Untersuchung des mesodermalen Enhancers msd auf Erfüllung der Kriterien eines

Die weitergehende Charakterisierung des isolierten Enhancers msd erfolgte mit Hilfe von Reportergenkonstrukten in Verbindung mit einem heterologen Promotor.

Es sollte untersucht werden, ob dieser Enhancer die Kriterien eines „klassischen Enhancer“ erfüllt. Die dazu erstellten Reportergenkonstrukte pmsd/hsp/lacZpA und pmsd2/hsp/lacZpA setzten sich aus dem 1,5 kb großen genomischer Bereich des Enhancerelements msd in beiden Orientierungsmöglichkeiten zu einem heterologen Promotor (hsp70), einem Reportergen und einem

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Polyadenylierungssignal (SV40pA) zusammen. Als Reportergen wurde das bakterielle LacZ-Gen, welches in Escherichia coli für die β-Galaktosidase kodiert, verwendet. Die auf diesem Weg erstellten Reportergenkonstrukte wurden zur Herstellung der transgenen Mausembryonen von Frau Dr. Karin Schuster-Gossler in die Pronuklei von Mauszygoten injiziert, welche anschließend in die Infundibula scheinträchtiger Mäuse transferiert wurden. Durch histochemische Färbung wurde die Proteinaktivität der β-Galaktosidase in transgenen Embryonen (E9.5) nachgewiesen. Anhand dieses Nachweises war es möglich, eine Aussage darüber zu machen, ob das untersuchte Element in der Lage ist, in Verbindung mit einem heterologen Promotor und unabhängig von der Orientierung eine Genexpression spezifisch in paraxialen Mesoderm zu steuern.

Durch die β-Galaktosidasefärbung konnte bei einigen Embryonen histochemisch nachgewiesen werden, daß das Transgen in das Genom integriert worden ist.

Diese Embryonen wiesen eine Blaufärbung im Bereich des paraxialen Mesoderms auf. Neben dem präsomitischen Mesoderm zeigte sich diese Färbung auch in den ersten 6 bis 8 Somiten (Abbildung 8), in anteriorer Richtung abnehmend. Durch die Herstellung der Reportergenkonstrukte sollte eine durch das Enhancerelement herbeigeführte gewebe- oder entwicklungsspezifische Transkription nachgewiesen werden. Durch die β-Galaktosidasefärbung wurde lediglich die Proteinaktivität des Reportergenproduktes und nicht die Transkriptionsaktivität des Reportergens nachgewiesen. Das Genprodukt des verwendeten Reportergens, die β-Galaktosidase, ist ein Protein mit einer relativ langen Halbwertszeit, daher ist es schwierig, die transkriptionelle Aktivierung des LacZ-Gens festzustellen. Da die Färbeintensität in den Somiten von posterior nach anterior hin abnimmt, lässt sich vermuten, dass in den Somiten mit schwacher Expressionsintensität zwar keine Transkription des Reportergens mehr erfolgt, das Reportergenprodukt aber noch stabil und lediglich noch nicht abgebaut worden ist. Das würde bedeuten, dass msd die Expression des Reportergens in präsomitischen Mesoderm reguliert und die Enhancerfunktion im Verlauf der Segmentierung des PSM nachläßt. Eine weitere Abklärung des Sachverhaltes ist unter dieser Fragestellung nicht von Bedeutung, aber sie könnte durch einen mRNA-Nachweis des Reportergens anhand einer in situ-Hybridisierung der Embryonen erfolgen.

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Bei der DNA-Mikroinjektion in Zygoten findet die Integration der injizierten DNA durch nicht-homologe Rekombination ("random") statt. Dabei ist es möglich, dass der Ort der Integration die Expression beeinflußt, so dass die Expression des Transgens unter der Kontrolle anderer regulatorischer Elemente erfolgen kann.

Diese positionellen Effekte werden in der Methode des "Gene and enhancer trapping" gezielt verwendet, um beispielsweise neue Gene zu identifizieren (Hill and Wurst, 1993; Skarnes, 1993). Diejenigen Mausembryonen, bei denen keine Reportergenexpression nachweisbar ist, könnten daher das Transgen zwar tragen, aber der Einfluß eines Silencers könnte dessen Expression verhindern.

Bei einigen Mausembryonen sind in dem histochemischen Nachweis vereinzelte Zellen des Nervengewebes oder des Darms angefärbt worden. Dieses Färbungsmuster scheint nicht regelmässig vor zu kommen und kann dadurch bedingt sein, dass das Transgen so in die DNA eingebaut worden ist, dass es positionsbedingt mit einem Enhancer interagiert und somit eine ektopische Expression des Reportergens erfolgt. Die Abklärung, ob es sich hier um positionelle Effekte handelt, könnte über die Herstellung von transgenen Mauslinien statt der in diesem Fall verwendeten transient transgenen Mausembryonen erfolgen. Die Analyse der transgenen Mausembryonen dieser Linien würde einen genauen Rückschluß auf die Regelmässigkeit des Auftretens der Färbung ergeben.

Das Färbemuster der hier dargestellten Embryonen stimmt weitgehend mit der Färbung der transgenen Embryonen vorangegangener Untersuchungen überein, welche das Promotorelement in Verbindung mit dem autologen Promotor von Dll1, dem LacZ-Gen und dem Polyadenylierungssignal in ihr Genom integriert haben (Beckers et al., 2000). Dabei war das Reportergenprodukt ebenfalls in den gesamten Somiten nachweisbar. Da die Expression von Dll1 in den Somiten auf die posterioren Somitenhälften und auf die Myotome der sich differenzierenden Somiten beschränkt ist (Bettenhausen et al., 1995), scheint es ein weiteres regulatorisches Element außerhalb von msd zu geben, das die Expression in den anterioren Somitenhälften verhindert. Das in diesen vorausgegangenen Experimenten als spezifisch dargestellte Expressionsmuster des Reportergens unter Kontrolle des mesodermalen Enhancers msd in Verbindung mit dem autologen Promotor konnte durch den Austausch des autologen Promotors gegen

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einen heterologen Promotor in voller Ausprägung reproduziert werden. Die Orientierung des mesodermalen Enhancers hat dabei keine Auswirkung auf die Expression des Reportergens.

Zusammengefasst bedeutet dies, dass msd die Reportergenexpression in Verbindung mit einem heterologen Promotor und unabhängig von der Orientierung spezifisch im Bereich des präsomitischen Mesoderms und in den sich daran anschließenden Somiten steuert, womit die Bedingungen eines

„klassischen Enhancers“ für den mesodermalen Enhancer msd erfüllt sind.

4.2 Eingrenzung der regulatorischen Sequenz von msd

Zur weiteren Eingrenzung der regulatorischen Sequenz von msd wurden die Reportergenkontrukte pmsdA/hsp/lacZpA, pmsdB/hsp/lacZpA, pmsdC/hsp/lacZpA, pmsdE/hsp/lacZpA und pmsdF/hsp/lacZpA (siehe Abbildung 10) hergestellt, die Subfragmente des mesodermalen Enhancers msd von Dll1 in Verbindung mit einem heterologen Promotor, einem Reportergen und einem Polyadenylierungssignal enthielten. Diese Konstrukte wurden zur Herstellung der transgenen Mausembryonen von Frau Dr. Karin Schuster-Gossler in die Pronuklei von Mauszygoten injiziert, welche anschließend in die Infundibula scheinträchtiger Mäuse transferiert wurden. Durch histochemische Färbung wurde die Proteinaktivität der β-Galaktosidase in transgenen Embryonen (E9.5) nachgewiesen. Durch diesen Nachweis war es möglich, eine Aussage darüber zu machen, ob einzelne Subfragmente von msd in der Lage sind, in Verbindung mit einem heterologen Promotor und unabhängig von der Orientierung eine Genexpression spezifisch in paraxialen Mesoderm zu steuern.

Es wurde erwartet, dass durch die β-Galaktosidase-Färbung die Reportergenexpression eines oder mehrerer Reportergenkonstrukte im präsomitischen Mesoderm und der Somiten nachgewiesen werden könnte. Dieses Expressionsmuster konnte lediglich mit dem Konstrukt pmsdB/hsp/lacZpA, welches das Subfragment „B“ (850 bp) des mesodermalen Enhancers msd enthält, in der vollen Ausprägung gezeigt werden (siehe 3.2.2 und Abbildung 11).

Gleichzeitig konnte das Expressionsmuster nicht mit DNA-Bereichen aus (sich um 100 bp überschneidenden) Untereinheiten 5’- und der 3’-Region dieses

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Fragmentes „B“ reproduziert werden. Daraus folgt, dass die Subfragmente „A“,

„C“, „E“ und „F“ allein nicht fähig sind, die Expression des Reportergens im paraxialen Mesoderm zu steuern. Das kann bedeuten, dass es einen oder mehrere entsprechende Transkriptionsfaktoren gibt, die mehr als eine Bindungsstelle auf der DNA des Promotorbereichs zur Aktivierung der Expression von Delta1 benötigen und der Enhancer damit als mehrteilig anzusehen wäre.

Diese Möglichkeit wurde mehrfach in der Literatur beschrieben, beispielsweise muss der Transkriptionsfaktor Oct-1 an zwei DNA-Bindungsstellen, die Oktamersequenz und die POU-Region, binden, um die vollständige DNA-Bindungsaktivität für die Lymphoid-spezifische Expression der Zielgene (Immunglobulin-Gene) zu erreichen (Verrijzer et al., 1990).

Durch den randomisierten Einbau des Transgens in das Mausgenom kann eine Inaktivierung des Enhancers durch einen Silencer („enhancer blocking“) oder durch Positionseffekte in dem Chromosom („chromosomal position effects“) erfolgen. Die DNA ist als Chromatin in den Zellkernen gepackt und muss im Bereich der Gene zur Transkription durch die RNA-Polymerase II entpackt werden. Wenn der entsprechende Enhancer in einen transkriptionell inaktiven Bereich in das Genom der Embryonen integriert wird, ist es möglich, dass die Entpackung der DNA aufgrund der Struktur und damit auch eine DNA-Protein-Interaktion unterbunden wird. Es gibt sogenannte Insulatoren, die durch Integration in ein Reportergen das „enhancer blocking“ und die „chromosomal position effects“ verhindern können (Felsenfeld et al., 1996; Gerasimova and Corces, 1996). Allerdings muß beachtet werden, dass Insulatoren selbst auch Genenxpressionen beeinflussen können (Zhan et al., 2001).

Auch in diesen Fällen zeigt eine Anfärbung vereinzelter Zellen des Nervengewebes oder des Darms vermutlich eine ektopische Genexpression an.

Sie kommt nicht regelmäßig vor und kann ebenfalls durch Positionseffekte bedingt sein (siehe 4.1).

Das Ergebnis dieser transgenen Analyse ist, dass der „klassische Enhancer“ msd auf einen Bereich von 850 bp (Subfragment „B“) eingegrenzt werden konnte. Zwei sich um 100 bp überschneidende Untereinheiten dieser Region haben unabhängig voneinander jeweils keine regulatorische Funktion.

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