Proteinbindung an msd

Die drei größten Subfragmente 1“ (287 bp), 2“ (316 bp) und „msd1-3“ (281 bp) des msd-Fragments „B“ wurden mit Hilfe der „Elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Analyse“ (siehe 2.5.1) auf Protein-DNA-Interaktionen mit Proteinextrakten der Kopf- und Rumpfregion von Mausembryonen E8.5, E10.5 (Ganz-Zell-Extrakte) und E11.5 (Kernextrakte, Herstellung siehe 2.5.1.2.2.1 und 2.5.1.2.2.2) unter definierten Bedingungen untersucht. Die Bindungsreaktionen wurden nach der Inkubation bei Raumtemperatur (ca. 20°C) bzw. 37°C und einer gelelektrophoretischen Auftrennung, bei der als Laufpuffer 0,5xTBE und 1xTris-G eingesetzt wurden, untersucht. In einem Teil der Experimente war 1 µg Heringssperma-DNA im Reaktionsansatz enthalten. Für jedes der drei radioaktiv markierten Fragmente zeigten sich in der gelelektrophoretischen Auftrennung der Reaktionsansätze (siehe 2.5.1.3.2) gut reproduzierbare Bandenmuster. Diese spiegeln die Protein-Interaktionen wider, die radioaktiv markierte DNA-Fragmente nach der Inkubation mit dem jeweiligen Proteinextrakt gebildet haben.

Die Bandenmuster wurden miteinander verglichen, um Banden zu finden, die sich ausschließlich mit dem Proteinextrakt der Kopf- oder mit dem der Rumpfregion darstellen liessen. Die Ergebnisse wurden in der Abbildung 16 tabellarisch zusammengefasst, Abbildung 15 zeigt ein typisches EMSA-Ergebnis.

Kap. 3 Ergebnisse

Abbildung 15: Typisches EMSA-Ergebnis mit den msd-Fragmenten

1“, 2“ und „msd1-3“ nach Inkubation mit Kernextrakten E 11.5 (hergestellt nach Protokoll A, siehe 2.5.1.2.2.1) bei 20°C. Für jedes Fragment lassen sich sowohl mit den Extrakten der Kopf- als auch der Rumfregion der Embryonen DNA-Protein-Interaktionen in Form von Banden nachweisen.

Kap. 3 Ergebnisse

Abbildung 16: Tabellarische Darstellung der Ergebnisse der Untersuchungen von DNA- Protein-Interaktionen zwischen den Fragmenten „msd1-1“, „msd1-2“ und „msd1-3“ und den Proteinextrakten aus dem Kopf- und Rumpfbereich von Mausembryonen E8.5, E10.5 und E11.5. Verwendung verschiedener Laufpuffersysteme. ZE = Zellextrakt, KE = Kernextrakt (mit Hinweis auf die Herstellung), 37°C = Inkubation bei 37°C, + ss = Zugabe von Heringssperma-DNA (salmon sperm DNA), O = klare zusätzliche Bande, / = keine zusätzliche Bande, ? = sehr schwache zusätzliche Bande.

In verschiedenen, voneinander unabhängigen Experimenten konnte für jedes der drei Subfragmente „msd1-1“, „msd1-2“ und „msd1-3“ des „B“-Fragments des mesodermalen Enhancers msd eine, teilweise nur undeutliche Bande dargestellt werden, die sich nur nach der Inkubation mit den Proteinen der Rumpf-, nicht aber mit denen der Kopfregion darstellen ließ. Diese Banden waren jedoch nicht gut reproduzierbar und boten damit lediglich einen Hinweis auf mögliche Protein-DNA-Interaktionen.

Die Experimente erfolgten unter definiert variierten Bedingungen. Es wurden verschiedene Laufpuffer verwendet, durch die sich die Bandenmuster leicht verschoben haben. Weiterhin wurden zwei verschiedenen Methoden der Extraktion der Kernproteine angewendet, deren Proteine die gleichen Bandenmuster zeigten. Die Veränderung der Inkubationstemperatur ließ zwar einige Banden schwächer oder stärker erscheinen als mit der jeweils anderen Temperatur, doch das Bandenmuster blieb gleich. Die Zugabe von Heringssperma-DNA ergab, dass alle Banden schwächer erschienen. Da diese

Fragment 0,5xTBE 1xTris-G Kopf Rumpf Kopf Rumpf Kopf Rumpf Kopf Rumpf

msd1-1 x / ? / / / / / /

Puffer ZE E8,5 ZE E10,5 KE E11,5 (B)

Kap. 3 Ergebnisse

Variationen keine deutlichen Veränderungen der Ergebnisse hervorgebracht haben, wurde in den folgenden Experimenten nach einem standardisierten Schema verfahren.

Durch weitere Unterteilung der Subfragmente „msd1-1“, „msd1-2“ und „msd1-3“

in zwei bzw. drei Bereiche entstanden acht Subfragmente von jeweils 100-171 bp, (siehe

Abbildung 14). Mit diesen Fragmenten wurde die „Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Analyse“ unter definierten Bedingungen (mit TBE-, TAE- und Tris-G-Puffer, siehe 2.5.1) durchgeführt. Wie in allen folgenden Experimenten wurden die Kernextrakte nach Protokoll A hergestellt, die Inkubationen erfolgten bei Raumtemperatur (20°C) und ohne Zugabe von Heringssperma-DNA. Auch hier zeigten sich in den Ergebnissen der Experimente für das jeweilige Fragment spezifische Bandenmuster, welche die radioaktiv markierten DNA-Fragmente nach der Inkubation mit dem Proteinextrakt der Kopf- und Rumpfregion gebildet haben und die miteinander verglichen wurden. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Abbildung 17 tabellarisch zusammengefasst.

Kap. 3 Ergebnisse

Abbildung 17: Tabellarische Darstellung der Ergebnisse der Protein-DNA-Interaktionen zwischen den Fragmenten „msd1-O7“, „msd1-P7“, „msd1-Q6“, „msd1-R5“, „msd1-N“,

„msd1-I“, „msd1-K“ und „msd1-L“ und den Proteinextrakten aus dem Kopf-, und Rumpf- bzw. Schwanzbereich von Mausembryonen der Stadien E9.5, E10.5 und E11.5 unter Verwendung der Laufpuffersysteme 0,5xTAE, 0,5xTBE und 1xTris-G. Schw. = Proteine des Schwanzbereichs, ZE = Zellextrakt, KE = Kernextrakt, O = klare zusätzliche Bande, / = keine Extrakt-spezifische Bande, ? = sehr schwache zusätzliche Bande.

Fragment 0,5xTAE 0,5xTBE 1xTris-G Kopf Rumpf Kopf Rumpf Kopf Schwanz Kopf Rumpf

msd1-O7 x / /

Puffer ZE E9,5 ZE E10,5 ZE E11,5

Kap. 3 Ergebnisse

Abbildung 18: Darstellung deutlicher Extrakt-spezifischer Banden im EMSA-Ergebnis anhand der Inkubation der msd-Subfragmente „msd1-P7“ mit Proteinen der Kopf- und Rumpfregionen von Embryonen E10.5 und „msd1-L“ mit Proteinen der Kopf- und Rumpfregionen von Embryonen E9.5. Die Extrakt-spezifischen Banden sind mit Pfeilen markiert.

P7 Kopf Rumpf Kopf Rumpf

L

Kap. 3 Ergebnisse

Auch mit den Subfragmenten der zuvor untersuchten DNA-Bereiche konnten teilweise undeutliche zusätzliche Banden gezeigt werden, die auf Interaktionen hinwiesen, die nur mit den Proteinextrakten der Rumpfregion, jedoch nicht mit denen der Kopfregion erzeugt werden konnten. In jeweils zwei voneinander unabhängigen Experimenten konnte mit den beiden Fragmenten „msd1-P7“ und

„msd1-L“ jeweils eine deutliche zusätzliche Bande im EMSA gezeigt werden (siehe Abbildung 18). Die Banden konnten allerdings in verschiedenen weiteren Wiederholungen nicht oder nicht klar reproduziert werden und stellten damit ebenfalls nur einen Hinweis auf mögliche spezifische Interaktionen dar.

Die „Elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Analysen“ wurden mit 33 Subfragmenten

„msd1-B1“ bis „msd1-B33“ (fortlaufende Nummerierung) des msd-Fragments „B“, jeweils 50 bp groß, wiederholt. Die Subfragmente überschnitten sich jeweils um 25 bp und deckten somit die ganze Region lückenlos ab. Als Laufpuffer wurde Tris-G-Puffer und als Protein wurden Ganz-Zell-Extrakte von Mausembryonen der Stadien E8.5, E9.5, E10.5 und E11.5 eingesetzt. Nach der Bindungsreaktion entstanden für jedes Fragment gut wiederholbare Bandenmuster, die miteinander verglichen wurden. Die Unterschiede wurden in Abbildung 19 tabellarisch zusammengefasst.

Kap. 3 Ergebnisse

Abbildung 19: Tabellarische Darstellung der Ergebnisse der Protein-DNA-Interaktionen zwischen den Fragmenten „msdB1-1“ bis „msdB1-33! und den Proteinextrakten aus dem Kopf- und Rumpfbereich von Mausembryonen E8.5, E9.5, E10.5 und E11.5. Als Laufpuffer wurde Tris-G-Puffer verwendet. ZE = Zellextrakt, / = keine Extrakt-spezifische Bande, ? = sehr schwache zusätzliche Bande.

Fragment Kopf Rumpf Kopf Rumpf Kopf Rumpf Kopf Rumpf

msd1-B1 / ?

Kap. 3 Ergebnisse

Obwohl in acht Fällen mehr oder weniger deutliche Unterschiede in den Bandenmustern nachgewiesen werden konnten, konnte auch mit diesen sehr kleinen Fragmenten keine eindeutige spezifische Bande für den Kopf- oder Rumpfbereich der Mausembryonen gezeigt werden.

Zur Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen zwischen msd und embryonalen murinen Proteinen wurden mehrere voneinander unabhängige Experimente mit unterschiedlich großen Fragmenten des mesodermalen Enhancers msd und unter variierten Bedingungen durchgeführt. Jedoch konnte in keinem Fall eine eindeutige zusätzliche Bande im Muster der nachgewiesenen Interaktionen mit embryonalen Proteinen des Kopf-, Rumpf- und Schwanzbereichs reproduzierbar dargestellt werden. Deshalb wurden die „Elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Analysen“ mit jeweils einem definierten Proteinextrakt der ganzen Zelle, hergestellt in zwei unabhängigen Extraktionen, aus der Kopf- und Schwanzregion von Mausembryonen E10.5 und den etwa 100-170 bp und den etwa 50 bp großen DNA-Fragmenten wiederholt. Mit diesen Extrakten konnte das für das jeweilige DNA-Subfragment typische Bandenmuster reproduziert werden. Es konnten aber keine zusätzlichen Banden als Hinweis auf eine spezifische Interaktion zwischen den radioaktiv markierten DNA-Fragmenten und den Proteinen aus der Kopf- bzw.

Schwanzregion ermittelt werden. In Abbildung 20 sind typische EMSA-Ergebnisse mit den ca. 100 bp und 50 bp großen „B“-Subfragmenten beispielhaft dargestellt.

Kap. 3 Ergebnisse

msd1-O7 msdB1-31

Kopf Kopf

Schwanz Schwanz msdB1-15 Kopf Schwanz

Abbildung 20: Darstellung typischer EMSA-Ergebnisse mit etwa 100 bp und 50 bp großen msd-Subfragmenten am Beispiel von „msd1-O7“, „msdB1-31“ und „msdB1-15“ nach Inkubation mit Proteinen aus Mausembryonen E10.5. Für jedes Fragment bilden sich typische Bandenmuster, die keinen Unterschied zwischen den Interaktionen mit Proteinen der Kopfregion und denen der Schwanzregion erkennen lassen.

Kap. 3 Ergebnisse

Zusammengefasst heißt dies, dass mit den „Elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Analysen“ DNA-Protein-Interaktionen zwischen acht Subfragmenten des mesodermalen Enhancers msd bzw. der Bindungsregion für Proteine der Oct-Familie und embryonalen Proteinen der Kopf-, Rumpf- und Schwanzregion von Embryonen E8.5, E9.5, E10.5 und E11.5 aufgezeigt werden konnten. Während mit der Sequenz der Oct-Bindungsregion nach der Inkubation mit embryonalen Proteinen in jedem Fall ein für diese Konstellation typisches Bandenmuster regelmäßig reproduziert werden konnte, blieben die Ergebnisse der Untersuchung der Interaktionen zwischen diesen Proteinextrakten und den Untereinheiten des msd-Fragments „B“ widersprüchlich und nicht regelmäßig reproduzierbar. Die regulatorische Sequenz des msd-Fragments „B“ konnte daher nicht weiter eingegrenzt werden.