschließend erfolgt eine Resuspendierung mit Calciumchlorid und die Einstellung der Phospholipid-konzentration auf 3mg/ml (MOTTAGHIAN 1999).

Durch einen Differenzdruckaufnehmer wird der Druck gemessen, welcher notwendig ist, um eine Surfactantblase zu öffnen und zu schließen. Anhand dieser Werte kann mit Hilfe des Laplace`schen Gesetzes ( P=2 γ/R) die OFS (γ) ermittelt werden (ENHORNING 1977). R entspricht dem Radius der Gasblase. Die von der Wandspannung erzeugte und nach innen gerichtete Kraft ist genauso groß, wie die von der Flüssigkeit nach außen gerichtete Kraft. Somit kann die nach außen gerichtete Kraft mittels des Drucks P in der Flüssigkeit berechnet werden (GROS 2004; ENHORNING 2008).

2.5.3. Transmissionselektronenmikroskopie

In der Transmissionselektronenmikroskopie wird, ähnlich wie in der Lichtmikroskopie, ein dünnes Objekt durchstrahlt. Jedoch erfolgt die Durchstrahlung mit Elektronen, welche nach der Wechselwirkung mit dem Präparat ein Bild erzeugen. Dabei dient die Kathode als Elektronenquelle während durch die Anode ein Feld zur Beschleunigung der Elektronen erzeugt wird. Dieses Verfahren findet unter Hochvakuum statt. Von Nachteil ist, dass Lebewesen nicht direkt untersuchbar sind.

Die Konservierung kann zu Strukturveränderungen führen. Native Präparate sind aufgrund ihres hohen Wassergehaltes im Hochvakuum nicht zu untersuchen, zusätzlich eignen sich nur sehr dünn geschnittene Präparate zur Beurteilung unter einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM). Die Kontrastierung ist mit Wolframatophosphorsäure, Ammoniumheptamolybdat und Uranylverbindungen möglich. Das Auflösungsvermögen des TEM ist theoretisch 1000fach höher als das von Lichtmikroskopen (200nm gegenüber 0,1-0,2nm). Bei biologischen Objekten ist

die Auflösung aufgrund von Präparationseinschränkungen auf 2-3nm begrenzt.

Anhand der Elektronenmikroskopie gelang die Charakterisierung der Zellorganellen (LANGE u. BLÖDORN 1981).

Die morphologische Komplexität kann Surfactant nur auf elektronenmikroskopischem Niveau entfalten. Diese Darstellung ist nötig, um das Surfactantsystem in gesunden und erkrankten Zuständen charakterisieren zu können. Mit dem TEM können sowohl intraalveoläre als auch intrazelluläre Surfactant–Subtypen dargestellt werden. Der Vorteil gegenüber einer BALF liegt darin, dass intrazellulärer Surfactant in situ dargestellt werden kann (OCHS 2010). Die Anwendung des TEM zur Darstellung von intraalveolärem und intrazellulärem Surfactant ist bei Menschen, Ratten und Mäusen bereits stark verbreitet, was folgende Quellen belegen (CHEVALIER u. COLLET 1972; OCHS 2006; OCHS 2010; BEHRENS 2011). Für Nutztiere liegen nur vereinzelte Arbeiten vor. BUSLEY et al. (2016) charakterisieren das Surfactant-system von Schweinen, während das SurfactantSurfactant-system von Schafen weitgehend unerforscht ist.

2.5.4. Computertomographie

Die Computertomographie (CT) ist die Weiterentwicklung von Röntgenverfahren zu einem Schnittbildverfahren. Dazu werden die Produktionsrichtungen von Röntgenstrahlen variiert in dem sich die Röntgenröhren und Detektoren um das Untersuchungsobjekt drehen. Die erzielten Einzeldaten werden mittels mathematischer Berechnungen durch Computer ausgewertet (LINKE 2009).

Anhand von CT Aufnahmen lassen sich klinisch relevante anatomische Strukturen und pathomorphologische Veränderungen darstellen. Um die CT Bilder korrekt zu interpretieren, ist eine genaue Kenntnis der Anatomie im Querschnitt der untersuchten Regionen nötig (DE RYCKE et al. 2005; BRAUER 2012). So existiert für Hunde bereits ein Katalog mit CT Bildern von den Brustkörben gesunder Hunde, welchen tiefgefrorene Thoraxscheiben des entsprechenden Tieres gegenübergestellt werden. Lediglich Nerven und kleine Gefäße können nicht im CT dargestellt werden

(DE RYCKE et al. 2005). Auch in der Nutztierpraxis findet der Computertomograph Verwendung. So wurden bereits mehrere Studien über CT Untersuchungen von Schweinen verfasst (BRAUER 2012; MENZEL et al. 2014; MENZEL et al. 2015;

CORREA-MARTIN et al. 2016). Beispielsweise eignet sich auch die Lungen-CT Auswertung von Schafen, um Tumorverläufe über Jahre zu dokumentieren. Diese Tiere passen in Brustlage aufgrund ihrer Größe in Standard CTs und die Größe der Bilder ist mit den CT Bildern von Menschen vergleichbar (HUMANN-ZIEHANK et al.

2013a). Bislang werden CT Untersuchungen von Schafen dennoch nur vereinzelt durchgeführt, jedoch mit steigender Tendenz. Neben der Beurteilung von Lungenadenokarzinomatose bedingtem Tumorwachstum findet dieses Verfahren auch Anwendung in Untersuchungen von Chlorgas- und Rauchinhalation bei Schafen (PARK et al. 2003; HUMANN-ZIEHANK et al. 2011a; BATCHINSKY et al.

2006). CT Untersuchungen von Schaflungen ermöglichen die Erstellung von Scores, welche den Grad einer Erkrankung wiederspiegeln (PARK et al. 2003; HUMANN-ZIEHANK et al. 2011a). Anhand eines spezifischen Scores besteht auch die Möglichkeit, den Therapieverlauf von humanen Patienten mit rauch-inhalationsbedingten Lungenschäden zu verfolgen (PARK et al. 2003). In einer anderen Studie finden dreidimensionale CT Scans von Lämmern Verwendung für die Messung von Schädelknochenvolumina. Diese weisen signifikante Veränderungen aufgrund von regelmäßiger Alkoholverabreichung seitens der Mutterschafe während der Trächtigkeit auf. Anhand dieser Studie können Rückschlüsse auf mögliche Veränderungen bei Kindern mit fetalem Alkoholsyndrom gestellt werden (BIRCH et al. 2015).

Im Vergleich mit der Röntgenuntersuchung ist die CT Diagnostik deutlich besser zur Darstellung von intrapulmonalen Läsionen geeignet. Die anatomischen Strukturen werden detaillierter dargestellt, sind dadurch besser identifizierbar und das Ergebnis ist aussagekräftiger (BRAUER 2012; LUDEWIG u. KIEFER 2015). Im Anschluss an eine CT Untersuchung sind Maßnahmen hinsichtlich weiterer Diagnostik und Therapie einfacher zu planen (LUDEWIG u. KIEFER 2015).

Aufgrund der Kosten und dem Narkoserisiko finden CT Aufnahmen vom Thorax bisher noch keine routinemäßige Verwendung in der Veterinärmedizin (DE RYCKE

et al. 2005). Dennoch stellen CT Untersuchungen eine wichtige Methode zur weiterführenden Diagnostik in Wissenschaft und Forschung dar, die auch die Anzahl an Versuchstieren senken könnte (BRAUER 2012).

2.5.5. Stereologie und Auswertungsprinzip

Die Stereologie ist die Wissenschaft der quantitativen Charakterisierung von physikalischen Eigenschaften ungleichmäßiger dreidimensionaler Strukturen, welche auf Ergebnissen basieren, denen eine zweidimensionale Auswertung zugrunde liegt.

Sie basiert auf mathematischen Methoden (HSIA et al. 2010).

Zur Beurteilung der Lunge muss diese in Abschnitte unterteilt werden, was letztlich in dünnen zweidimensionalen Schnitten resultiert. Diese zweidimensionale Probe hat wenig Bedeutung für die dreidimensionale Lungenstruktur. Das Problem kann mit der Stereologie behoben werden. Durch automatische Auswertungsprogramme kann dies nicht gewährleistet werden, außer wenn diese spezifisch für die Stereologie erstellt werden (WEIBEL et al. 2007). Der Vorteil der Stereologie ist, dass auch große Organe präzise und akkurat beurteilbar sind, in dem wenige, kleine, zufällig ausgewählte Proben untersucht werden (MITZNER u. WEIBEL 2010).

Stereologische Methoden sind akkurat, sofern jeder Bereich eines Organs die gleiche Wahrscheinlichkeit hat, ausgewertet zu werden. Sie sind effizient, sofern eine ausreichende Präzision innerhalb der angebrachten Zeit- und Kostenfaktoren gegeben ist (WEIBEL et al. 2007).

Die menschliche Lunge hat eine Oberfläche, welche fast der eines Tennisplatzes entspricht (WEIBEL 2009). In einer gesamten menschlichen Lunge befinden sich durchschnittlich 480 Millionen Alveolen (OCHS et al. 2004). Damit jeder Teil einer Lunge die gleiche Chance hat, in die stereologische Schätzung einbezogen zu werden, muss die Gewinnung der Proben unvoreingenommen verlaufen. Das systematic uniform random sampling stellt hierfür das Mittel der Wahl dar (KNUDSEN u. OCHS 2011).

Das systematic uniform random sampling erfolgt, indem die Lunge an einer zufälligen Stelle angeschnitten wird. Von diesem ersten Schnitt ausgehend, werden weitere Lungenscheiben geschnitten, welche durchgängig die gleiche Dicke aufweisen. Jede Lungenscheibe wird um 90° in dieselbe Richtung gekippt (HSIA et al. 2010).

Zur Probengewinnung für Elektronenmikroskopie kann ein Punktraster genutzt werden, um die Lokalisationen ausfindig zu machen, aus welchen Probeblöcke genommen werden. Diese Probenblöcke werden anschließend zu Schnitten für die Elektronenmikroskopie aufgearbeitet (HSIA et al. 2010; KNUDSEN u. OCHS 2011).

Somit ist gewährleistet, dass bei größeren Lungenscheiben mehr Proben genommen werden, da mehr Punkte pro Lungenscheibe Entnahmepositionen darstellen. Folglich hat nachhaltig jede Lungenlokalisation die gleiche Wahrscheinlichkeit, in die genauere Bewertung zu gelangen (HSIA et al. 2010).

Bei dem STEPanizer© handelt es sich um ein Computerprogramm zur stereologischen Auswertung digitaler Bilder auf mikroskopischer und makroskopischer Ebene. Testsysteme können auf die zu beurteilenden Bilder projiziert, Zähl- und Messmöglichkeiten genutzt und erlangte Ergebnisse übertragen werden (TSCHANZ et al. 2011). Dieses Programm findet bereits in verschiedenen Studien Verwendung (VLAHU et al. 2015; BUSLEY et al. 2016; SILVA et al. 2016).

WEIBEL (1979) beschreibt, wie anhand von Punktzählverfahren einer Struktur in einer Fläche deren Volumendichte in einem Referenzraum berechnet werden kann:

Die Berechnung von Volumendichten bestimmt den prozentualen Volumenanteil einer Struktur, bezogen auf das Gesamtvolumen des Referenzraumes. Zur Bestimmung des Oberflächenanteils bestimmter Strukturen in Bezug auf einen Referenzraum, wird die Oberflächendichte berechnet. Dies erfolgt durch Bestimmung von Schnittpunkten mit der Oberfläche der zu bestimmenden Struktur. Das Volumen–Oberflächenverhältnis wird aus dem Quotienten zwischen Volumendichte und Oberflächendichte einer Struktur unabhängig von einem Referenzraum ermittelt.

Durch diesen Wert sind Informationen über die Beziehung zwischen den beiden Dichten zu ermitteln (BEHRENS 2011). Die Oberflächendichte zeigt die Durchschnittsgröße einer Struktur an (FEHRENBACH et al. 1998a).

Das Cavalieriprinzip ist benannt nach dem italienischen Mathematiker B. Cavalieri.

Dieser beschreibt, wie anhand von parallelem Zerschneiden eines Objektes bei konstantem, bekanntem Abstand und Messung von Punkten bestimmter Bereiche das Volumen des Objektes bestimmt werden kann (CRUZ-ORIVE u. WEIBEL 1990).

Insbesondere bei der Auswertung humaner Lungen kann anhand von CT Bildern mit Hilfe des Cavalieriprinzips das Lungenparenchymvolumen bestimmt werden (OCHS et al. 2004).