Untersuchung des mesodermalen Enhancer msd auf Erfüllung der Kriterien eines

Die Erfüllung der Kriterien eines klassischen Enhancers sind dann erfüllt, wenn das regulatorische Element die Expression des Gens oder eines Reportergens in Verbindung mit einem heterologen Promotor steuern kann. Dementsprechend wurde msd in originaler und inverser Orientierung in Verbindung mit einem heterologen Promotor und einem Reportergen in Hinblick auf die Reportergenexpression in für dieses Reportergenkonstrukt transient transgenen Mausembryonen 9.5 Tage nach der Befruchtung (E9.5) untersucht.

3.1.1 Herstellung der Reportergenkonstrukte

Es wurden zunächst Genkonstrukte kloniert (siehe 2.2), die aus dem msd-Element, einem heterologen Promotor sowie einem Reportergen bestanden. Als heterologer Promotor wurde der Promotorbereich des murinen Heat-Shock-Proteins 70 (hsp70) verwendet, als Reportergen das bakterielle (E. coli) LacZ-Gen und als Polyadenylierungssignal das virale (Simian Virus) SV40pA. Der heterologe Promotor, das Reportergen und das Polyadenylierungssignal standen bereits im Plasmid phsp70/LacZ/pA zur Verfügung. Die genomische DNA des msd-Elements lag im Plasmid pDll1prom3,6kb, welches in vorangegangenen Experimenten als Basis des msd-Elements für die Klonierung eines Reportergenkonstrukts zur

Kap. 3 Ergebnisse

Analyse der Promotorregion von msd gedient hat (Beckers, 2000), vor. Das msd-Element wurde in seiner Gesamtgröße von 1,5 kb in zum Promotor originaler (pmsd/hsp/LacZpA) und inverser (pmsd2/hsp/LacZpA) Orientierung stromaufwärts des Promotors kloniert (siehe 2.2 und Abbildung 7). Dazu wurde aus dem Plasmid pDll1prom3,6kb mit Hilfe der Endonuklease FokI ein 1,5 kb großes Fragment herausgeschnitten, welches der genomischen Sequenz des msd-Elements der Maus entspricht. Die überhängenden Enden wurden zu glatten Enden aufgefüllt.

Parallel dazu wurde der Klonierungsvektor Litmus28 mit der Endonuklease EcoRV geöffnet und die bereits glatten Enden wurden dephosphoryliert. Anschließend wurde das msd-Element mit dem Vektor ligiert und in von Frau Marianne Petry hergestellte elektrokompetente Bakterien (E. coli, XL1-blue) transformiert. Die entstandenen Plasmide wurden extrahiert und durch verschiedene enzymatische Spaltungen auf Integration der murinen DNA untersucht. Das Plasmid pLitMsd enthielt das msd-Fragment in originaler Orientierung zum heterologen Promotor, im Plasmid pLitMsd2 war es in der entgegengesetzten Orientierung integriert.

Diese beiden Plasmide wurden jeweils mit der Endonuklease PstI geöffnet und die freien Enden dephosphoryliert. Das Plasmid phsp70/LacZ/pA wurde mit der Endonuklease PstI sequenzspezifisch gespalten. Das so entstandene etwa 4,3 kb große DNA Fragment, bestehend aus den Sequenzen für den heterologen Promotor hsp70, für das Reportergen LacZ und für das Polyadenylierungssignal SV40pA, wurde gelelektrophoretisch aufgereinigt und anschließend in das mit PstI geöffnete Plasmid pLitMsd bzw. pLitMsd2 subkloniert. Dadurch entstanden vier Plasmidvariationen, von denen das Plasmid pmsd/hsp/lacZpA das Enhancerelement in originaler Orientierung, das Plasmid pmsd2/hsp/lacZpA in inverser Orientierung zum heterologen Promotor in Verbindung mit dem Reportergen und dem Polyadenylierungssignal trug (siehe Abbildung 7). Die Kontrolle der DNA erfolgte mit verschiedenen Endonukleasen sowie durch Sequenzierung (MWG Biotech).

Kap. 3 Ergebnisse

Abbildung 7: Die Reportergenkonstrukte pmsd/hsp/lacZpA und pmsd2/hsp/lacZpA enthalten das msd-Element in originaler bzw. inverser Orientierung zum Promotorbereich des murinen Heat Shock Proteins 70 (hsp70) als heterologen Promotor in Verbindung mit dem bakteriellen LacZ-Gen als Reportergen. Das Transkriptionsende ist durch das Polyadenylierungssignal des viralen SV40pA festgelegt.

3.1.2 Herstellung und Analyse der transgenen Mausembryonen

Zur Analyse der heterologen Genexpression und ihrer Gewebespezifität unter Kontrolle des msd-Elements in Verbindung mit dem heterologen Promotor wurden mit dem Reportergenkonstrukt durch DNA-Mikroinjektion transgene Mausembryonen hergestellt. Die Präparation der Zygoten, die DNA-Mikroinjektion sowie der Transfer der Zygoten (siehe 2.4.2) wurden von Frau Dr. Karin Schuster-Gossler durchgeführt. Die erste DNA-Mikroinjektion erfolgte mit dem Konstrukt pmsd/hsp/lacZpA, welches das ca. 1,5 kb lange msd-Element in relativer originaler Orientierung enthielt (vgl. Abbildung 7).

Vorbereitend wurde mit Hilfe der Restriktionsendonukleasen SpeI und XbaI ein etwa 5,8 kb großes Fragment aus dem Reportergenkonstrukt herausgeschnitten

Kap. 3 Ergebnisse

und gelelektrophoretisch aufgereinigt (siehe 2.2.6.2). Dieses Fragment bestand aus dem msd-Element in originaler Orientierung zum heterologen Promotor, dem Reportergen und dem Polyadenylierungssignal. Diese DNA wurde in 200 Zygoten des Stammes FVB injiziert. Als Rezipienten standen zehn scheinschwangere Weibchen zur Verfügung. Die 64 Embryonen, die diese Manipulation überlebt haben, wurden am Tag 9.5 nach der Befruchtung den Ammentieren entnommen.

Die Kontrolle der Integration des Transgens in das Genom der Mausembryonen erfolgte durch den histochemischen Nachweis der Aktivität des vom Reportergen exprimierten Proteins β-Galaktosidase.

Wie in Abbildung 8 zu erkennen, wurde nach der β-Galaktosidasefärbung bei einigen dieser Embryonen eine blaue Färbung ausschließlich im Bereich des präsomitischen Mesoderms sowie im Bereich der Somiten deutlich. Die Färbung trat bereits nach etwa 30 min. Inkubation in einzelnen Zellen auf und verstärkte sich im Lauf der folgenden Stunden. In den Fotografien wurde der Zustand nach 12 Stunden Färbezeit festgehalten. Dieses durch die Färbung visualisierte Expressionsmuster des Reportergens konnte bei 15 von 64 präparierten Embryonen gezeigt werden. Anhand der β-Galaktosidase-Färbung konnte demnach bei 23% der Embryonen eine stabile Transgenintegration nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse lagen in der Bandbreite einer erfolgreichen Mikroinjektion, in der 10 bis 40% der Embryonen (d 9.5 p.c.) als transgen-positiv zu erwarten sind (Gordon and Ruddle, 1981).

Anschließend wurde nach dem oben dargestellten Verfahren eine weitere DNA-Mikroinjektion mit dem Konstrukt pmsd2/hsp/lacZpA durchgeführt. Mit Hilfe der Restriktionsenzyme SpeI und XbaI wurde ein etwa 5,8 kb großes Fragment aus dem Reportergenkonstrukt herausgeschnitten und gelelektrophoretisch aufgereinigt. Dieses enthielt das ca. 1,5 kb lange msd-Element in relativer inverser Orientierung in Verbindung mit dem heterologen Promotor, dem Reportergen und dem Adenylierungssignal (vgl. Abbildung 7). Die DNA wurde in 100 Zygoten des Stammes FVB injiziert. Als Rezipienten standen fünf scheinschwangere Weibchen zur Verfügung. Am Tag 9.5 nach der Befruchtung wurden den Ammentieren 8 Embryonen entnommen. Die Kontrolle der Integration des Transgens in das Genom der Mausembryonen erfolgte wie oben beschrieben durch den

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histochemischen Nachweis der Aktivität des vom Reportergen exprimierten Proteins β-Galaktosidase (siehe 2.4.4.2).

In Abbildung 8 sind die typischen Ergebnisse der β-Galaktosidasefärbung der transgenen Embryonen dargestellt. Bei diesen Embryonen trat eine blaue Färbung ausschließlich im Bereich des präsomitischen Mesoderms sowie im Bereich der Somiten auf. Es ist jedoch zu erkennen, dass diese Anfärbung der Somiten in anteriorer Richtung abnimmt. Die Färbung entstand in einzelnen Zellen bereits nach etwa 30 min. Inkubation und verstärkte sich im Lauf der folgenden Stunden. In den Fotografien wurde der Zustand nach 12 Stunden Färbezeit festgehalten. Dieses Muster der Expression des Reportergens konnte bei 3 von 8 Embryonen gezeigt werden.

Abbildung 8: Transgene Analyse des Enhancerelements msd in Verbindung mit einem heterologen Promotor und einem Reportergen. Das Linke Bild zeigt einen Mausembryo E9.5, der das Allel Dll1msd/hsp/LacZpA

trägt, das rechten Bild ist ein Dll1msd/hsp/LacZpA

-positiver

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Embryo der gleichen Entwicklungsstufe. Die Blaufärbung spiegelt die Expression des Reportergens wider.