Tierärztliche Hochschule Hannover
Charakterisierung des Surfactantsystems und dessen Veränderungen durch
Lungenadenokarzinomatose bei Schafen unter Berücksichtigung der Selenversorgung
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
-Doctor medicinae veterinariae- (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
A r i a n e U l r i k e J ö r g e r , g e b . J a c o b i Holzminden
Hannover 2016
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Martin Ganter
Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorische Klinik,
Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. Dr. Andreas Schmiedl
Institut für Funktionelle und Angewandte Anatomie
Medizinische Hochschule Hannover
PD Dr. Esther Humann-Ziehank
Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorische Klinik,
Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. Martin Ganter
Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorische Klinik,
Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Gutachterin: Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein Institut für Pathologie
Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 27.Oktober.2016
In Zusammenarbeit mit dem Institut für Funktionelle und Angewandte Anatomie der Medizinischen Hochschule Hannover.
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG ... 11
2. LITERATUR ... 12
2.1. Lungenadenokarzinomatose ... 12
2.1.1. Epidemiologie ... 12
2.1.2. Pathogenese ... 13
2.1.2.1. Anatomie der Schaflunge ... 13
2.1.2.2. Das Jaagsiekte Sheep Retrovirus ... 13
2.1.2.3. Infektion und Krankheitsverlauf ... 15
2.1.2.4. Zielstrukturen des JSRV und Tumorentstehung ... 15
2.1.2.5. Herdensanierung nach JSRV Infektionen ... 18
2.1.3. Klinische Ausprägung ... 19
2.1.4. Diagnostische Nachweismethoden ... 20
2.1.5. Pathologie und Histopathologie ... 21
2.2. Typ II Pneumozyten ... 22
2.2.1. Funktion ... 22
2.2.2. Lebenszyklus ... 23
2.2.3. Zellbestandteile... 23
2.2.4. Rolle der Typ II Pneumozyten bei OPA ... 24
2.3. Surfactant ... 25
2.3.1. Funktion ... 25
2.3.2. Zusammensetzung ... 26
2.3.3. Auf- und Abbau ... 28
2.3.4. Rolle von Surfactant bei OPA ... 28
2.4. Selen ... 29
2.4.1. Funktion von Selen im Säugetierorganismus ... 29
2.4.2. Auswirkungen von Selenmangel bei Schafen ... 30
2.4.3. Rolle von Selen bei der Tumorentstehung ... 31
2.5. Verfahrenstechniken ... 33
2.5.1. Bronchoalveoläre Lavage ... 33
2.5.2. Pulsating Bubble Surfactometrie ... 35
2.5.3. Transmissionselektronenmikroskopie ... 36
2.5.4. Computertomographie ... 37
2.5.5. Stereologie und Auswertungsprinzip ... 39
2.6. Ziele und Aufgabenstellung ... 41
3. MATERIAL UND METHODEN ... 43
3.1. Herkunft des Probenmaterials ... 43
3.1.1. Lungenadenokarzinomatose positiv getestete Schafe und ihr Selenstatus ... 43
3.1.2. Lungengesunde Schafe und ihr Selenstatus ... 47
3.2. Aufbereitung des Probenmaterials ... 49
3.2.1. Probenmaterial der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit ... 49
3.2.2. Funktionsmessung der BALF Pellets mittels Pulsating Bubble Surfactometer ... 50
3.2.3. Probenaufbereitung von Surfactantpellets und Lungenparenchymproben für die Transmissionselektronenmikroskopie ... 52
3.3. Probenmessungen und Probenauswertungen ... 54
3.3.1. Auswertung der Pulsating Bubble Surfactometrie ... 54
3.3.2. Auswertung der BALF Proben am TEM ... 55
3.3.2.1. Auswertung der BALF Proben am STEPanizer© ... 57
3.3.2.2. Berechnung von Volumendichten, Oberflächendichten und Volumen- Oberflächenverhältnissen der BALF ... 60
3.3.3. Auswertung der Lungenparenchymproben am TEM ... 62
3.3.3.1. Auswertung der Lungenparenchymproben am STEPanizer© ... 64
3.3.3.2. Berechnung von Volumendichten, Oberflächendichten und Volumen- Oberflächenverhältnissen subzellulärer Kompartimente ... 65
3.3.4. Computertomographische Schnittbilder von Schaflungen ... 66
3.3.4.1. Auswertung der computertomographischen Lungenschnitte am STEPanizer©66 3.3.4.2. Cavalieriprinzip zur Ermittlung des intravitalen Lungenparenchymvolumens 68 3.4. Statistische Methoden ... 68
4. ERGEBNISSE ... 70
4.1. Zugrundeliegende Ergebnisse der Voruntersuchungen ... 70
4.1.1. OPA positiv getestete Schafe ... 70
4.1.2. Kontrollschafe ... 70
4.1.3. OPA positiv getestete Schafe und Kontrollschafe ... 71
4.2. Oberflächenaktivität des mittels BAL gewonnenen Surfactants ... 72
4.2.1. Vergleich zwischen OPA positiven und gesunden Kontrollschafen ... 72
4.2.2. Vergleich zwischen marginaler und bedarfsgerechter Selenversorgung OPA positiver Schafe ... 72
4.2.3. Vergleich zwischen marginaler und bedarfsgerechter Selenversorgung lungengesunder Kontrollschafe... 73
4.2.4. Oberflächenspannungen des BALF-Surfactants ... 74
4.3. Ultrastruktur und Verteilung der Surfactant-Subtypen in der BALF ... 75
4.3.1. Vergleich zwischen OPA positiven und gesunden Kontrollschafen ... 76
4.3.2. Vergleich zwischen OPA positiven Schafen mit marginaler und bedarfsgerechter Selenversorgung ... 80
4.3.3. Vergleich zwischen lungengesunden Kontrollschafen bei marginaler und bedarfsgerechter Selenversorgung ... 80
4.3.4. Lungensurfactant gesunder Kontrollschafe ... 83
4.4. Subzelluläre Volumendichten der Typ II Pneumozyten ... 87
4.4.1. Vergleich zwischen OPA positiven und gesunden Kontrollschafen ... 88
4.4.2. Vergleich zwischen OPA positiven Schafen mit marginaler und bedarfsgerechter Selenversorgung ... 90
4.4.3. Vergleich zwischen lungengesunden Kontrollschafen mit marginaler und bedarfsgerechter Selenversorgung ... 91
4.4.4. Vergleich von makroskopisch tumorös veränderten Lungenbereichen mit makroskopisch unveränderten Lungenbereichen in OPA positiven Schafen ... 91
4.4.5. Subzelluläre Volumendichten von Typ II Pneumozyten lungengesunder Kontrollschafe ... 92
4.5. Lungenvolumenbestimmung ... 94
4.5.1. Lungenvolumenbestimmung gesunder Kontrollschafe nach Scherle ... 94
4.5.2. Lungenparenchymvolumenbestimmung OPA positiver und gesunder Kontrollschafe nach Cavalieri mittels CT Auswertung ... 95
5. DISKUSSION ... 98
5.1. Diskussion des Versuchsaufbaus/Methodenkritik ... 99
5.1.1. Versuchstiere ... 99
5.1.2. Einbettung ... 100
5.1.3. Anwendung von beim Menschen etablierten Methoden bei Schafen ... 101
5.1.4. Selen ... 101
5.1.5. Auswertungen ... 103
5.2. Pulsating Bubble Surfactometrie ... 104
5.2.1. Technik ... 104
5.2.2. Ergebnisse ... 104
5.3. BALF Ergebnisse ... 107
5.3.1. Vergleich zwischen OPA positiven Schafen und Kontrollschafen ... 108
5.3.1.1. Erhöhtes Auftreten von lamellenkörperähnlichen Strukturen und tubulärem Myelin bei OPA Schafen ... 108
5.3.1.2. Ursachen für eine möglicherweise erhöhte Surfactantsezernierung bei OPA Schafen ... 112
5.3.1.3. Erhöhtes Auftreten von multivesikulären Vesikeln bei OPA Schafen ... 113
5.3.1.4. Vermehrtes Auftreten von multilamellären Vesikeln bei Kontrollschafen bei gleichbleibenden Werten der unilamellären Vesikel... 114
5.3.1.5. Surfactantveränderungen in Abhängigkeit von dem Selenstatus bei OPA Schafen ... 115
5.3.1.6. Surfactantveränderungen in Abhängigkeit von dem Selenstatus bei Kontrollschafen ... 117
5.4. Subzelluläre Volumendichten der Typ II Pneumozyten ... 118
5.4.1. Vermehrtes Auftreten von Lamellenkörpern bei Kontrollschafen gegenüber OPA positiven Schafen ... 118
5.4.2. Vermehrtes Auftreten von Lamellenkörpern in tumorfreien Arealen von OPA
Schafen gegenüber tumorösem Parenchym ... 120
5.4.3. Lamellenkörper in tumorfreien Arealen und Kontrollschafen ... 121
5.4.4. Fehlende Veränderungen weiterer subzellulärer Parameter im Gruppenvergleich 122 5.4.5. Selenabhängigkeit subzellulärer Volumendichten in Typ II Pneumozyten ... 123
5.5. Computertomographie und Lungenvoluminabestimmung ... 125
5.6. Fazit ... 126
6. ZUSAMMENFASSUNG ... 129
7. SUMMARY ... 131
8. LITERATURVERZEICHNIS ... 133
DANKSAGUNGEN ... 151
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abb. Abbildung
AP Alkalische Phosphatase
A.pp. Actinobacillus pleuropneumoniae BAL Bronchoalveoläre Lavage
BALF Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit bzw. beziehungsweise
CT Computertomographie DNA Deoxyribonucleic acid
ELISA Enzyme Linked Immunosorbant Assay
env Envelope Gen des Jaagsiekte Sheep Retrovirus FS Frischsubstanz
GF-AAS Graphitrohratomabsorptionsspektrometrie GPx Glutathion-Peroxidase
GSH Glutathion
GST Glutathion-S-Transferase HE Hounsfield-Einheiten i.m. intramusculär
i.v. intravenös
IQR Interquartile Range
JSRV Jaagsiekte Sheep Retrovirus KGW Körpergewicht
LA large aggregats, Bezeichnung für aktive Surfactant-Subtypen LTR long terminal repeat
MVV Maedi-Visna Virus mlv multilamellärer Vesikel mw Mittelwert
OFS Oberflächenspannung
OPA Ovine Pulmonary Adenocarcinoma orf open reading frame
PBS Pulsating Bubble Surfactometer PCR polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid
rpm rounds per minute
SA small aggregats, Bezeichnung für inaktive Surfactant–Subtypen Se+ bedarfsgerechte Selenversorgung
Se- marginale Selenversorgung SP Surfactantprotein
Tab. Tabelle
TEM Transmissionselektronenmikroskop ulv unilamellärer Vesikel
1. Einleitung
Das Jaagsiekte sheep Retrovirus (JSRV) induziert die ovine Lungen- adenokarzinomatose (PALMARINI et al. 1999). Von diesem übertragbaren Tumor sind vor allem Typ II Pneumozyten und Clarazellen betroffen (PLATT et al. 2002).
Erkrankte Schafe gelten als Tiermodell für humane Lungenadenokarzinome, da in der Tumorentstehung viele Parallelen vorliegen. Aufgrund der Vielfalt der Untersuchungsmöglichkeiten insbesondere in frühen Phasen des Tumorwachstums und der Vergleichbarkeit zu Menschen, eignen sich Schafe mit Lungen- adenokarzinomatose, um ein besseres Verständnis für Krebserkrankungen bei Menschen zu erlangen (PALMARINI u. FAN 2001; YOUSSEF et al. 2015).
Möglicherweise sind auch einige menschliche Lungentumoren auf Virustypen zurückzuführen, die dem JSRV sehr ähneln (DE LAS HERAS et al. 2000), weswegen diesbezüglich noch großer Forschungsbedarf besteht.
Unklar ist weiterhin, ob eine bedarfsgerechte Selenversorgung eine tumorprotektive Wirkung hat. In verschiedenen Studien kann ein Zusammenhang zwischen der Selenversorgung und Tumorprogression (ALWAHAIBI et al. 2010) hergestellt werden, während andere Studien dies bei bereits bestehenden Tumoren nicht bestätigen können (ENDERMANN 2011; HUMANN-ZIEHANK et al. 2013a).
Ziel der Untersuchungen sind detaillierte Informationen über die Strukturerhaltung des Lungenparenchyms und über mögliche Veränderungen im Surfactantsystem bei an Lungenadenokarzinomatose erkrankten Schafen sowie die Schaffung von Orientierungswerten für gesunde Schafe. Die Fragestellung, ob die Selenversorgung der Schafe Einfluss auf die Tumorprogression und als Faktor des antioxidativen Systems Auswirkungen auf das Surfactantsystem nimmt, wird bei den Auswertungen berücksichtigt.
2. Literatur
2.1. Lungenadenokarzinomatose
2.1.1. Epidemiologie
Das JSRV induziert die ovine Lungenadenokarzinomatose (ovine pulmonary adenocarcinoma, OPA) (PALMARINI et al. 1999). Von diesem Tumor sind laut transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen durch PLATT et al. (2002) zu ca. 82% Typ II Pneumozyten, zu 7% Clarazellen und 11% undifferenzierte Zellen befallen. Empfänglich sind ausschließlich Schafe und Ziegen. Es treten Atem- beschwerden auf, welche mit einem hochgradigen Nasenausfluss, Rassel- geräuschen und vereinzeltem Husten einhergehen können (GANTER 2009). Nach andauernd chronischem Voranschreiten über Monate oder Jahre, endet diese Erkrankung tödlich (DUNGAL 1938). Es kommt zu Abmagerung trotz erhaltener Fresslust und letztlich zu Hypoxie und Herz-Kreislaufversagen (GANTER 2009).
Betroffene Altersklassen mit klinischen Symptomen reichen von 2 Monate bis 11 Jahre alten Schafen (SHARP u. DE LAS HERAS 2000). Auch laut DUNGAL (1938) können alle Altersklassen von der Infektion betroffen sein, wobei der Großteil älter als sieben Monate ist. Da durch mutterlose Handaufzucht eine Übertragung verhindert werden kann, ist anzunehmen, dass diese erst postpartal stattfindet und der intrauterinen Übertragung kein deutlicher Anteil zukommt (KRÄMER 2001;
VOIGT et al. 2007b).
Das JSRV ist weltweit verbreitet (ausgenommen die Falkland Inseln, Australien und Neuseeland) (GRIFFITHS et al. 2010). Die Prävalenz bei Schlachtschafen in Deutschland liegt zwischen 0,18% (WEILAND 1966), 0,2% (SCHULZ et al. 1965) und 2,4% (PROSKE u. WIEGAND 1991). In betroffenen Herden kann es bei Neuinfektionen zu hohen Verlustraten kommen (DUNGAL 1938). In bereits
endemisch erkrankten Herden in Schottland bewegt sich die Verlustrate zwischen 2-10% pro Jahr (SHARP u. DE LAS HERAS 2000).
2.1.2. Pathogenese
2.1.2.1. Anatomie der Schaflunge
Die Trachea von Schafen teilt sich in zwei Bronchi principales und einen noch vor der Bifurkation abgehenden Bronchus trachealis, der zum Lobus cranialis der rechten Lunge führt. Aus den Hauptbronchien entspringen rechts der Lobus medius, Lobus caudalis und Lobus accessorius, während die linke Lunge statt in vier nur in zwei Lungenlappen (Lobus cranialis und Lobus caudalis) gegliedert ist. Der weitere Weg zu den Alveolen führt durch Segmentbronchen, die in Bronchuli münden, welche im Gegensatz zu den vorherigen luftleitenden Wegen keine knorpelige Stütze besitzen.
Die daraus abgehenden Bronchuli respiratorii spalten sich nachfolgend in Alveolengänge (Ductus alveolares) mit Alveolensäckchen (Sacculi alveolares) und den Alveoli pulmonis. Benachbarte Alveolen sind jeweils durch ein gemeinsames Septum interalveolare getrennt. Die innere Oberfläche der Alveolen wird von Typ I Pneumozyten bedeckt. In Lücken aufgrund von vorwölbenden Kapillaren sind die Surfactant produzierenden Typ II Pneumozyten anzutreffen. Auch Alveolar- makrophagen können hier aufzufinden sein (WEIBEL 1999).
Ein Gasaustausch findet nur im Bereich der Bronchuli respiratorii, der Ductus alveolares, Sacculi alveolares und der Alveolen statt, wobei die Bronchuli respiratorii bei Wiederkäuern selten vorkommen (LIEBICH 2004).
2.1.2.2. Das Jaagsiekte Sheep Retrovirus
Bei dem JSRV handelt es sich um einen Betaretrovirus. Wie andere Retroviren enthält es behüllte Virionen, welche zwei identische einzel(+)-strängige RNA Genome enthalten (GRIFFITHS et al. 2010). Das Virus enthält vier essentielle Gene, die typisch für Retroviren sind und essentielle virale Proteine verschlüsseln: gag, pro, pol und env, sowie 2 long terminal repeats (LTR). gag kodiert die inneren
Strukturproteine des Virions (matrix, capsid und nucleocapsid), pro verschlüsselt das Leseraster für Protease und pol beinhaltet die reverse Transkriptase und Integrase.
Diese Gene sind open reading frames (orf). orf x bildet einen weiteren open reading frame mit unklarer Funktion, welcher pol überschneidet (PALMARINI et al. 1999;
ROSATI et al. 2000; ARNAUD et al. 2008; GRIFFITHS et al. 2010). Envelope (env) kodiert die Oberflächen- und Transmembranglykoproteine (GRIFFITHS et al. 2010).
Es fungiert auch als Onkogen und reicht aus, um eine Zelltransformation zu induzieren (MAEDA et al. 2001). Env reguliert die Bindung an spezifische Zellrezeptoren (WEISS u. TAILOR 1995).
Die LTR beinhalten den viralen Promotor und enhancer Elemente, welche speziell mit der zellulären Transkription interagieren. Nach viralem Eintritt und Integration sorgt die LTR für eine effizientere Virusexpression von Zellen mit Transkriptions- faktoren, welche mit den enhancer Elementen interagieren (Übersicht bei PALMARINI et al. 2000).
Es wird zwischen endogenem und exogenem JSRV unterschieden. Endogene Retroviren sind im Genom verankert und werden vertikal von Generation zu Generation übertragen, während exogene Retroviren sich horizontal verbreiten und nicht infizierte Individuen anstecken können (ARNAUD et al. 2008; MAGER u.
STOYE 2015). Im Genom von Schafen sind mindestens 27 Kopien von endogenen JSRV Proviren enthalten, wovon 5 intakt sind (ARNAUD et al. 2007). Es wird vermutet, dass das Einschleusen endogener JSRV in das Schafgenom den selektiven Vorteil im Laufe der Evolution hatte, dass diese Tiere weniger anfällig gegenüber anderen Retroviren sind. Grund dafür ist die Verdrängung von Rezeptoren, an welche exogene Retroviren ansetzen würden. Es wäre möglich, dass die Quantität und Qualität von endogenen JSRV im Schafsgenom die individuelle und auch rassebedingte Anfälligkeit beziehungsweise (bzw.) Resistenz gegenüber JSRV beeinflusst (ARNAUD et al. 2008). Auch WEISS und TAILOR (1995) beobachten, dass eine persistierende Retrovirusinfektion aufgrund von Rezeptor- blockierung oder Rezeptorherabregulation eine Superinfektion verhindert. Ein Nachweis von endogenem JSRV gelingt auch im Genom von Ziegen an acht unterschiedlichen Chromosomenpositionen (CARLSON et al. 2003).
2.1.2.3. Infektion und Krankheitsverlauf
Eine Übertragung des JSRV erfolgt aerogen, indem gesunde Schafe die Expirationsluft OPA infizierter Schafe einatmen (DUNGAL 1946). Die Inkubationszeit beträgt 6–8 Monate bei adulten Schafen (DUNGAL 1938). Durch intratracheale Virusapplikation erkranken sieben Tage alte Lämmer bereits binnen weniger Wochen (SALVATORI et al. 2004). Nachdem JSRV eingeatmet wurde, infiziert es Zellen wie Lymphozyten und myeloische Zellen, sowie primär Epithelzellen der Lunge. Typ II Pneumozyten und Clarazellen exprimieren env und aktivieren somit ihre Proliferation und ihr malignes Wachstum, letztlich kann es zur Metastasierung in Lymphknoten kommen (GRIFFITHS et al. 2010). Die histologischen Veränderungen weisen auf ein Adenokarzinom hin (GARCIA-GOTI et al. 2000).
Es entwickeln sich große Tumore mit teils zentraler Nekrose und vermehrter Lungenflüssigkeitsproduktion, was wiederum die Virusausscheidung erhöht. Die Tiere versterben entweder direkt oder im Rahmen einer Sekundärinfektion (GRIFFITHS et al. 2010).
In der entstehenden Lungenflüssigkeit befinden sich ca. 107-1010 Kopien von JSRV RNA pro ml. Der Virus bleibt unter feuchtwarmen Umgebungsbedingungen länger als 14 Tage nachweisbar. Ein Zusammenhang zwischen produzierter Flüssigkeitsmenge und Virusgehalt besteht nicht (COUSENS et al. 2009).
2.1.2.4. Zielstrukturen des JSRV und Tumorentstehung
OPA wird durch eine Infektion gesunder, proliferierender Typ II Pneumozyten mit JSRV ausgelöst, da das Virus bevorzugt Zellen in Mitose infiziert. Jungtiere, die verhältnismäßig mehr Typ II Pneumozyten besitzen, sind aufgrund der bis zu 50-fach höheren Proliferationsrate deutlich anfälliger für eine Infektion mit dem JSRV als gesunde adulte Tiere (MURGIA et al. 2011).
Bei adulten Tieren besteht eine höhere Anfälligkeit, wenn eine Vorschädigung des Lungenepithels vorliegt (MURGIA et al. 2011). Diese Beobachtung passt dazu, dass OPA in einigen Studien häufig oder ausschließlich in Vergesellschaftung mit weiteren Lungenerkrankungen vorgefunden wird (PROSKE u. WIEGAND 1991; GANTER 1996).
Anhand verschiedener Mäusezelllinien ist feststellbar, dass der LTR des JSRV vorzugsweise auf differenzierten Lungenepithelzellen präsentiert wird (insbesondere Surfactantprotein (SP) B präsentierende Typ II Pneumozyten und Clarazellen) (PALMARINI et al. 2000). Das Einfügen eines Provirus in die Umgebung von Proto- Onkogenen führt zur Überexpression der Proto-Onkogene aufgrund von hoher Aktivität der Transkriptionsregulationselemente der LTR (MAEDA et al. 2001).
Mittels welcher Mechanismen env die Tumorentstehung auslöst, ist noch unklar (HOFACRE u. FAN 2010). JOHNSON et al. (2011) zeigen, dass das env in einer Kultur von purifizierten, primären Typ II Pneumozyten von Ratten einen Wachstums- vorteil verursacht. Zusätzlich können durch env die kulturellen Zelllinien länger überleben und sterben erst nach und nach ab. Das diesen Untersuchungen zugrunde liegende System kann verwendet werden, um das env in primären Typ II Pneumozyten in vitro zu studieren. Typ II Pneumozyten stellen die Zielstruktur der Onkogenese von JSRV dar. Es wird angenommen, dass durch die erhöhte Proliferation in Zielzellen des JSRV die virale Replikation gefördert wird und die Tumorbildung lediglich einen Nebeneffekt darstellen könnte (JOHNSON et al. 2011).
Aufgrund der verlängerten Inkubationszeit und des langsamen Fortschreitens klinischer Symptome wird vermutet, dass eine virusbedingte genetische Veränderung der Tumorzellen wichtig für deren Pathogenese sein könnte (DEMARTINI et al.
2001). Nach DEMARTINI et al. (2001) sind die verschiedenen Stadien von OPA abhängig von verschiedenen pathogenetischen Mechanismen und OPA folglich ein Modell für die multistep Kanzerogenese nach FAN. Dieses Modell beschreibt die Tumorentstehung anhand von Leukämie bei Mäusen, welche durch das Moloney murine leukemia Virus induziert wird. Es ist unterteilt in vorhergehende Ereignisse (Knochenmarkschädigungen, Milzhyperplasie), Tumorentwicklung (Aktivierung des LTR durch Proto-Onkogene, autokrine Stimulation von Interleukin-2 Rezeptoren) und Tumorwachstum (Trisomie des Chromosoms 15, LTR Aktivierung in Tumor- wachstumslokalisationen) (FAN 1997).
CAPORALE et al. (2013) können anhand speziesvergleichenden experimentellen Infektionen von Schaf- und Ziegenlämmern mit JSRV feststellen, dass die Lungen- läsionen sich deutlich unterscheiden. In dem Versuchsansatz werden Lämmer am
zweiten Lebenstag intratracheal infiziert. Im Alter von fünf Monaten werden nach der Euthanasie Lungenparenchymproben gesammelt. Während bei Ziegenlämmern klar pathologisch-anatomisch abgrenzbare Läsionen ohne klinische Symptome entstehen, ergibt sich bei Schaflämmern das für OPA typische Bild mit infiltrativem Tumorwachstum und der Entstehung der respiratorischen Symptomatik. Des Weiteren stellt sich heraus, dass Ziegenlämmer zwar durch JSRV infiziert werden können, es auch zu einer Tumorentstehung in den Typ II Pneumozyten kommt, jedoch keine Virusreplikation stattfindet (CAPORALE et al. 2013). Die Dichte an proliferierenden Typ II Pneumozyten ist bei neugeborenen Schaf- und vier Tage alten Ziegenlämmern identisch (MURGIA et al. 2011; CAPORALE et al. 2013). Es findet bei Ziegenlämmern keine Immunabwehr gegen JSRV statt, was den abweichenden Verlauf der Erkrankung im Vergleich zu Schaflämmern hätte erklären können.
Möglich wäre, dass JSRV-Proteine bei Ziegen als Autoantigene erkannt und daher keine Antikörper gebildet werden. Vermutlich vermehrt sich das JSRV nach der Infektion bei Schafen in den infizierten Typ II Pneumozyten. Es befällt angrenzende Typ II Pneumozyten und schafft so multiple Tumorlokalisationen, welche in einander verschmelzen können. Dies entspricht der unter 2.1.5. beschriebenen klassischen OPA Form. Bei JSRV-Infektionen von Schafen mit nicht vermehrungsfähigen Stämmen tritt eine fokale Veränderung des Lungengewebes auf, die identisch mit jenen Läsionen ist, welche bei Ziegen mit Wildtyp-Infektionen entstehen. Dieses ähnelt der atypischen OPA Form, welche unter 2.1.5. genauer beschrieben ist. So können nur die primären Zielzellen entarten und sich durch Zellteilung vermehren, jedoch keine zusätzlichen Zielzellen erkranken. Vermutlich begrenzen Ziegenzellen Schritte im Replikationszyklus von JSRV (CAPORALE et al. 2013). Voraussetzung für eine JSRV Infektion und Viruspräsentation ist, dass die Zellen über die Rezeptoren, Proliferations- und Transkriptionsfaktoren verfügen. Kommt es bei diesen Faktoren zu Veränderungen, kann die Anfälligkeit für JSRV beeinträchtigt sein (MARTINEAU et al. 2011).
Bei Ziegen können Infektionen nur durch initial hohe Virusgaben verursacht werden, welche unter Feldbedingungen kaum auftreten. Das erklärt das generell sehr seltene Vorkommen von Lungenadenokarzinomatose bei Ziegen (CAPORALE et al. 2013).
SUMMERS et al. (2005) zeigen, dass bei einer JSRV Infektion von Schaflämmern zwar eine Immunreaktion stattfindet, diese jedoch durch lokale Hemmung der Makrophageninvasion uneffektiv ist. Als Ursache wird das Vorliegen einer peripheren Toleranz um die Tumorlokalisationen herum durch die hemmenden Faktoren von Surfactantproteinen vermutet. Nachdem die Zielzelle infiziert ist und die Tumorentstehung begonnen hat, kommt es zum Einstrom unreifer Makrophagen in den Alveolarraum im Bereich der Umfangsvermehrung. Folglich muss davon chemotaktische Aktivität ausgehen, dennoch dringen nur wenige Makrophagen in den Tumor ein. Obwohl immer mehr unreife Makrophagen einströmen, die im Alveolarraum ausreifen, gelingt keine effektive Immunantwort (SUMMERS et al.
2005). Es wird vermutet, dass die Immunsuppression eine Konsequenz aus der Expression von retroviralen Proteinen darstellt. Dies wurde bereits bei mehreren anderen Krankheiten, wie dem Felinen Immundefizienzvirus oder dem Manson-Pfizer Monkey Virus festgestellt, indem immunsuppressive regulatorische T-Zellen aktiviert werden (Übersicht bei SUMMERS et al. 2005).
2.1.2.5. Herdensanierung nach JSRV Infektionen
Der Versuch Lämmer unmittelbar nach der Geburt von dem Mutterschaf zu trennen und mutterlos aufzuziehen, um eine Übertragung von JSRV zu vermeiden, gelingt nicht vollständig, senkt aber deutlich die Rate der Neuinfektionen (KRÄMER 2001).
Lämmer, die bei ihren infizierten Müttern aufgezogen werden, erkranken deutlich häufiger an Lungenadenokarzinomatose. Verwandtschaftliche Abhängigkeit innerhalb der Herde bezüglich der Anfälligkeit für OPA kann durch KRÄMER (2001) nicht nachgewiesen werden. Es wird vermutet, dass Lämmer sich erst peri- oder postnatal mit dem JSRV infizieren (KRÄMER 2001). Nach mutterloser Aufzucht eines weiteren Jahrgangs, kann weder makroskopisch, noch histologisch oder per polymerase chain reaction (PCR) ein Hinweis auf Lungenadenokarzinomatose gefunden werden (VOIGT et al. 2007b). Folglich kann vermutet werden, dass Lungenadenokarzinomatose durch mutterlose Aufzucht ausgelöscht wird, jedoch nicht sicher binnen eines Durchganges (VOIGT et al. 2007b). In einer Gruppe von insgesamt 840 Schafen, bestehend aus mutterlos aufgezogenen und deren
Nachkommen, ist lediglich ein Schaf OPA positiv (0,12%) (VOIGT 2004). Vor der Herdensanierung kann bei 17,3% der Schlachtschafe makroskopisch und/oder histologisch OPA nachgewiesen werden (KRÄMER 2001). Somit stellt die mutterlose Aufzucht ein geeignetes Verfahren mit geringem Risiko zur Sanierung einer mit OPA befallenen Herde dar (VOIGT 2004).
2.1.3. Klinische Ausprägung
Der Krankheitsverlauf ist bereits seit Jahrzehnten wissenschaftlich beschrieben.
Dieser ist chronisch und erkrankte Tiere können durch vereinzeltes Husten oder übermäßig lang andauernde erhöhte Atemfrequenz nach Belastung auffallen. Im Ruhezustand kann eine betroffene Herde symptomfrei erscheinen. Der Krankheitsverlauf zieht sich über Wochen bis Jahre hin. In dieser Zeit ist keine Erhöhung der Körpertemperatur zu messen bis eine terminale Lungenentzündung entsteht. Die Fresslust bleibt meist sehr lange erhalten (DUNGAL 1938).
Tritt eine klinische Erscheinung auf, sterben die betroffenen Tiere oftmals im Zusammenhang mit Sekundärinfektionen oder werden getötet. Zu diesem Zeitpunkt sind tumoröse Veränderungen weit in der Lunge verbreitet und es können Metastasierungen in die umgebenden Lymphknoten stattgefunden haben.
Atemprobleme stellen sich ein, da vermehrt Lungenflüssigkeit gebildet wird. Dies führt zu Husten und auch Nasenausfluss, wodurch eine Kontamination der Umgebung stattfindet. Die Bildung von vermehrter Lungenflüssigkeit wird bei experimentell infizierten Tieren selten beobachtet, kann aber bereits 7 Wochen nach der Infektion auftreten (GRIFFITHS et al. 2010). Indem die Hinterbeine eines Schafs angehoben und der Kopf gesenkt wird, kann anhand des sogenannten Schubkarrentests festgestellt werden, ob es zu einem vermehrten Nasenausfluss kommt, wie es typisch für Lungenadenokarzinomatose ist (DUNGAL 1938; SHARP u. DE LAS HERAS 2000). Dabei können bis zu 300 ml Lungenflüssigkeit gewonnen werden (PALMARINI u. FAN 2001).
2.1.4. Diagnostische Nachweismethoden
Die morphologische Beurteilung von Schafslungen auf Schlachthöfen, ermöglicht 90% der an Lungenadenokarzinomatose erkrankten Schafe zu identifizieren und somit Herkunftsbestände auszumachen (PROSKE u. WIEGAND 1991). Im Anschnitt haben die tumorösen Veränderungen eine gräuliche Farbe (DUNGAL 1938).
Postmortal erscheinen die vergrößerten Lungen schwer und fest, ihre Luftwege enthalten große Mengen an Mukus (DAWSON et al. 2005). Histologisch erweisen sich die Tumorknoten als Proliferationen des Lungenepithels (DUNGAL 1938).
In postmortal gewonnener bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) fällt bei der Lungenadenokarzinomatose ein deutlich höherer Anteil an neutrophilen Granulozyten im Vergleich zum Maedi-Visna Virus (MVV) auf, dennoch ist die Aussagekraft von Lungenerkrankungen allein anhand von Zelldifferenzierungen zu unsicher (DAWSON et al. 2005). Das MVV kann neben Encephalomyelitis, Mastitis und Arthritiden auch eine interstitielle Pneumonie verursachen, weswegen es eine klinische Differentialdiagnose von OPA darstellt (GANTER 2009). Im Vergleich zur MVV, sind bei Tieren mit OPA deutlich mehr jugendliche Zellen bzw. Tumorzellen in der BALF zu finden. Die BALF von Schafen mit OPA ist außerdem durch eine erhöhte Aktivität der Alkalischen Phosphatase in dem Epithelial lining fluid gekennzeichnet, was als Diagnostikum genutzt werden kann (GANTER 1996).
Mittels hemi-nested PCR gelingt ein 100%iger Nachweis von proviraler JSRV-DNA in Tumorgewebe. Ein Nachweis in Euter und Gehirn ist nicht möglich. In Leukozyten aus peripherem Blut kann bei 50% von präklinisch erkrankten OPA positiven Schafen provirale JSRV-DNA nachgewiesen werden (GONZALEZ et al. 2001). In anderen Studien hingegen beträgt die Sensitiviät einer hemi-nested PCR des buffy coat subklinisch erkrankter Schafe < 10% (VOIGT et al. 2007a).
Der intravitale Nachweis der proviralen JSRV-DNA mittels hemi-nested PCR gelingt am sichersten in der BALF, welcher dem Nachweis im Blut massiv überlegen ist.
Ursache dafür ist, dass im Blut geringere Mengen an viralem Material vorliegen. Die Sensitivität des Tests beträgt im Durchschnitt 89% bei BALF- und 10% bei dem buffy coat von Blutproben. Bei klinisch auffälligen Tieren beträgt die Sensitivität der PCR
aus der BALF 100%. Eine PCR zum Nachweis von proviraler JSRV-DNA in makroskopisch tumorös verändertem Lungenparenchym hat ebenfalls eine Sensitivität von 100% (VOIGT et al. 2007a). Die PCR aus einer BALF stellt die sicherste Nachweismethode von proviraler JSRV-DNA am lebendigen Schaf dar (VOIGT 2004).
Auch die Darstellung der Tumore über röntgenologische oder computer- tomographische Untersuchungen der Lunge ist möglich. Die Röntgenaufnahmen in zwei Ebenen dienen bei Verdacht auf OPA der Bestimmung der Lokalisation des vermuteten Tumorgewebes und der Lokalisation des anschließend zu spülenden Bronchus für die diagnostische BAL. Röntgenologisch können Lungenveränderungen ab einem Durchmesser von 1 cm erkannt werden (GANTER 1996). Computer- tomographische Untersuchungen haben den großen Vorteil, dass im Gegensatz zu Röntgenaufnahmen auch kleinere Tumorknoten oder Gewebeverdichtungen erkennbar sind (HUMANN-ZIEHANK et al. 2011b).
2.1.5. Pathologie und Histopathologie
Die makroskopischen Veränderungen durch OPA in Lungen variieren zwischen Tumorknoten von 0,5-2 cm Größe bis zu großen Tumoren, welche sich über die gesamte Hälfte von Lungenlappen erstrecken können (DE LAS HERAS et al. 2003).
Histologisch sind mehrere Stellen mit neoplastischer Proliferation zu erkennen, welche sich sowohl in bronchialen, als auch in alveolären Regionen ausbreiten (DE LAS HERAS et al. 2003). Die neoplastischen Veränderungen treten überwiegend in Typ II Pneumozyten auf (PLATT et al. 2002). Zu unterscheiden sind die klassische Form von OPA und die atypische Form (GARCIA-GOTI et al. 2000; GONZALEZ et al. 2001). Bei der klassischen Form liegt ein diffuser Tumor vor, welcher sich primär auf die cranioventralen Lungenlappen beschränkt. Im Anschnitt ist der Tumor nässend. Die luftleitenden Wege sind meist mit schaumiger Flüssigkeit gefüllt. Die atypische Form von OPA zeigt entweder einen einzelnen Tumorknoten (ca. 3-5 cm im Durchmesser) oder mehrere kleine Knoten. Im Anschnitt sind diese hart, weiß und
trocken. In den Bronchien ist keine Flüssigkeit und der Knoten scheint deutlich vom umliegenden Gewebe demarkiert (GARCIA-GOTI et al. 2000; DE LAS HERAS et al.
2003). Histopathologisch zeigen beide Formen papillomatöse oder azinöse Adenokarzinome. Atypische Tumore werden überwiegend von Lymphozyten und Plasmazellen umgeben, auch histologisch ist die klare Abgrenzung zum umliegenden Gewebe erkennbar. Klassische Tumore zeigen in ihrer Umgebung deutlich geringere reaktive Veränderungen. Meist liegen neutrophile Granulozyten in den Alveolen vor, was bei atypischer OPA nicht der Fall ist (GARCIA-GOTI et al.
2000; DE LAS HERAS et al. 2003).
JSRV positive Zellen sind in atypischen Fällen seltener nachweisbar als in klassischen Tumoren. Die Virenverbreitung scheint geringer, was zu dem Schluss führt, dass atypische OPA weniger kontagiös als klassische OPA ist. Möglicherweise ist aber die Immunabwehr bei atypischen Tumoren durch ihre Intensität in der Lage, das Tumorwachstum einzudämmen. Vermutlich handelt es sich um die unterschiedlichen Ausprägungsformen des selben Erregers, die dennoch in einer Lunge nebeneinander auftreten können (GARCIA-GOTI et al. 2000). Auch überwiegt die Anzahl an positiven PCR Replikationen bei der klassischen Form (50,3%) deutlich gegenüber der atypischen Form (25%) (GONZALEZ et al. 2001).
2.2. Typ II Pneumozyten
2.2.1. Funktion
Die Blut-Luftschranke wird aus dem Epithel der Typ I Pneumozyten, Kapillarendothel und der Basallamina gebildet. Phasenweise liegen dünne Bindegewebsschichten und auch Typ II Pneumozyten mit in diesem Bereich (BANKS 1986).
In den Typ II Pneumozyten werden Lamellenkörper produziert, welche alveolären Surfactant enthalten. Surfactant ist somit das Sekretionsprodukt von Typ II Pneumozyten (BANKS 1986; WELSCH u. DELLER 2010).
Typ II Pneumozyten bedecken ca. 10% der Alveolenoberfläche, während die Typ I Pneumozyten 90% einnehmen (WELSCH u. DELLER 2010). Es wird vermutet, dass Typ I Pneumozyten aus Typ II Pneumozyten hervorgehen (BANKS 1986). Kommt es zu Schädigungen des Alveolarepithels, kann eine Umwandlung von Typ II Pneumozyten und Differenzierung zu Typ I Pneumozyten stattfinden. Letztere sind ausdifferenziert nicht mehr teilungsfähig (WELSCH u. DELLER 2010).
2.2.2. Lebenszyklus
Typ II Pneumozyten erscheinen unter dem Lichtmikroskop als runde oder kubusförmige Zellen, welche nur vereinzelt in Alveolen auftreten (BANKS 1986). Sie gelten als Vorläufer- und Stammzellen in adulten Lungen. Kommt es zu selektiven Schädigungen der Typ II Pneumozyten, wie durch das Diphterietoxin A, vermehren sich die verbliebenen Typ II Pneumozyten. Diese Zellen vollziehen eine Langzeiterneuerung, welche über ein Jahr andauern kann. Ungeschädigte Zellen vermehren sich nur langsam. Die normale Differenzierung von Typ II- in Typ I Pneumozyten scheint langsamer zu erfolgen als dies nach einer Schädigung der Fall ist (BARKAUSKAS et al. 2013).
2.2.3. Zellbestandteile
Die Typ II Pneumozyten haben in ihrem Zytoplasma neben Zytokinfilamenten, dem rundlichen Zellkern und zahlreichen Mitochondrien auch ihre charakteristischen Lamellenkörper (WELSCH u. DELLER 2010). Der Golgiapparat ist weit ausdifferenziert, weitere Zellorganellen sind multivesikuläre Körper, das raue endoplasmatische Retikulum und Ribosomen (KAUP u. DROMMER 1985). Apikal tragen sie einen Mikrovillisaum (KAUP u. DROMMER 1985; BANKS 1986).
Lamellenkörper bilden intrazelluläre Speicher für Surfactant (OCHS 2006).
CHEVALIER u. COLLET (1972) gelingt es durch Einschleusung von radioaktivem
Wasserstoff in Lungenepithelzellen die Entstehung von Lamellenkörpern nachzuvollziehen. Die markierten Partikel wandern von dem rauen endo- plasmatischen Retikulum über den Golgiapparat zu den wachsenden Lamellen- körpern. Weitere Bestandteile könnten durch autophagieähnliche Abläufe in der Synthese von Lamellenkörper entstehen. Die Hypothese, dass auf diesem Weg Phospholipide übertragen werden, ist noch nicht bewiesen (WEAVER et al. 2002).
Multivesikuläre Körper fusionieren mit unreifen Lamellenkörpern und verrichten so eine Carrierfunktion zwischen Golgiapparat und Lamellenkörpern (CHEVALIER u.
COLLET 1972). Bestätigt wird dies, da multivesikuläre Körperchen bereits im Fetus mit Lamellenkörpern fusionieren, wenn die Reaktionskette für Surfactant–Recycling noch inaktiv ist (STAHLMAN et al. 2000). Es wird vermutet, dass die multivesikulären Körperchen eine zentrale Rolle in den intrazellulären Pfaden zur Aufrechterhaltung der Surfactant–Homöostase und auch in der Biogenese von Lamellenkörpern während der Lungenreifung spielen (STAHLMAN et al. 2000; WEAVER et al. 2002).
Composite bodies stellen das Fusionsprodukt aus multivesikulären Körpern und unreifen Lamellenkörpern dar (CHEVALIER u. COLLET 1972).
2.2.4. Rolle der Typ II Pneumozyten bei OPA
Die Typ II Pneumozyten stellen die Zielstruktur des JSRV dar, in welcher das Tumorwachstum beginnt (MURGIA et al. 2011). Die detaillierten Prozesse sind unter Kapitel 2.1.2.4. „Zielstrukturen des JSRV und Tumorentstehung“ beschrieben.
2.3. Surfactant
2.3.1. Funktion
Die größeren luftleitenden Wege haben knorpelige, hufeisenförmige Stützen, welche sie vor dem Kollabieren bewahren. Die kleineren Luftwege haben dies nicht (ENHORNING 2001). Surfactant bedeutet Surface active agent (HAMM et al. 1996).
Die wichtigste Eigenschaft von Surfactant ist, die Oberflächenspannung (OFS) schnell zu erniedrigen, in dem er zügig einen stabilen Film bildet, sobald die Oberfläche sich vergrößert (CLEMENTS 1997). Dieser Prozess ist beim ersten Atemzug eines Neugeborenen besonders relevant. Durch Surfactant ist die Ausdehnung der Lunge unmittelbar post partum relativ leicht. Bildet sich kein stabiler Oberflächenfilm, weil zu wenig Surfactant vorliegt oder dieser zu stark komprimiert ist, kommt es zum Kollabieren der Alveolen beim nächsten Atemzug. So entsteht das Atemnotsyndrom von Neugeborenen (BANKS 1986; CLEMENTS 1997; WELSCH u.
DELLER 2010).
Nachdem der Surfactant aus den Typ II Pneumozyten mittels Exozytose in das Alveolarlumen der Lunge ausgeschleust wurde, bildet er einen monomolekularen Film. Dieser kleidet die gesamte innere Oberfläche der Lunge bis zu den Bronchiolen aus und bildet den Oberflächenfilm (WELSCH u. DELLER 2010). Die Surfactant- produktion beim Menschen wird auf 0,1-0,5 ml/kg geschätzt (DIETL u. HALLER 2005). Surfactant ermöglicht, die OFS der Alveolen 5-10fach zu erniedrigen (LIEBICH 2004). Dadurch wird die Gefahr eines endexpiratorischen Kollapses der Lunge gesenkt und das erneute Ausdehnen der Alveolen während der Inspiration erleichtert (CLEMENTS 1997; WELSCH u. DELLER 2010).
Surfactant hält die Alveolen offen, sauber und trocken. Er verhindert, dass es aufgrund eines zu großen Druckgradienten durch eine zu hohe OFS zum Eintreten von Flüssigkeit aus den Gefäßen in das Alveolarlumen kommt (OCHS 2006).
2.3.2. Zusammensetzung
80-90% des Surfactants bestehen aus Phospholipiden, überwiegend Dipalmitoyl- Phosphatidylcholin und Cholesterin. Weitere ca. 10% bestehen aus Protein, bei dem die hydrophilen Glykoproteine (SP A und SP D) neben den hydrophoben Proteinen (SP B und SP C) die wichtigsten Anteile darstellen. Die SP B und C tragen zur Stabilisierung des Phospholipidfilms bei, während die SP A und D eine antimikrobielle Wirkung haben (WELSCH u. DELLER 2010). Vermutlich fördert Surfactant die Anheftung von Bakterien an Makrophagen und damit deren Phagozytose (MORGENROTH 1986).
Die Einteilung der Surfactantuntergruppen wird von verschiedenen Autoren mit verschiedenen Ansätzen dargestellt:
Anhand ihrer Dichte lassen sich aus zellfreier BALF drei Surfactantgruppen bilden:
„ultraheavy“ bestehend aus überwiegend tubulärem Myelin, „heavy“ bestehend aus überwiegend lamellenkörperähnlichen Strukturen und „light“, worin überwiegend unilamelläre Vesikel aufzufinden sind. Die Ergebnisse von einer anderen Studie untermauern den Verdacht, dass Surfactantgruppen aus der Fraktion „ultraheavy“
frischer Surfactant sind, der aus Lamellenkörpern ausgeschleust wurde. Zusätzlich ist erwiesen, dass aus der „ultraheavy“ Gruppe die beiden anderen Surfactantgruppen entstehen (GROSS u. NARINE 1989a).
Durch Zentrifugation bei 40 000 x g kann Surfactant in small aggregats (SA) und large aggregats (LA) ebenfalls anhand deren Dichte unterteilt werden. Diese Methode ist weniger zeitaufwändig als die Differenzierung nach dem Saccharosegradienten, wie durch GROSS u. NARINE (1989a) beschrieben, jedoch mit geringerer Trennschärfe. Die Dichte der LA ist höher als die der SA.
Morphologisch unterscheiden sich die beiden Gruppen dahingehend, dass in den SA überwiegend unilamelläre Vesikel auftreten und kein tubuläres Myelin vorliegt.
Letzteres ist ausschließlich bei den LA anzutreffen (VELDHUIZEN et al. 1993).
BALIS et al. (1991) unterscheiden detailliertere Surfactantgruppen in BALF. Diese sind lamellenkörperähnliche Strukturen, multilamelläre Vesikel, tubuläres Myelin und unilamelläre Vesikel.
Unilamelläre Vesikel bestehen aus nur einer einzelnen Lamelle in unterschiedlichen Größen (BALIS et al. 1991; SCHMIEDL et al. 2003). Im Gegensatz zu den anderen Gruppen, zeigt die der unilamellären Vesikeln wenig Oberflächenaktivität (GROSS u.
NARINE 1989a).
Lamelläre Vesikel enthalten 2–3 voneinander klar abgegrenzte Lamellen. Aufgrund ihres Aufbaus wird eine Übergangsform zwischen multilamellären und unilamellären Vesikeln vermutet, bisher wurden diese in anderen Säugetierarten noch nicht beschrieben1.
Multilamelläre Vesikel enthalten viele locker gewickelte Lamellen, die von einander separat vorliegen (BALIS et al. 1991; SCHMIEDL et al. 2003).
Lamellenkörperähnliche Strukturen von Surfactant ähneln den intrazellulären Lamellenkörpern, jedoch ohne begrenzende Membran. Die Lamellen sind nicht klar voneinander getrennt (BALIS et al. 1991; SCHMIEDL et al. 2003).
Multivesikuläre Vesikel bestehen aus einer äußeren Membran und beinhalten mehrere innere Vesikel (LAKRITZ et al. 1992).
Tubuläres Myelin ist ein röhrenstrukturartiger Lipoproteinkomplex, welcher eine Reservefunktion einnimmt. Es wird aus Lamellenkörpern unmittelbar nach deren Exozytose aus den Typ II Pneumozyten gebildet, bei Bedarf in den Surfactantfilm eingespeist oder entfernt (WELSCH u. DELLER 2010). Tubuläres Myelin weist eine typische Gitterstruktur auf (BALIS et al. 1991).
Die Lamellenkörper wickeln sich während der Exozytose langsam ab, um dann vorzugsweise das tubuläre Myelin zu bilden (BALIS et al. 1991).
Innerhalb der Alveolen liegt frischer, oberflächenaktiver Surfactant (überwiegend tubuläres Myelin) neben inaktivem Surfactant (überwiegend unilamelläre Vesikel) vor (OCHS 2006).
1 Laut persönlicher Mitteilung von Herrn Prof. Dr. Dr. Schmiedl, Hannover am 24. Mai 2012
2.3.3. Auf- und Abbau
Die lamellenkörperähnlichen Strukturen lassen sich in vitro in tubuläres Myelin konvertieren. Dazu ist eine physikalische Manipulation nötig, welche das Ausdehnen und Zusammenziehen von der Alveolenoberfläche nachahmt. Ohne diese Stimulation entstehen keine Veränderungen in der Surfactantzusammensetzung. Es gelingt nicht, mit dieser Methode auch unilamelläre Vesikel zu konvertieren (GROSS u. NARINE 1989b).
Der Abbau von Surfactant erfolgt zum Teil vermutlich durch Alveolarmakrophagen und Typ II Pneumozyten (POULAIN u. CLEMENTS 1995; WELSCH u. DELLER 2010). In ihrem Zytoplasma kann phagozytiertes Material in Myelinfiguren nachgewiesen werden, welches Lamellenkörpern und tubulärem Myelin ähnelt (KAUP u. DROMMER 1985). Die biologische Halbwertzeit von Surfactant beträgt 17- 20 Stunden (GROSS u. NARINE 1989b).
2.3.4. Rolle von Surfactant bei OPA
In dem für OPA typischen Lungenexsudat können mittels Immunoblotting hohe Mengen an SP A nachgewiesen werden (PLATT et al. 2002), wie es unter anderem in Surfactant auftritt (WELSCH u. DELLER 2010). Des Weiteren besteht diese Flüssigkeit aus Schleim und Lipiden (SUMMERS et al. 2005). SUMMERS et al.
(2005) halten das übermäßig auftretende Lungenexsudat und die vorliegenden Surfactantproteine für eine mögliche Ursache des unter 2.1.2.4. beschriebenen Scheiterns einer effektiven Immunantwort bei OPA.
Aus einer humanmedizinischen Studie geht hervor, dass Surfactant nicht in der Lage ist, das JSRV Onkogen env zu inaktivieren. Daher wird dieses Gen in Retrovirusvektoren eingesetzt, die zu therapeutischen Zwecken in der menschlichen Lunge bestehen bleiben müssen ohne abgebaut zu werden (COIL et al. 2001).
2.4. Selen
2.4.1. Funktion von Selen im Säugetierorganismus
Selen ist ein essentielles Spurenelement. Als funktionelle Komponente von Selenoproteinen und Enzymen dient es unter anderem dem Oxidationsschutz und hemmt eine vermehrte Radikalbildung. Als Bestandteil des Enzyms Glutathion–
Peroxidase (GPx) unterstützt es die Umwandlung von Hydroperoxiden in Hydroxyfettsäuren in Zellen, Plasma und dem Gastrointestinaltrakt (ROOKE et al.
2004; BICKHARDT 2009). Bislang werden bei Menschen fünf verschiedene selenhaltige GPx beschrieben, die GPx 1-4 und die GPx 6. Während die GPx 1 ubiquitär verbreitet ist und bei adäquater Selenversorgung in allen Zellen exprimiert wird (BRIGELIUS-FLOHE 1999), liegt die GPx 2 überwiegend im Gastro- intestinaltrakt vor. Die Plasma-GPx (GPx 3) wird in der Niere synthetisiert und ins Plasma sezerniert. Die GPx 4 ist die Einzige, die auch mit Lipidhydroperoxiden reagiert, sie wird auch Phospholipidhydroperoxid-GPx genannt (Übersicht bei BRIGELIUS-FLOHE 1999, BRIGELIUS-FLOHE u. KIPP 2009). Für die fünfte selenhaltige GPx, die GPx 6, wurden bislang keine kinetischen Analysen angefertigt (BRIGELIUS-FLOHÉ u. MAIORINO 2013).
Selen ist ein Bestandteil der Jodothyronin Deiodinase, welche als Selenoenzym relevant für den Metabolismus von Schilddrüsenhormonen ist und den Umbau von Thyroxin in Triiodthyronin katalysiert (BEHNE et al. 1990; ROOKE et al. 2004).
Selenoprotein P wird als das Haupttransportprotein von Selen im Serum angesehen.
8% der Gesamtmenge an Selen im Körper sind im Selenoprotein P enthalten (READ et al. 1990). Dieses Protein wird zu 90% in Hepatozyten gebildet. In einer Selenmangelsituation fällt die Konzentration an Selenoprotein P im Serum weniger stark ab als dies bei der GPx der Fall ist. Da Selenoprotein P Selen in andere Gewebe des Körpers transportiert, wird somit gewährleistet, dass dieser Mechanismus auch in Mangelsituationen aufrecht erhalten bleibt (HILL et al. 2012).
Letztlich ist Selen in der Thioredoxinreduktase auch in Wachstum, Regulation der Zellapoptose und Aufrechterhaltung des Redoxstatus einer Zelle involviert. In der Unterstützung des Immunsystems spielt Selen ebenfalls eine relevante Rolle, wie beispielsweise dem Oxidationsschutz (ROOKE et al. 2004).
PETERS et al. (2006) konnten nachweisen, dass höhere Serumselen- konzentrationen bei Menschen mit einem niedrigeren Risiko für Colorektaladenome einhergehen. Dass häufiger Raucher von diesem Adenom betroffen sind, wird im Zusammenhang mit dem oxidativen Stress durch Rauchen vermutet. Die Interaktionen mit Selen können in einem Zusammenhang mit der antioxidativen Wirkung der Selenoenzyme stehen (PETERS et al. 2006 ).
Hinsichtlich des Selenmetabolismus scheint es wenig Unterschiede zwischen Wiederkäuern und anderen Tierarten zu geben. Sowohl in der oralen als auch in der parenteralen Supplementation wird Selen bei Nutztieren häufig in Kombination mit Vitamin E verabreicht. Eine Supplementierung von Selen zusammen mit Vitamin E führt zu signifikanten Anstiegen der Selenkonzentration in Muskulatur und Leber.
Eine reine Gabe von Vitamin E hingegen führt zu sukzessivem Abfall der Selenkonzentrationen in den genannten Geweben (AMMERMAN u. MILLER 1975), was die weitgehende Unabhängigkeit der beiden Stoffwechselsysteme unterstreicht.
Vitamin E selbst stellt ein effektives Antioxidanz dar, welches in Membranen vorliegt und Lipide vor Peroxidation schützt (BUETTNER 1993; ROOKE et al. 2004). Pro 100-1000 Phospholipiden liegt ein Molekül Vitamin E vor. Nach wie vor ist unklar, ob bestimmte Phospholipide durch Vitamin E besser als andere vor Oxidation geschützt werden (ATKINSON et al. 2008). Phospholipide bilden den überwiegenden Bestandteil von Surfactant (WELSCH u. DELLER 2010).
2.4.2. Auswirkungen von Selenmangel bei Schafen
Ein Mangel an Selen kann bei Schafen eine nutritive Muskeldystrophie, Lebernekrosen, verminderte Erythrozytenstabilität, verminderte Fertilität und Störungen der Immunabwehr verursachen. Subklinische Mängel können nicht leicht
erkannt werden, führen jedoch zu Leistungseinbußen. Jungtiere sind davon in der Regel häufiger betroffen (AMMERMAN u. MILLER 1975; BICKHARDT 2009).
Bezüglich des Körpergewichts stellt sich bei adulten Schafen keine Veränderung durch marginale Selenversorgung ein. Die Serumselenkonzentration sinkt kontinuierlich bei einer über 2 Jahre andauernden marginalen Selenversorgung.
Bereits innerhalb von 10 Tagen kann bei Umstellung auf eine bedarfsgerechte Selenversorgung ein Anstieg der Plasmaselenkonzentration verzeichnet werden, welche dann bereits eine Plateauphase erreicht hat. Ähnlich verhalten sich die Selenkonzentrationen in der Leber. Diese sinken jedoch bei marginaler Selenversorgung nicht kontinuierlich ab, wie es in der Serumselenkonzentration der Fall ist. Die Ursache dafür wird darin vermutet, dass ein Anpassungsprozess an die marginale Versorgung stattfindet, damit in der Leber ausreichend Selen für die Selenoproteinsynthese bereitgestellt werden kann (HUMANN-ZIEHANK et al.
2013b).
2.4.3. Rolle von Selen bei der Tumorentstehung
Die Proliferation von bereits ausgeprägter OPA kann in ihrem weiteren Verlauf nicht durch eine experimentelle Modulation des Selenstatus (marginal gegenüber bedarfsgerecht mit Selen supplementierte Schafe) beeinflusst werden (HUMANN- ZIEHANK et al. 2013a). Anhand von chemisch induzierten Hepatokarzinomen bei Ratten kann gezeigt werden, dass tägliche hochdosierte Selenzuführung (4mg/kg in Trinkwasser) die Tumorentstehung deutlich senkt. Dies bezieht sich sowohl auf die Anzahl der Tumorlokalisationen als auch auf die Größe der einzelnen Tumorknoten (ALWAHAIBI et al. 2010). Vermutlich hängt die Wirkung von Selen auf die Tumorgenese von mehreren Faktoren ab. Dazu zählen die ursprüngliche Selenversorgung, die Art des Tumors und der Zeitpunkt, ab dem Selen in der Tumorentstehung zugeführt wurde (BRIGELIUS-FLOHE u. KIPP 2009). Auch beim Menschen können Zusammenhänge zwischen Selenversorgung und Tumorinzidenz gezeigt werden (BUKALIS et al. 2007). Die Aktivitäten von GPx 1 & GPx 4 in
humanen Lungenadenokarzinomzelllinien können durch Selensupplementierung im Nährboden je nach Zelllinie um das Vielfache gesteigert werden. Nur mit einer Selensupplementierung im Nährmedium können die Zelllinien eine maximale Expression und Aktivität der GPx aufweisen. Diese Enzyme fungieren als Antioxidantien und haben vermutlich eine wichtige Rolle bei der Regulation reaktiver Sauerstoffspezies bei Lungentumoren. Es wird mit Blick auf humane Lungenadenokarzinomzellinien postuliert, dass Selen eine Rolle für das Risiko von Lungentumoren spielt (ROMANOWSKA et al. 2007).
In der Initialphase einer Krebserkrankung wirken alle GPx durch die Entfernung von Hydroperoxiden antikanzerogen. Zu diesem Zeitpunkt liegen zu hohe Hydroperoxid- konzentrationen vor, welche zu Tumorentstehung durch Mutation oder aufgrund von Zellschädigungen führen können. Während der Promotionsphase eines Tumors können die veränderten Zellen noch durch Apoptose daran gehindert werden, in die Progressionsphase über zu gehen. Während dieser Übergangsphase ist die Rolle von den reaktiven Sauerstoffspezies unklar, da sie einerseits Apoptose fördern und andererseits für die Tumorproliferation benötigt werden. Einerseits fördert anschließend die GPx 2 die Proliferation, während andererseits die GPx 4 diese hemmt. Eine Tumormetastasierung kann wiederum durch alle GPx gehemmt werden (BRIGELIUS-FLOHE u. KIPP 2009).
Selen besitzt eine sehr enge therapeutische Breite, weswegen es auch als
„zweiseitiges Schwert“ bezeichnet wird (STEINBRENNER u. SIES 2009). Ein sicherer Nachweis hinsichtlich der Schutzfunktion von Selen in Bezug auf die Tumorentstehung existiert nicht. Daher befassen sich Meta-Analysen mit diesem Thema. Die Autoren kommen zu dem Fazit, dass es keine eindeutigen Beweise dafür gibt, dass Selensupplementierung die Entstehung von Krebs bei Menschen verhindern kann (DENNERT et al. 2011; VINCETI et al. 2014).
2.5. Verfahrenstechniken
2.5.1. Bronchoalveoläre Lavage
Die BAL ist eine Methode, um zelluläre und nicht-zelluläre Bestandteile der Lungenflüssigkeit des unteren Atemtrakts zu sammeln. Dazu werden physiologische Salzlösungen in die Lunge bronchial oder tracheal instilliert und durch Aspiration rückgewonnen (RENNARD et al. 1986; DAWSON et al. 2005).
Generell ist zwischen intravitaler und postmortaler BAL zu unterscheiden. Bei der intravitalen BAL werden nur kleine Areale lavagiert, da durch das verwendete Bronchoskop das Bronchiallumen abgedichtet wird, um einen optimalen Flüssigkeitsrückgewinn zu ermöglichen. Erst dann wird die ungepufferte, sterile, physiologische Kochsalzlösung appliziert (COSTABEL 1994). Eine intravitale BAL kann bei unsedierten Schafen unter Oberflächenanästhesie der Nasen- und Laryngealschleimhaut unter Sichtkontrolle mit einem flexiblen Endoskop durchgeführt werden. Dazu wird das Endoskop über den ventralen Nasengang eingeführt.
Anschließend erfolgt ein Vorschieben des Endoskops in die Bronchien bis das Instrument das Bronchiallumen abdichtet. In dieser Position finden Spülungen mit körperwarmer physiologischer Kochsalzlösung statt, welche im Anschluss wieder aspiriert wird (GANTER 1996). Des Weiteren ist es möglich, eine BAL bei Schafen nach Immobilisation durchzuführen. Dazu wird das Schaf in eine Brust-Bauchlage verbracht und der Kopf wird überstreckt. Ein Laryngoskop wird zur Darstellung des Kehlkopfes eingeführt, durch welches ein Tubus in die Trachea geschoben wird.
Durch diesen Tubus wird eine Ernährungssonde in die Bronchien vorgeschoben.
Dort findet die BAL ohne Sichtkontrolle durch Eingabe steriler 0,9% Kochsalzlösung und anschließender Rückgewinnung statt (VOIGT et al. 2007a).
Unter Anderem nach postmortaler BAL kann anhand der BALF eine Auswertung der Surfactant-Subtypen stattfinden (GROSS u. NARINE 1989a). Der Vorteil der postmortalen BAL ist, dass davon ausgegangen wird, dass alle Lungenareale gleichmäßig lavagiert werden können. Die Lunge wird dazu aus dem Brustkorb
entnommen und nach Instillation der Spülflüssigkeit geschwenkt (DAWSON et al.
2005).
WALTERS u. GARDINER (1991) unterstreichen die sinnvolle Nutzung von BAL als Werkzeug zur quantitativen Analyse von Lungenerkrankungen. Grundsätzlich wird davon ausgegangen, dass die eingegebene Flüssigkeit bei einer BAL ihren Zielort erreicht und somit auch die erkrankten Areale erreicht werden. Prozessbedingte Artefakte werden oftmals nicht berücksichtigt. Bei der intravitalen BAL konnte gezeigt werden, dass bei geringen Flüssigkeitsmengen (60ml) nur ein Teil der Flüssigkeit zurückgewonnen werden kann. Dieser Teil stammt aus den luftleitenden Wegen.
Nutzt man größere Flüssigkeitsmengen, werden auch periphere Bereiche mit in die Probenentnahme involviert (WALTERS u. GARDINER 1991). Bei diffusen Veränderungen ist die BAL repräsentativer als eine Biopsie, da sie mehr Fläche in der Lunge mit einbezieht (COSTABEL 1994).
Es wird beschrieben, dass die Ergebnisse aus verschiedenen BALF-Proben sowohl zwischen Versuchspersonen als auch innerhalb einer Versuchsperson stark schwanken. Daher sollten die BALF–Ergebnisse, insbesondere wenn sie abnorm sind, vorsichtig interpretiert werden (ETTENSOHN et al. 1988).
Ursprünglich findet die BAL lediglich bei interstitiellen Lungenerkrankungen Verwendung, aufgrund der einfachen Anwendungsweise erfolgt zunehmend der Einsatz bei Atemwegserkrankungen und Asthma (WALTERS u. GARDINER 1991).
Die Bestimmung der BALF-Zusammensetzung von gesunden Probanden ist eine Grundvoraussetzung, um Veränderungen während Lungenerkrankungen inter- pretieren zu können (RATJEN et al. 1994). Daher erscheint die Erarbeitung von Daten gesunder Tiere jeder Tierart für nötig, um Daten von Tieren mit einer Grund- erkrankung interpretieren zu können.
Die BALF eignet sich für die Messung von Immunmediatoren, Immunoglobulinen, Enzymen, Proteinen, Surfactantbestandteilen und der Zellzusammensetzung des Bronchoalveolarraums (WALTERS u. GARDINER 1991; RATJEN et al. 1994).
Die epitheliale Grenzflüssigkeit hat eine Dicke von ca. 1-10µm in den oberen Atemwege gegenüber 0,2-0,5µm in distalen bronchoalveolären Bereichen (KELLY u.
MUDWAY 2003). Nach der Rückgewinnung der eingegebenen Flüssigkeit liegen die
zu untersuchenden Bestandteile stark verdünnt vor. Surfactant bildet ca. 1% der bronchoskopisch rückgewonnenen BALF. Je nach Verweildauer der Spüllösung in der Lunge diffundieren weitere Moleküle in die BALF. Um dies zu vermeiden sollte diese Zeit so kurz wie möglich andauern (RENNARD et al. 1986; WALTERS u.
GARDINER 1991; KELLY u. MUDWAY 2003). Ein Nachteil der BALF besteht darin, dass diese nur intraalveolären Surfactant beinhaltet, dessen exakte Herkunft hinsichtlich der Lungenlokalisation unklar ist (OCHS 2010).
2.5.2. Pulsating Bubble Surfactometrie
Innerhalb der Lunge wirken verschiedene Kräfte, welche sich anhand des La Place´schen Gesetzes erklären und berechnen lassen, da die Lunge mit ihren luftleitenden Wegen und Alveolen mit Röhrchen und Blasen vergleichbar ist. Die OFS in einer Blase versucht diese zu komprimieren, während die Luft sie zu erweitern versucht. Sind zwei Blasen von ungleicher Größe durch ein Röhrchen verbunden, wird die kleinere sich immer in die Größere entleeren. Gleiches würde in der Lunge passieren, so dass letztlich nur eine große Blase übrig bliebe. Verhindert wird dies durch den Surfactant. Dieser bildet eine dünnere Schicht, wenn die Alveolen größer sind und eine dichtere Schicht, welche die OFS erniedrigt, wenn die Alveolen kleiner sind. Somit werden die Alveolen stabilisiert, so dass sie die gleiche Größe beibehalten können (BANKS 1986). Je kleiner eine Blase ist, desto größer ist ihre OFS. Die OFS ist die Tendenz einer flüssigen Oberfläche aufgrund der Anziehungskräfte von Molekülen an und in dieser Oberfläche zu kontrahieren (CLEMENTS 1997).
Das PBS ist ein Apparat, der den Druck an der Oberfläche einer Luftblase aufzeichnet, welche sich in einer Testflüssigkeit ausbreitet und mit Raumluft in Verbindung steht (ENHORNING 1977). Es simuliert den ersten Atemzug eines Neonaten, sowie die Atmungsdynamik (ENHORNING 2001). Mit ihm können innerhalb einer pulsierenden Blase die Druck–Volumen–Verhältnisse gemessen werden (MOTTAGHIAN 1999). Die Pulsationen entsprechen der Atemfrequenz. Der
Vorteil des PBS ist, dass die benötigten Probenmengen sehr gering sind und innerhalb von wenigen Minuten bereits Ergebnisse vorliegen können (ENHORNING 2001). Vor der Untersuchung mit dem PBS muss die zu beprobende BALF aufkonzentriert und durch Zentrifugation gereinigt werden. Anschließend erfolgt eine Resuspendierung mit Calciumchlorid und die Einstellung der Phospholipid- konzentration auf 3mg/ml (MOTTAGHIAN 1999).
Durch einen Differenzdruckaufnehmer wird der Druck gemessen, welcher notwendig ist, um eine Surfactantblase zu öffnen und zu schließen. Anhand dieser Werte kann mit Hilfe des Laplace`schen Gesetzes ( P=2 γ/R) die OFS (γ) ermittelt werden (ENHORNING 1977). R entspricht dem Radius der Gasblase. Die von der Wandspannung erzeugte und nach innen gerichtete Kraft ist genauso groß, wie die von der Flüssigkeit nach außen gerichtete Kraft. Somit kann die nach außen gerichtete Kraft mittels des Drucks P in der Flüssigkeit berechnet werden (GROS 2004; ENHORNING 2008).
2.5.3. Transmissionselektronenmikroskopie
In der Transmissionselektronenmikroskopie wird, ähnlich wie in der Lichtmikroskopie, ein dünnes Objekt durchstrahlt. Jedoch erfolgt die Durchstrahlung mit Elektronen, welche nach der Wechselwirkung mit dem Präparat ein Bild erzeugen. Dabei dient die Kathode als Elektronenquelle während durch die Anode ein Feld zur Beschleunigung der Elektronen erzeugt wird. Dieses Verfahren findet unter Hochvakuum statt. Von Nachteil ist, dass Lebewesen nicht direkt untersuchbar sind.
Die Konservierung kann zu Strukturveränderungen führen. Native Präparate sind aufgrund ihres hohen Wassergehaltes im Hochvakuum nicht zu untersuchen, zusätzlich eignen sich nur sehr dünn geschnittene Präparate zur Beurteilung unter einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM). Die Kontrastierung ist mit Wolframatophosphorsäure, Ammoniumheptamolybdat und Uranylverbindungen möglich. Das Auflösungsvermögen des TEM ist theoretisch 1000fach höher als das von Lichtmikroskopen (200nm gegenüber 0,1-0,2nm). Bei biologischen Objekten ist
die Auflösung aufgrund von Präparationseinschränkungen auf 2-3nm begrenzt.
Anhand der Elektronenmikroskopie gelang die Charakterisierung der Zellorganellen (LANGE u. BLÖDORN 1981).
Die morphologische Komplexität kann Surfactant nur auf elektronenmikroskopischem Niveau entfalten. Diese Darstellung ist nötig, um das Surfactantsystem in gesunden und erkrankten Zuständen charakterisieren zu können. Mit dem TEM können sowohl intraalveoläre als auch intrazelluläre Surfactant–Subtypen dargestellt werden. Der Vorteil gegenüber einer BALF liegt darin, dass intrazellulärer Surfactant in situ dargestellt werden kann (OCHS 2010). Die Anwendung des TEM zur Darstellung von intraalveolärem und intrazellulärem Surfactant ist bei Menschen, Ratten und Mäusen bereits stark verbreitet, was folgende Quellen belegen (CHEVALIER u. COLLET 1972; OCHS 2006; OCHS 2010; BEHRENS 2011). Für Nutztiere liegen nur vereinzelte Arbeiten vor. BUSLEY et al. (2016) charakterisieren das Surfactant- system von Schweinen, während das Surfactantsystem von Schafen weitgehend unerforscht ist.
2.5.4. Computertomographie
Die Computertomographie (CT) ist die Weiterentwicklung von Röntgenverfahren zu einem Schnittbildverfahren. Dazu werden die Produktionsrichtungen von Röntgenstrahlen variiert in dem sich die Röntgenröhren und Detektoren um das Untersuchungsobjekt drehen. Die erzielten Einzeldaten werden mittels mathematischer Berechnungen durch Computer ausgewertet (LINKE 2009).
Anhand von CT Aufnahmen lassen sich klinisch relevante anatomische Strukturen und pathomorphologische Veränderungen darstellen. Um die CT Bilder korrekt zu interpretieren, ist eine genaue Kenntnis der Anatomie im Querschnitt der untersuchten Regionen nötig (DE RYCKE et al. 2005; BRAUER 2012). So existiert für Hunde bereits ein Katalog mit CT Bildern von den Brustkörben gesunder Hunde, welchen tiefgefrorene Thoraxscheiben des entsprechenden Tieres gegenübergestellt werden. Lediglich Nerven und kleine Gefäße können nicht im CT dargestellt werden
