Allgemeine Klonierungstechniken

2.2.1 Herstellung elektrokompetenter Bakterien

Zur Herstellung kompetenter Bakterienzellen dienten die Stämme Escherichia coli RR1M15 (LacZM15) und E. coli JM109 (recA1, LacZM15). Eine 5 ml umfassende Vorkultur wurde über Nacht unter Schütteln bei 37°C inkubiert und dann als Inocculum für 500 ml LB-Medium verwendet. Die Bakterien dieser Kultur wurden unter Schütteln bei 37°C bis zu einer OD_600nm von 0,7-0,9 kultiviert und anschließend nach 30 min. Inkubation auf Eis sedimentiert (10 min., 5000xg, 4°C). Das entstandene Bakterien-Pellet wurde zweimal in 400 ml eiskaltem Reinstwasser resuspendiert und erneut wie oben beschrieben zentrifugiert. Die Bakterien wurden nach der Zentrifugation in 400 ml bzw. in 200 ml der 10%

Glyzerinlösung aufgenommen. Im Anschluss an die letzte Zentrifugation (wie

Kap. 2 Material und Methoden

bereits oben beschrieben) wurden die Bakterien-Pellets in 50 µl Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.

2.2.2 Transformation von Plasmiden in Escherichia coli

Zur Transformation wurden die bei -80°C gelagerten kompetenten Bakterien zügig aufgetaut und zusammen mit der Plasmid-DNA (20-100 ng) in einer Gene Pulser Küvette (Fa. Bio-Rad) im Bio-Rad Micro Pulser elektroporiert. Nach der Zugabe von 0,5 ml LB-Medium wurden die Zellen für 15 min. bei 37°C inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Bakterienzellen auf ampizillinhaltigen Selektivnährböden [1,5% (w/v) Bacto-Agar (Fa. Applichem) in LB-Medium, 50 µg/ml Ampizillin, 80 µg/ml X-Gal (Fa. Applichem), 0,2 mM IPTG (Fa. Applichem)]

ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Zugabe von X-Gal und IPTG zu den Selektivnährböden ermöglichte bei Plasmiden, die einen Teil des LacZ-Gens tragen, eine erste Differenzierung zwischen den gewachsenen Bakterienkolonien. Die herangewachsenen Bakterienkolonien transformierter Zellklone wurde für das Animpfen von Flüssigkulturen verwendet.

2.2.3 Präparation von Plasmid-DNA

Die Isolation von Plasmiden im kleinen Maßstab diente vor allem zur Kontrolle der erfolgreichen Insertion der DNA-Fragmente in den verwendeten Vektor (analytische Plasmidisolation), gleichzeitig diente diese analytische Präparation als Inocculum zur Isolierung von größeren Plasmid-Mengen (präparative Plasmidisolation). Die verwendeten Methoden stellen Modifikationen der alkalischen Lyse-Methode von Birnboim, H. C. und Doly, J. (Birnboim HC, 1979) dar.

2.2.3.1 Plasmidisolation ("Miniprep")

Resuspensionspuffer 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 10mM EDTA

100 µg RnaseA/ml

Lysierungspuffer 0,2 M NaOH 1% (w/v) SDS

Neutralisierungspuffer 3 M Kaliumacetat, pH 5,5

Kap. 2 Material und Methoden

Jeweils 2 ml Selektionsmedium (LB-Medium mit 50 µg/ml Ampizillin) wurden mit Teilen einer Bakterienkolonie angeimpft und für minimal fünf Stunden maximal über Nacht unter Schütteln bei 37°C inkubiert. 1,5 ml dieser Kulturen wurden abgenommen, sedimentiert (1 min., 13000xg). Das Bakterienpellet wurde in 200 µl kaltem Resuspensionspuffer vollständig resuspendiert. Durch Zugabe von 200 µl Lysierungspuffer wurden die Zellwände aufgebrochen und die zuvor trübe Lösung erschien nach 2-5 min. bei Raumtemperatur klar. Zur Abtrennung der Plasmide von der chromosomalen DNA und den Proteinen wurde die Lösung durch Zugabe von 200 µl kaltem Neutralisierungspuffer neutralisiert. Nach 5-minütiger Inkubation auf Eis wurden die voluminösen Niederschläge pelletiert (10 min., 13000xg) und die klaren plasmidhaltigen Überstände in neue Gefäße überführt. Zur Präzipitation der Nukleinsäuren wurden 450 µl Isopropanol zugegeben und erneut wie zuvor zentrifugiert. Das Nukleinsäure-Pellet wurde mit 500 µl 70% Äthanol gewaschen, erneut zentrifugiert (2 min., 13000xg), der Überstand vollständig abgesaugt und das kurz an der Luft getrocknete Pellet in 50 µl TE aufgenommen. Die Ausbeute an Plasmid-DNA betrug je nach Kulturdauer etwa 1-10 µg.

Alternativ zu diesem Protokoll wurde für die Präparation von Plasmiden zur Sequenzierung sowie zur DNA-Mikroinjektion das System NucleoSpin Plasmid (Fa. Macherey-Nagel) nach Angaben des Herstellers verwendet. Auch bei diesem Verfahren wurden 1-10 µg DNA gewonnen.

2.2.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

Die Messungen wurden in einem Spektralphotometer (Eppendorff) mit verdünnten Nukleinsäurelösungen [1:100 (v/v)] in Quarzglasküvetten durchgeführt.

2.2.5 Enzymatische Modifizierung von DNA

Die Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen, Dephosphorylierung mit alkalischer Phosphatase und Ligationen wurden mit Enzymen der Firmen Boehringer Mannheim und New England Biolabs nach Herstellerangaben durchgeführt.

Kap. 2 Material und Methoden

2.2.6 Klonierungstechniken

2.2.6.1 Sequenzspezifische Spaltung von DNA

Die sequenzspezifische Spaltung doppelsträngiger DNA erfolgte mit Hilfe verschiedener Restriktionsendonukleasen. Für die Spaltung von DNA-Mengen von 1 bis 5 µg wurde eine Enzymaktivität von 5-10 U im 20-µl-Reaktionsansatz eingesetzt und eine Stunde bei entsprechender Temperatur inkubiert.

Handelte es sich um eine analytische Spaltung, wurde ein Aliquot des Reaktionsansatzes gelelektrophoretisch aufgetrennt. Bei einer präparativen Spaltung der DNA wurden die Restriktionsenzyme zunächst inaktiviert (10 min., 65°C) und die Spaltungsprodukte anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt.

2.2.6.2 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten

Die Auftrennung von DNA-Fragmenten für analytische oder präparative Zwecke erfolgte durch Agarosegelelektrophorese (Sambrook et al., 1989). Als Gel- sowie als Laufpuffer diente das TAE-Puffersystem. In Abhängigkeit von der Länge der aufzutrennenden DNA-Fragmente wurden Agarosegele mit einem Anteil von 0,8 - 2 % (w/v) Agarose verwendet. Der aufgekochten Agaroselösung (Fa. Gibco) wurden 0,4 µg/ml Ethidiumbromid zugegeben. Zur Beladung des Agarosegels wurden die Proben mit Auftragspuffer (50% Glyzerin, 1x TAE, 0.2% Orange G) im Verhältnis 1:5 vermischt.

Als DNA-Längenstandards wurden verwendet :

1kb-DNA-Leiter : 12216; 11198; 10180; 9162; 8144; 7126; 6108; 5090; 4072;

3054; 2036; 1636; 1018; 506,517; 396; 344; 298; 220; 201;

154; 134; 75 bp (Fa. Invitrogen)

λ-Hind III-EcoRI: 21226; 5148; 4973; 3530; 2027; 1904; 1584; 1375; 947; 831;

564 bp (eigene Herstellung)

Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei Raumtemperatur und einer konstant gehaltenen Spannung von 5 Volt/cm bei Raumtemperatur. Im Anschluss an die Auftrennung der DNA-Fragmente wurden diese auf einem UV-Tisch (254 nm) im Durchlicht fotografiert.

Kap. 2 Material und Methoden

2.2.6.3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Die Bereiche des Agarosegels, die zu isolierende Fragmente enthielten, wurden mit einer Skalpellklinge über dem Blaulicht-Tisch mit Hilfe einer roten Brille möglichst exakt ausgeschnitten. Zur Isolierung von DNA-Fragmenten bis 6 kb wurde der Qiaquick-Kit (Fa. Qiagen) oder das System NucleoSpin Extract (Fa.

Macherey-Nagel) nach Angaben des Herstellers verwendet. Die Fragmente wurden in TE oder H2O aufgenommen, ein Aliquot des Eluats wurde durch Agarose-Gelelektrophorese überprüft.

2.2.6.4 Umwandlung von überhängenden Enden in glatte Enden

Für einige Klonierungsansätze war es notwendig, die durch einen Restriktionsansatz erzeugten überhängenden kohäsiven Enden der DNA-Fragmente oder Vektoren in glatte Enden umzuwandeln.

Nach der Inkubation eines Restriktionsansatzes (20 µl Gesamtvolumen) wurden 1µl dNTP-Mix (0,5 mM) und 1 µl Klenow-Fragment (5 U, Boehringer Mannheim) zugegeben und für 20 min. bei 37°C inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurde das Enzym inaktiviert (10 min., 75°C) und die DNA durch Äthanol-Fällung aufgereinigt.

2.2.6.5 Aufreinigung von DNA durch Äthanol-Fällung

Zu der Plasmidlösung wurden 1 Volumen ddH2O, 0,1 Volumen 3M Natriumacetat (pH 5,2) und 3 Volumen Äthanol zugegeben, gut durchmischt und 30 min. bei -80°C inkubiert. Anschließend wurde die DNA durch Zentrifugation (10 min., 13000xg) pelletiert. Abschließend wurde mit 250 µl kaltem Äthanol (70%) gewaschen, kurz zentrifugiert, der Überstand vollständig abgesaugt und das an der Luft getrocknete Zentrifugat in TE oder Wasser aufgenommen.

2.2.6.6 Dephosphorylierung von DNA

Die Klonierungsvektoren wurden nach vorangegangener sequenzspezifischer Spaltung und eventuell auch nach der Umwandlung der kohäsiven Enden in glatte Enden, dephosphoryliert. Den Herstellerangaben entsprechend wurde der Vektorlösung der Reaktionspuffer und eine Enzymaktivität von 1 U "Shrimp

Kap. 2 Material und Methoden

alkaline Phosphatase" (Fa. Roche) zugesetzt und für 30 min. auf 37°C erwärmt.

Anschließend wurde das Enzym Hitze (10 min., 75°C) inaktiviert und die DNA durch Äthanolfällung aufgereinigt.

2.2.6.7 Ligation von DNA-Fragmenten

Die Klonierungen erfolgten in Vektoren basierend auf den Plasmiden Litmus28 und pBluescript. Üblicherweise wurden die Vektor- und Insert-DNA in einem molaren Verhältnis von 1:3 eingesetzt und mit 5 U T4-Ligase (Boehringer Mannheim) und dem entsprechenden Reaktionspuffer inkubiert (12-16 Stunden, 16°C). Die neu verbundene DNA wurde nach Hitzeinaktivierung des Enzyms (10 min., 75°C) durch Äthanolfällung gefällt und anschließend durch Elektroporation in Escherichia coli transformiert.

2.2.6.8 DNA-Sequenzierung

Die klonierten Plasmide wurden zur Kontrolle sequenziert (Firma MWG Biotech).

Die so erhaltene DNA-Sequenz wurde mit Hilfe des Computerprogramms

"MacVector^TM6.5.3" auf Korrektheit überprüft.