Aufbereitung des Probenmaterials

3.2.1. Probenmaterial der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit

Im Anschluss an die Probengewinnung trennte eine Zentrifugation bei 4 °C und 200 x g über 10 Minuten die zellulären Bestandteile der BALF in einem

Sedimentröhrchen ab. Für eine Minute wurden die Proben bei 16 000 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert (VOIGT et al. 2007a). Es erfolgte eine Einlagerung des Überstands bei – 80 °C im Labor der Klinik für kleine Klauentiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gemäß der Lagerungsmethode von VOIGT et al.

(2007a).

5–10 ml des Überstands fanden Verwendung in der Funktionsmessung mittels PBS, während der übrige Anteil zur Aufbereitung für die Transmissionselektronen-mikroskopie genutzt wurde.

Abb.2: Kontrolltierlunge mit eingelegter Klinge in der Schneideapparatur für Stereo-logie, Unikat der Forschungs-werkstatt der Medizinischen Hochschule Hannover

3.2.2. Funktionsmessung der BALF Pellets mittels Pulsating Bubble Surfactometer

Nachdem die BALF Proben bei 4 °C aufgetaut wurden, folgte die Aufkonzentrierung und Reinigung von dem Surfactant². Zur Gewinnung eines reinen Surfactantpellets wurde die BALF für 1 Stunde 50 Minuten bei 4 °C und 26.000 x g ultrazentrifugiert.

Die Resuspendierung des entstandenen Pellets mit 1,5 mMol Calciumchloridlösung (Calciumchlorid-2-Hydrat-Kristall, Merck, Darmstadt, Deutschland) schloss sich an (modifiziert nach MOTTAGHIAN 1999). Um vergleichbare Ergebnisse der OFS unabhängiger Proben zu erhalten, wurde der Phospholipidgehalt modifiziert nach BARTLETT (BARTLETT 1959; MOTTAGHIAN 1999) auf 3,0 mg/ml Phospholipid in der resuspendierten Probe eingestellt. Hierzu waren drei verschiedene Ansätze nötig. Der erste Ansatz enthielt 5 µl der Surfactantprobe, der zweite Ansatz enthielt 50 µl von 2 mMol/l Phosphatstandard (Dikaliumhydrogenphosphattrihydrat, Merck, Darmstadt, Deutschland). Diesen Ansätzen wurden je 500 µl 70 %ige Perchlorsäure 1 Mol/l (Riedel-de Haën, Seelze, Deutschland) und 200 µl 30 %iges Wasserstoffperoxid hinzugefügt. Eine dritte Probe diente als Leerprobe und enthielt ausschließlich diese beiden letztgenannten Bestandteile. Alle drei Ansätze wurden bei 190 °C über 35 Minuten im Thermoblock verascht, wonach ihnen je 4 ml Aqua bidestillata, 500 µl 25 mM Ammoniummolybdat (Ammoniumheptamolybdat, Merck, Darmstadt, Deutschland) und 200 µl 10%ige Ascorbinsäure (L(+)-Ascorbinsäure, Merck, Darmstadt, Deutschland) hinzugefügt wurden. Die dadurch entstehende grün-blaue Färbung reflektierte den Phosphatgehalt der jeweiligen Probe. Einer Abkühlung im Wasserbad ging eine Inkubation bei 95 °C über 10 Minuten im Thermoblock voraus. Die Bestimmung erfolgte durch ein Photometer (Photometer Nanocolor 100 D, Fa. Macherey-Nagel GmbH und Co. KG, Düren, Deutschland), durch das der Gesamtphospholipidgehalt bei 800 nm gegen den Reagenzienleerwert gemessen wurde. Zur Berechnung der Phospholipidkonzentration wurde die Extinktion der Probe mit der Extinktion der Standards in Beziehung gesetzt. Im

2 Herzlicher Dank gilt Frau Christa Acevedo aus der Klinik für pädiatrische Pneumologie, Allergologie und Neonatologie der Medizinischen Hochschule Hannover für die BAL-Probenaufbereitung und Durchführung der Pulsating Bubble Surfactometrie.

Anschluss daran wurde die Probe mit entsprechender Menge 1,5 mmol/l Calciumchloridlösung ergänzt, bis die angestrebte Phospholipidkonzentration von 3 mg/ml erreicht war (MOTTAGHIAN 1999).

Das Pulsating Bubble Surfactometer^TM (Electronetics Corporation, New York, USA) berechnete die OFS des Surfactants wie folgend aufgeführt (ENHORNING 1977;

MOTTAGHIAN 1999). 37 µl von wie oben beschrieben aufbereitetem Surfactant wurden blasenfrei in Spezialröhrchen (CS-Chromatographie Service GmbH, Langerwehe, Deutschland) gefüllt. Um einheitliche Temperaturbedingungen zu erreichen, umgab ein 37 °C warmes Wasserbad aus entgastem Aqua bidestillata die Küvetten, wie bereits in früheren Studien modifiziert beschrieben (ENHORNING 1977; MOTTAGHIAN 1999). Ein Stempel drang in die Küvette ein, wobei der Surfactant an den Rand gedrängt und somit endgültig von Luftblasen frei wurde.

Beim Zurückziehen des Stempels bildete sich eine Blase, welche nach optischer Kontrolle manuell auf den minimalen Radius eingestellt wurde (Abb.3). Diese Blase pulsierte zwischen dem auf der Küvette markierten minimalen (0,4mm) und maximalen (0,55mm) Radius (ENHORNING 1977) aufgrund der Stempel-bewegungen. In diesem Stadium erfolgte über 10 Sekunden eine Adsorption an der Luft-Flüssigkeitsgrenze durch den Surfactant, indem dieser einen Flüssigkeitsfilm auf der Oberfläche bildete. Es folgte die Vorlaufzeit mit einer manuell eingestellten Pulsationsrate (20 Oszillationen/Minute) und einer Zyklusdauer von jeweils 3 Sekunden. Nach ca. 5 Minuten wurde ein Equilibrium erreicht und die minimale OFS bei minimaler Blasengröße anhand der Resultate aus dem Differenzdruckaufnehmer und dem Laplace´schen Gesetz berechnet. Diese Resultate wurden als Graphen dargestellt. Das dem zugrundeliegende Computerauswertungsprogramm wurde von E. Frieling, M. Dettmer und R. Coldewey 1990/1991 am Frauenhofer Institut für Toxikologie und Aerosolforschung erstellt (Übersicht bei MOTTAGHIAN 1999).

3.2.3. Probenaufbereitung von Surfactantpellets und Lungenparenchym-proben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Die Lungenparenchymproben und die aufkonzentrierten Pellets der BALF wurden für Schnitte für die Elektronenmikroskopie aufgearbeitet (FEHRENBACH u. OCHS 1998;

FEHRENBACH et al. 2000; SCHMIEDL et al. 2003; SCHMIEDL et al. 2004;

MÜHLFELD et al. 2013; BUSLEY et al. 2016)³: Die BALF Proben wurden wie die Parenchymproben für mindestens 12 Stunden in dem ursprünglichen Fixierungs-gemisch belassen. Am zweiten Tag wurden die Blöcke 2 x 6 Minuten mit 0,15 M Hepespuffer und anschließend 4 x 6 Minuten mit 0,1 M Na-Cacodylatpuffer (Fluka, Buchs, Schweiz) gewaschen. Zur Postfixierung lagerten die Proben für 2 Stunden in einem Gemisch aus 1% Osmiumtetroxid (Plano, Wetzlar, Deutschland) und 0,2 M Natrium-Cacodylatpuffer (1:1). Weitere Waschungen über 4 x 5 Minuten in 0,1 M Natrium-Cacodylatpuffer und 2 x 5 Minuten in destilliertem Wasser folgten. Für mindestens 12 Stunden lagerten die Proben in halbgesättigtem, ca. 4 %igem

3 Den Mitarbeiterinnen des Instituts für Funktionelle und Angewandte Anatomie der Medizinischen Hochschule Hannover sei gedankt für die zuverlässige Anfertigung der zahlreichen TEM Schnitte.

Abb.3: Blase eines Pulsating Bubble Surfactometers^TM, eingestellt auf den minimalen Radius (■),

►/◄ begrenzen den

maximalen Radius (modifiziert nach BUSLEY 2014)

■ ■

Uranylacetat (Paesel+Iorei, Duisburg, Deutschland) bei 4 °C. Am dritten Tag wurden die Blöcke erneut gewaschen (2 x 5 Minuten in destilliertem Wasser) und anschließend entwässert (je 2 x 10 Minuten in Aceton 70 % und Aceton 90 %, sowie 3 x 10 Minuten in Aceton 100 %). Den nächsten Schritt bildete die Einbettung der Blöcke bei Raumtemperatur in einem kreisenden Karussell mittels einem 1:1 Epon- (Serva, Heidelberg, Deutschland) Aceton- (J.T. Baker, Griesheim, Deutschland) Gemisch für ca. 60 Minuten. Das Gemisch wurde anschließend durch frisches Epon ersetzt und mindestens 12 Stunden ruhen lassen. Am vierten Tag wurden die Proben in Epon enthaltende Flachbettformen umgebettet. Die Lagerung im Wärmeschrank folgte für 24 Stunden bei 40 °C und anschließende 48 Stunden bei 60 °C (modifiziert nach FEHRENBACH u. OCHS (1998) und MÜHLFELD et al. (2013)).

Anfertigung von Semi- und Ultradünnschnitten

Zunächst wurde der entstandene quadratische Harzblock soweit mit einer Rasierklinge angeschnitten, dass die eingebettete Probe an die Oberfläche gelangte.

Für die Lichtmikroskopie wurden 1 µm starke Semidünnschnitte angefertigt und auf Glasobjektträgern für 10 Sekunden auf einer Heizplatte (80 °C) mit Toludinblau (Certistain®, Toludinblau O, Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) angefärbt.

Die Lichtmikroskopie verschaffte Einblicke darüber, ob tief genug im Präparat geschnitten worden war, sowie über Qualität und Erhaltungszustand des Parenchyms. Nach Auswahl des Areals für die Elektronenmikroskopie wurde der Block weiter angetrimmt und anschließend ultradünn geschnitten (Dicke von ca. 60-70nm). Semi- und Ultradünnschnitte wurden am Ultramikrotom Ultracut E (Leica, Bensheim, Deutschland) durchgeführt. Die Ultradünnschnitte wurden auf mit Formar (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland) befilmte Einzelschlitzgrids (single slot grids) aufgefangen. Die Kontrastierung folgte für 15 Minuten mit Uranylacetat und für weitere 2 Minuten mit Bleicitrat (Merck, Darmstadt, Deutschland). Bei Raum-temperatur lagerten die sogenannten „single slot grids“ bis zu ihrer Auswertung in speziellen Gridboxen) (modifiziert nach SCHMIEDL et al. 2004, BUSLEY 2014).