2 Literaturübersicht
3.6 Untersuchungen zum Nachweis des kaninen Staupevirus
Die Probenvorbereitung (Kapitel 3.6.1), die Nukleinsäureextraktion (Kapitel 3.6.2) sowie die PCR zum Nachweis des kaninen Staupevirus (Kapitel 3.6.3) inklusive der Agarosegel-Elektrophorese (Kapitel 3.6.3.1) wurden im Lebensmittel- und Veterinärinstitut Braunschweig/Hannover, Standort Hannover, des LAVES durchgeführt. Die Schritte der Teilsequenzierung (Kapitel 3.6.4) erfolgten in Kooperation mit dem Institut für Virologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und wurden in dessen Laborräumlichkeiten durchgeführt.
Die Untersuchungen von als verhaltensauffällig beschriebenen Waschbären auf ihre Krankheitsursache ergaben ein vermehrtes, zunächst auf den LK Hameln-Pyrmont
begrenztes Auftreten von CDV-positiven Tieren. Daraufhin erfolgte eine Untersuchung auf das kanine Staupevirus aller eingesandten Waschbären, auch retrospektiv, aus dem LK Hameln-Pyrmont sowie aus den umliegenden Landkreisen (Schaumburg, Region Hannover, Hildesheim, Holzminden) und aller im Frühjahr erlegten Tiere unabhängig des Landkreises.
3.6.1 Vorbereitung der Proben
Für die Nukleinsäureextraktion wurden 100 mg des entnommenen Organspektrums bestehend aus Lunge, Leber, Milz und Niere in ein steriles Reaktionsgefäß gefüllt.
3.6.2 Nukleinsäureextraktion
Die Extraktion der viralen RNA aus dem Probenmaterial sowie dem Organmaterial der Extraktionskontrollen wurde mit dem NucleoSpin® Virus-Kit angelehnt an das vom Hersteller empfohlene Protokoll durchgeführt. Als positive Extraktionskontrolle wurde erregerhaltiges und als negative Extraktionskontrolle Organmaterial frei von CDV verwendet.
Zu den Proben wurde eine Stahlkugel sowie 900 µl phosphatgepufferte Salzlösung (PBS-Puffer, phosphate buffered saline) gegeben. Eine mechanische Zerkleinerung des Gewebes erfolgte im TissueLyser bei 20 U/Sek für zwei Minuten. Die Organsuspension wurde für fünf Minuten bei 20.817 x g zentrifugiert und anschließend in den Extraktionsautomaten verbracht, wo alle folgenden Schritte durchgeführt wurden. Nachdem 600 µl Lysepuffer RAV 1 sowie 20 µl Proteinase K hinzugefügt wurden, folgte eine zwanzigminütige Inkubation. In dieser Phase lysierte das Guanidiniumthiocyanat des RAV 1-Puffers die Zellen und inaktivierte RNasen sowie weitere Enzyme. Die ebenfalls im Lysepuffer RAV 1 enthaltene Carrier-RNA verbesserte die spätere Bindung an die Silicamembran sowie die Rückgewinnung von niedrig konzentrierter viraler RNA. Proteinase K wirkte proteolytisch auf die Proteine im Zelllysat und setzte somit die Nukleinsäuren frei. Nach Beendigung der Inkubationszeit wurden 600 µl hochprozentiges (96-100%) Ethanol hinzupipettiert.
Zur Bindung der viralen Nukleinsäuren an eine Silicamembran wurde die Suspension bei einer Durchflussgeschwindigkeit von ein bis zwei Tropfen pro Sekunde und unter
Reduktion des atmosphärischen Drucks um 0,2 bar für fünf Minuten auf die Membran pipettiert. Potentielle PCR-Inhibitoren wurden in drei aufeinanderfolgenden Waschschritten entfernt. Im ersten wurde 500 µl des ethanolhaltigen RAW-Puffers, im zweiten sowie dritten Waschschritt 500 µl RAV 3-Puffer hinzugegeben und jeweils bei 0,8 bar für fünf Minuten durch eine Vakuumpumpe abgesaugt. Nach dem Hinzupipettieren von 700 µl 96-100%igem Ethanol wurde zur Trocknung der Silicamembran das maximal erreichbare Vakuum (0,4 bar) für zehn Minuten angelegt. Abschließend wurde die virale RNA mithilfe von 100 µl RE-Puffer (70°C) eluiert. Dazu wurde nach zweiminütiger Inkubationszeit eine Vakuumreduktion des atmosphärischen Drucks um 0,6 bar für zwei Minuten durchgeführt. Die gewonnenen Eluate wurden in den PCR (Kapitel 3.6.3 und 3.6.4.1) als Template eingesetzt.
3.6.3 Nachweis des kaninen Staupevirus mittels Polymerase-Kettenreaktion
Die Untersuchung auf CDV wurde mit dem OneStep RT (Reverse Transkriptase)-PCR Kit mit dem Zusatz von RNaseOUT™ nach einem auf Herstellerangaben basierendem Protokoll durchgeführt. Die hierbei eingesetzten Primersequenzen (FRISK et al. 1999) bildeten ein 287 bp großes Fragment (Tabelle 11).
Tabelle 11: Primersequenzen für die PCR zum Nachweis des kaninen Staupevirus nach FRISK et al. (1999)
Bei der RT-PCR erfolgte die reverse Transkription zur cDNA (complementary DNA, komplementäre DNA)-Synthese sowie die PCR-Amplifikation in einem Schritt. Der Enzym-Mix enthielt dementsprechend sowohl Reverse Transkriptase als auch DNA-Polymerase. Er wurde zusammen mit den anderen Reagenzien sowie den Primern entsprechend Tabelle 12 in ein Eppendorfgefäß™ pipettiert, kurz auf dem Vortex gemischt und zentrifugiert.
Primer Sequenz von 5' nach 3'
Primer 1 ACA GGA TTG CTG AGG ACC TAT Primer 2 CAA GAT AAC CAT GTA CGG TGC
Tabelle 12: Mastermix der PCR für den Nachweis des kaninen Staupevirus unter Berücksichtung der Herstellerangaben des OneStep RT-PCR Kits sowie für RNaseOUT™
Reagenz Konzentration/Probenansatz Menge (µl)/Probe
Puffer, 5x 1 x 5,0
Jeder Probenansatz bestand aus 22,5 µl Mastermix und 2,5 µl RNA-Template, institutsinterner Positiv- oder Negativkontrolle (Aqua dest.) bzw. positiver oder negativer Extraktionskontrolle und durchlief im auf 50°C vorgewärmten Thermocycler die in Tabelle 13 aufgeführten Amplifikationsbedingungen.
Tabelle 13: Amplifikationsbedingungen im Thermocycler für die PCR zum Nachweis des kaninen Staupevirus angelehnt an die Herstellerangaben des OneStep RT-PCR Kits
Im Anschluss wurde eine Agarosegel-Elektrophorese (Kapitel 3.6.3.1) durchgeführt.
3.6.3.1 Agarosegel-Elektrophorese
Die Visualisierung der Amplifikate erfolgte mittels Agarosegel-Elektrophorese, welche entsprechend Kapitel 3.5.4 durchgeführt wurde. Eine Fragmentlänge von 287 bp zeigte ein Vorhandensein CDV-spezifischer Nukleinsäurefrequenzen an (FRISK et al. 1999).
Funktion Temperatur (°C) Zeit (Min:Sek)
Vorwärmen 50 Kontinuierlich
Reverse Transkription 50 30:00
Aktivierung der Polymerase 95 15:00
Denaturierung 95 00:30
Annealing 48 00:30 40 Zyklen
Extension 72 01:00
Extension, final 72 10:00
Kühlen 10 kontinuierlich
3.6.4 Teilsequenzierung des kaninen Staupevirus
3.6.4.1 Polymerase-Kettenreaktion
Die Durchführung der PCR verlief nach einem institutsinternen Protokoll mit den Primersequenzen nach SEKULIN et al. (2011). Mittels des Primerpaares wurde der Abschnitt mit der SLAM-Rezeptorbindungsstelle des CDV H-Gens amplifiziert.
Zunächst wurde der Mastermix I nach den in Tabelle 14 beschriebenen Angaben in ein steriles Reaktionsgefäß pipettiert und kurz auf dem Vortex gemischt. Der 18 µl Probenansatz, bestehend aus 3 µl RNA-Template, institutsinterner positiver Kontrolle oder Negativkontrolle (Aqua dest.) und 15 µl Mastermix I, wurde für fünf Minuten in den Thermocycler bei 72°C verbracht.
Tabelle 14: Mastermix I zur Transkription von RNA zu cDNA des kaninen Staupevirus für die PCR zur Sequenzierung des Teilabschnitts des Hämagglutinin-Gens mit der SLAM-Rezeptorbindungsstelle nach einem Protokoll des Instituts für Virologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Reagenz Konzentration/Probenansatz Menge (µl)/Probe
Puffer, 5x 1 x 2,0
MgCl2 25 mmol 4,0
dNTP-Mix 20 mM 8,0
Hexamere 1:15 1,0
2 µl Mastermix II, hergestellt nach dem Pipettierschema in Tabelle 15, wurden dem Produkt des ersten Reaktionsansatzes hinzugefügt.
Tabelle 15: Mastermix II zur Transkription von RNA zu cDNA des kaninen Staupevirus für die PCR zur Sequenzierung des Teilabschnitts des Hämagglutinin-Gens mit der SLAM-Rezeptorbindungsstelle nach einem Protokoll des Instituts für Virologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Reagenz Konzentration/Probenansatz Menge (µl)/Probe
DTT 0,1 M 0,5
RNase Inhibitor 0,5
M-MLV Reverse Trans. 1,0
Nachdem das Gemisch kurz gevortext wurde, fand die reverse Transkription im Thermocycler statt. Die Temperaturbedingungen waren dort wie folgt: Fünf Minuten
bei 22°C, 15 Minuten bei 37°C, 30 Minuten bei 42°C, fünf Minuten bei 99°C gefolgt von einem kontinuierlichen Abkühlen auf 4°C. Die gewonnene cDNA wurde in dem sich anschließenden Schritt als Template eingesetzt.
Zur Amplifikation des H-Gen-Abschnitts mit der SLAM-Rezeptorbindungsstelle wurden die Primersequenzen (Tabelle 16) nach SEKULIN et al. (2011) verwendet.
Die Primer wurden bei einer Konzentration von 20 pmol/Probenansatz als Paar, ein Vorwärts- (F) mit einem Rückwärtsprimer (R), genutzt.
Tabelle 16: Primersequenzen für die Sequenzierung der SLAM-Rezeptorbindungsstelle des Hämagglutinin-Gens des kaninen Staupevirus nach SEKULIN et al. (2011)
Nachdem 45 µl nach Herstellerangaben zubereiteter Thermo-Start Mastermix mit je 1 µl Vorwärts- und Rückwärtsprimer in ein Eppendorfgefaß™ pipettiert und kurz gevortext wurden, konnte der Mastermix mit 3 µl cDNA auf ein Gesamtvolumen von 50 µl aufgefüllt werden. Das Amplifikationsprofil entsprach den unter Tabelle 17 aufgeführten Angaben.
Tabelle 17: Amplifikationsbedingungen im Thermocycler zur Generierung von Teilsequenzen des Hämagglutinin-Gens des kaninen Staupevirus nach einem Protokoll des Instituts für Virologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Die Amplifikate wurden mittels Agarosegel-Elektrophorese (Kapitel 3.6.4.2) nachgewiesen.
Primer Sequenz von 5' nach 3'
Primer 1 (1629F) GGA GAC CAG TTC ACT GTA AT Primer 2 (1728R) GTG ACA CCA CAA ATC GTC AT
Temperatur (°C) Zeit (Min:Sek)
Aktivierung der Polymerase 95 10:00
Denaturierung 94 01:00
Annealing 50 02:00 39 Zyklen
Extension 72 01:00
Extension, final 72 05:00
Kühlen 4 kontinuierlich
3.6.4.2 Agarosegel-Elektrophorese
Die Agarosegel-Elektrophorese wurde im Institut für Virologie durchgeführt.
3.6.4.3 DNA-Aufreinigung
Die PCR-Amplifikate wurden mit dem GeneJET™ PCR Purification Kit nach Angaben des Herstellers im Institut für Virologie aufgereinigt.
3.6.4.4 Sequenzierung
Die externe Sequenzierung wurde durch Eurofins MWG Operon Ebersberg durchgeführt. Die Auswertung der Sequenzen erfolgte im Institut für Virologie.