3 Ergebnisse
3.2 Eingrenzung der regulatorischen Sequenz von msd
Das msd-Element wurde zur weiteren Eingrenzung der regulatorischen Sequenz in fünf sich überlappende Untereinheiten aus ca. 750 bp (Subfragment A, pmsdAhsp/lacZpA), 850 bp (Subfragment B, pmsdBhsp/lacZpA), 600 bp (Subfragment C, pmsdChsp/lacZpA), 350 bp (Subfragment E, pmsdEhsp/lacZpA) und 280 bp (Subfragment F, pmsdFhsp/lacZpA) unterteilt. Das Schema der Lage der Subfragmente relativ zum msd-Element ist in Abbildung 9 dargestellt.
Abbildung 9: Das msd-Element wurde in fünf sich überlappende Fragmente A, B, C, E und F unterteilt. Sie stellten die Basis für die Erstellung von Reportergenkonstrukten zur Eingrenzung des regulatorischen Bereichs von msd dar.
3.2.1 Herstellung der Reportergenkonstrukte
Die weitere Eingrenzung der regulatorischen Sequenz von msd sollte durch transgene Analysen nach dem gleichen Verfahren, welches unter 3.1 beschrieben wurde, erfolgen. Die unter Punkt 3.1.1 beschriebenen Plasmide pLitMsd und pmsd/hsp/lacZpA wurden für die Klonierung der Reportergenkonstrukte verwendet (siehe Punkt 2.2).
Zum Erstellen des Reportergens pmsdA/hsp/lacZpA wurde das als „B“
Kap. 3 Ergebnisse
Plasmid pLitMsd2 mit der Restriktionsendonuklease NcoI herausgeschnitten, so dass der Vektor nur noch mit dem 750 bp großen Subfragment „A“ verbunden war. Das Plasmid wurde religiert und anschließend mit der Endonuklease PstI geöffnet. Die überhängenden Enden wurden dephosphoryliert. Das Plasmid phsp70/LacZ/pA wurde mit der Endonuklease PstI inkubiert und das etwa 4,3 kb große Insert, bestehend aus den Sequenzen für den heterologen Promotor hsp70, für das Reportergen LacZ und für das Polyadenylierungssignal SV40pA, herausgeschnitten. Das mit PstI geöffnete Plasmid pLitMsd2 wurde als Vektor mit dem PstI-Fragment des Plasmids phsp70/LacZ/pA als Insert ligiert. Aus den beiden resultierenden Plasmidvariationen wurde diejenige ausgewählt, in der das msd-Subfragment „A“ in 5’-Orientierung des heterologen Promotors plaziert war und als Plasmid pmsdA/hsp/lacZpA bezeichnet.
Das Reportergenkonstrukt pmsdB/hsp/lacZpA wurde auf ähnliche Weise wie das Plasmid pmsdA/hsp/lacZpA kloniert, das Insert wurde auf die selbe Art und Weise vorbereitet. Als Vektor wurde das Plasmid pLitMsd zugrundegelegt, aus dem mit der Endonuklease PstI das msd-Subfragment „A“ herausgeschnitten wurde, so dass der Vektor nur noch mit dem 850 bp umfassenden msd-Subfragment „B“
verbunden war. Das Plasmid wurde religiert, mit dem Enzym PstI geöffnet und die freien Enden wurden dephosphoryliert. Der Vektor wurde mit dem oben erwähnten aus Plasmid phsp70/LacZ/pA stammenden etwa 4,3 kb große PstI-Fragment (hsp70-LacZ-pA) fusioniert. Aus den beiden resultierenden Plasmidvariationen wurde diejenige ausgewählt, in der das msd-Subfragment „B“
in 5’-Orientierung des heterologen Promotors platziert war und als Plasmid pmsdB/hsp/lacZpA bezeichnet.
Für das Reportergenkonstrukt pmsdC/hsp/lacZpA wurde mit den Endonukleasen SacI und AvaI aus dem Plasmid pLitMsd ein etwa 600 bp umfassendes Fragment herausgeschnitten. Die überhängenden Enden dieses als Subfragment „C“
betitelten DNA-Elements wurden aufgefüllt und als Insert mit dem Vektor Litmus28 (geöffnet mit der Endonuklease SmaI und anschließend dephosphoryliert) ligiert. Dieses Plasmid wurde mit der Endonuklease PstI geöffnet, dephosphoryliert und mit dem 4,3 kb großen Fragment aus Plasmid phsp70/LacZ/pA nach enzymatischer Spaltung mit PstI als Insert ligiert. Aus den beiden resultierenden Plasmidvariationen wurde diejenige ausgewählt, in der das
Kap. 3 Ergebnisse
msd-Subfragment „C“ in 5’-Orientierung des heterologen Promotors in relativer originaler Orientierung zum Promotor plaziert war. Es wurde als Plasmid pmsdC/hsp/lacZpA bezeichnet.
Zwei weitere msd-Subfragmente, „E“ und „F“, wurden per PCR amplifiziert (siehe 2.3). Die Primerpaare zur Amplifizierung waren Emsd1-f/Dmsd1-r für das Subfragment E und Emsd1-f/Fmsd1-r für das Subfragment F (siehe 2.3). Für das Subfragment „E“ resultierte ein etwa 350 bp, für Subfragment „F“ ein etwa 280 bp umfassendes Element. Die Genauigkeit der Amplifizierung wurde durch Pwo DNA Polymerase, die eine 3'-5' Exonuklease-Korrekturleseaktivität besitzt, gewährleistet. Diese DNA-Fragmente wurden in den Vektor pGEM-T subkloniert und durch enzymatische Spaltung mit der Endonuklease EcoRI zusammen mit einem Teil der Mehrfach-Klonierungsstelle herausgeschnitten. Parallel dazu wurde ein Vektor zum weiteren Klonieren vorbereitet. Das aus dem Plasmid phsp70/LacZ/pA stammende etwa 4,3 kb große PstI-Fragment (hsp70-LacZ-pA) wurde mit dem ebenfalls mit PstI geöffnteten Vektor Litmus28 fusioniert und anschließend mit dem Enzym EcoRI inkubiert. Anschließend wurden die Elemente
„E“ und „F“ in diesen Vektor subkloniert. Die Plasmide erhielten die Bezeichnung pmsdE/hsp/lacZpA und pmsdF/hsp/lacZpA.
Die Sequenz der oben beschriebenen Plasmide wurden durch verschiedene enzymatische sequenzspezifische Spaltungen und durch Sequenzierung (Firma MWG Biotech) kontrolliert.
3.2.2 Herstellung und Analyse der transgenen Mausembryonen
Zur Analyse der heterologen Genexpression und ihrer Gewebespezifität unter Kontrolle des msd-Elements in Verbindung mit dem heterologen Promotor wurden mit den erstellten Reportergenkonstrukten (siehe 3.2.1) durch DNA-Mikroinjektion transgene Mausembryonen hergestellt. Die Präparation der Zygoten, die DNA-Mikroinjektion sowie der Transfer der Zygoten (siehe 2.4.2) wurden von Dr. Karin Schuster-Gossler durchgeführt. Die Reportergen-Konstrukte wurden mit den Restriktionsendonukleasen SpeI und XbaI aus den entsprechenden Klonierungsvektoren pmsdA/hsp/lacZpA, pmsdB/hsp/lacZpA, pmsdC/hsp/lacZpA, pmsdE/hsp/lacZpA und pmsdF/hsp/lacZpA isoliert (siehe 2.2.6.1 und Abbildung
Kap. 3 Ergebnisse
nach einer Konzentrationsbestimmung (siehe 2.2.4) wurden die zwischen 4,6 kb
und 5,1 kb großen Enhancer-Promotor-Reportergen-Fragmente zur Herstellung
Abbildung 10: Die Reportergenkonstrukte pmsdA/hsp/lacZpA, pmsdB/hsp/lacZpA, pmsdC/hsp/lacZpA, pmsdE/hsp/lacZpA und pmsdF/hsp/lacZpA enthalten die entsprechenden Subfragmente „A“ (750 bp), „B“ (850 bp), „C“ (600 bp), „E“ (350 bp) und „F“ (280 bp) des msd-Elements in Verbindung mit dem heterologen Promotor, dem Reportergen und dem Polyadenylierungssignal.
transgener Embryonen durch Mikroinjektion verwendet. Die erste DNA-Mikroinjektion erfolgte mit dem Konstrukt pmsdA/hsp/lacZpA. Vorbereitend wurde aus diesem Reportergenkonstrukt mit Hilfe der Restriktionsenzyme SpeI und XbaI das etwa 4,8 kb große Reportergen-Fragment herausgeschnitten und gelelektrophoretisch aufgereinigt (siehe 2.2.6.2). Diese DNA wurde in 100 Zygoten des Stammes FVB injiziert. Als Rezipienten standen fünf scheinschwangere Weibchen zur Verfügung. Die 20 Embryonen, die diese Manipulation überlebt
Kap. 3 Ergebnisse
haben, wurden am Tag 9.5 nach der Befruchtung den Ammentieren entnommen.
Es folgten analog zu dem Konstrukt pmsdA/hsp/lacZpA die DNA-Mikroinjektionen mit den zwischen ca. 4,6 und 5,1 kb großen SpeI-XbaI-Fragmenten der Konstrukte pmsdB/hsp/lacZpA, pmsdC/hsp/lacZpA, pmsdE/hsp/lacZpA und pmsdF/hsp/lacZpA in jeweils 100 Zygoten des Stammes FVB. Als Rezipienten standen jeweils fünf scheinschwangere Weibchen zur Verfügung. Es überlebten jeweils 20 Embryonen die Mikroinjektion der Konstrukte pmsdA/hsp/lacZpA und pmsdB/hsp/lacZpA, 23 Embryonen die Mikroinjektion des Konstrukts pmsdC/hsp/lacZpA, 14 Embryonen Mikroinjektion des Konstrukts pmsdE/hsp/lacZpA und 18 Embryonen Mikroinjektion des Konstrukts pmsdF/hsp/lacZpA. Die Kontrolle der Integration des jeweiligen Transgens in das Genom der Mausembryonen erfolgte durch den histochemischen Nachweis der Reportergenexpression anhand der Aktivität des vom Reportergen exprimierten Proteins Galaktosidase (siehe 2.4.4.2). In den Fällen, in denen diese β-Galaktosidase-Färbung keine Blaufärbung des paraxialen Mesoderms ergab, wurde der Nachweis des Transgens durch PCR (siehe 2.3) auf der Grundlage der Dottersack-DNA der Mausembryonen durchgeführt.
Die typischen Ergebnisse der β-Galaktosidase-Färbung der Subfragmente A, B und C sind in der Abbildung 11 dargestellt. Die blaue Färbung trat bereits nach etwa 30 min. Inkubation in einzelnen Zellen auf und verstärkte sich im Lauf der folgenden Stunden. In den Fotografien wurde der Zustand nach 12 Stunden Färbezeit festgehalten. Das Konstrukt pmsdA/hsp/lacZpA führte in keinem der fünf durch PCR ermittelten transgenen Embryonen zu einer Anfärbung das paraxialen Mesoderms. Ein Embryo wies eine schwache Färbung im Darmbereich auf. Die Integration des Konstrukts pmsdB/hsp/lacZpA hingegen zeigte eine blaue Färbung des präsomitischen Mesoderms und der zuletzt gebildeten 6-8 Somitenpaare in fünf von sechs transgen-positiven Embryonen. Drei der fünf für das Konstrukt pmsdC/hsp/lacZpA transgen-positiven Embryonen wiesen eine schwache Färbung in vereinzelten Zellen der kaudalen Körperregion auf, das oben erwähnte Muster der Färbung wurde jedoch nicht in vollem Umfang erreicht (siehe Abbildung 11). Das Konstrukt pmsdE/hsp/lacZpA konnte in fünf Embryonen per PCR nachgewiesen werden, einer dieser Embryonen wies eine schwache Blaufärbung im Kopfbereich (Rautenhirn) auf. Das Konstrukt pmsdF/hsp/lacZpA
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war durch PCR in sechs Embryonen nachweisbar, aber keiner dieser Embryonen zeigte eine blaue Färbung.
Abbildung 11: Der mesodermale Enhancer msd wurde in die Subfragmente A, B, C, E und F unterteilt, welche in transgenen Analysen in Verbindung mit einem heterologen Promotor und einem Reportergen untersucht wurden. Darstellung der typischen Ergebnisse der transgenen Analysen von Embryonen E9.5, die für msd bzw. dessen Subfragmente A, B und C transgen-positiv waren. Die blaue Färbung zeigt die Reportergenexpression. Diese erfolgte unter Kontrolle des mesodermalen Enhancers msd in originaler und inverser Orientierung sowie unter Kontrolle des Subfragments B spezifisch im paraxialen Mesoderm (schwarze Balken). Mit den Subfragmenten A und C sowie E und F konnte keine gewebespezifische Färbung gezeigt werden (leere Balken).
Kap. 3 Ergebnisse
Diese Ergebnisse der Herstellung der transgenen Mäuse lagen in der Bandbreite von 10-40% transgener Embryonen (E9.5), die bei einer erfolgreichen Mikroinjektion zu erwarten sind (Gordon and Ruddle, 1981).
Abbildung 12: Tabellarische Darstellung der Ergebnisse der transgenen Analysen der msd-Fragmente. Obwohl für jedes msd-Fragment transgene Mausembryonen nachweisbar waren, konnte nur das B-Fragment eine reproduzierbare Reportergenexpression im PSM bewirken.