Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und dem Institut für Molekularbiologie der Medizinischen Hochschule Hannover
„Charakterisierung der mesodermalen Enhancer msd und msdII der Promotorregion des Delta1 Gens der Maus“
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doctorin Medicinae Veterinariae (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Nadine Landgraf (geb. Griese)
aus Oldenburg
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Frau Univ.-Prof. E. Töpfer-Petersen Herr Univ.-Prof. A. Gossler
1. Gutachterin: Frau Prof. E. Töpfer-Petersen 2. Gutachter: Herr Prof. B. Brenig
Tag der mündlichen Prüfung: 28.052003
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung... 1
1.1 Somitogenese ... 1
1.2 Molekulare Grundlagen der Somitogenese ... 5
1.2.1 Der Notch-Signalübertragungsweg ... 7
1.2.2 Die Rolle von Delta während der Somitogenese... 9
1.3 Aufgabenstellung... 16
2 Material und Methoden ... 17
2.1 Chemikalien, Standardlösungen und Nährmedien... 17
2.1.1 Lösungen und Puffer ... 17
2.2 Allgemeine Klonierungstechniken... 18
2.2.1 Herstellung elektrokompetenter Bakterien... 18
2.2.2 Transformation von Plasmiden in Escherichia coli... 19
2.2.3 Präparation von Plasmid-DNA... 19
2.2.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren ... 20
2.2.5 Enzymatische Modifizierung von DNA ... 20
2.2.6 Klonierungstechniken... 21
2.3 Polymerasekettenreaktion (PCR)... 23
2.3.1 Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide ("Primer")... 23
2.3.2 Pufferlösungen ... 24
2.3.3 Standard-PCR ... 25
2.4 Tierexperimentelle Methoden... 28
2.4.1 Tierhaltung ... 28
2.4.2 Herstellung von transgenen Mäusen... 29
2.4.3 Präparation der transgenen Mausembryonen ... 29
2.4.4 Nachweis der LacZ-Expression... 29
2.5 Untersuchungen von Protein-DNA-Wechselwirkungen ... 30
2.5.1 Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Analyse ... 30
3 Ergebnisse ... 39
3.1 Untersuchung des mesodermalen Enhancer msd auf Erfüllung der Kriterien eines „klassischen Enhancers“ ... 39
3.1.1 Herstellung der Reportergenkonstrukte... 39
3.1.2 Herstellung und Analyse der transgenen Mausembryonen... 41
3.2 Eingrenzung der regulatorischen Sequenz von msd ... 44
3.2.1 Herstellung der Reportergenkonstrukte... 44
3.2.2 Herstellung und Analyse der transgenen Mausembryonen... 46
3.3 Untersuchung der DNA-Protein-Interaktionen zwischen msd sowie msdII und embryonalen Proteinen ... 50
3.3.1 Proteinbindung an msd... 54
3.3.2 Proteinbindung an msdII... 64
4 Diskussion ... 69
4.1 Untersuchung des mesodermalen Enhancers msd auf Erfüllung der Kriterien eines „klassischen Enhancers“ ... 69
4.2 Eingrenzung der regulatorischen Sequenz von msd ... 72
4.3 Proteinbindung an msd und msdII ... 74
5 Zusammenfassung ... 85
6 Summary ... 87
7 Zitierte Literatur... 89
8 Anhang ... 95
8.1 Liste der verwendeten und der erstellten Plasmide und deren laborinterne Plasmidnummern ... 95
Abkürzungsverzeichnis
% Prozent
°C Grad Celsius
µ Mikro- (10-6)
32P radioaktives Phosphorisotop der Atommasse 32 A Adenin (bei Angabe von Nukleotidsequenzen) Abb. Abbildung
bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin (Bovine Serum Albumine) C Zytosin (bei Angabe von Nukleotidsequenzen) ca. circa
cDNA copy DNA
Cpm gemessener radioaktiver Zerfall pro Minute CPV gepackte Zellmasse (cell packed volume) d Tag
dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxyguanosintriphosphat ddH20 Reinstwasser
dgTP Desoxyzytosintriphosphat dTTP Desoxythymidintriphosphat DEPC Diethylpyrokarbonat
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Gemisch aus Desoxyadenosin-, -guanosin-, -zytosin- und -thymidintriphosphat
DTT Dithiothreitol E.coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz
EGTA Ehylenglycol-bis(aminoethylether)tetraessigsäure-Dinatriumsalz
EMSA Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Analyse et al. (et alteri) und andere
Fa. Firma (Hersteller)
G Guanin (bei Angabe von Nukleotidsequenzen) g Schwerkraft
hCG Humanes Chorion Gonadotropin HCl Salzsäure
HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-Ethanolsulfonsäure IPTG Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid
kb Kilobasen
KCL Kaliumchlorid KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat
lacZ ß-Galaktosidase-Gen LB Vollmedium (Luria-Bertani-Medium)
M Mol
mAmp Milliampere
MBq Megabecquerel, Einheit für Radioaktivität MegOhm MegaOhm, elektrischer Widerstand mg Milligramm µg Mikrogramm MgCl2 Magnesiumchlorid
min. Minute(n) ml Milliliter
mRNA messenger RNA
NaCl Natriumchlorid
Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat NaH2PO4 Natriumdihydrogenphosphat
NaOH Natriumhydroxid nm Nanometer
OD optische Dichte
PBS Phosphat gepufferte Salzlösung („phosphate buffered saline“) p. c. post coitum, nach der Befruchtung
PCR Polymerase Kettenreaktion („polymerase chain reaction“) pH Potentia hydrogenii
p Piko- (10-9)
PMS Pregnant Mare´s Serum Gonadotropin PSM präsomitisches Mesoderm
RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease RT Raumtemperatur sec. Sekunde(n)
ss einzelsträngig SV40 Simian Virus 40
T Thymin (bei Angabe von Nukleotidsequenzen) TAE Tris-Acetat-EDTA
Taq Thermus aquaticus
TBE Tris-Borat-EDTA TE Tris-EDTA
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Tris-G Tris-Glyzin-Puffer
U Unit = Einheit der biologischen Aktivität Upm Umdrehungen pro Minute
UV Ultraviolett
V Volt
vgl. vergleiche
% (v/v) Volumenprozent
% (w/v) Gewichtsprozent
X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactophyranosid
Kap. 1 Einleitung
1 Einleitung
Die Maus (Mus musculus) dient als ein Säugetiermodell für genetische und entwicklungsbiologische Studien (Rugh, 1990; Theiler, 1988). Die Vorteile liegen in einer relativ kurzen Generationszeit und im Vorhandensein einer großen Anzahl von Mausinzuchtstämmen, die für Kreuzungsexperimente erforderlich sind.
1.1 Somitogenese
Der Terminus „Somitogenese“ impliziert die Entstehung und den Aufbau des paraxialen Mesoderms, die Bildung der vollständigen Somiten und die frühen Schritte der nachfolgenden Differenzierung. Die Somitogenese ist ein grundlegender musterbildender Prozess, der in allen Embryonen von Vertebraten (und Zephalopoden) im Mesoderm ein periodisches Muster von homologen Zellblöcken, den Somiten, bilateral auf beiden Seiten des Neuralrohres anlegt. Die sich daraus ergebende segmentale (oder metamerische) Anordnung der Somiten entlang der anterior-posterioren Körperachse unterliegt dem Metamerismus der von den Somiten entstandenen Strukturen und determiniert zusätzlich die segmentierte Anordnung von Teilen des peripheren Nervensystems. Somiten sind in Embryonen aller Vertebratenklassen unter einer Vielzahl experimenteller Fragestellungen untersucht worden.
Der Prozess der Somitogenese lässt sich in vier Schritte gliedern (Gossler, 2002), die in strikter zeitlicher und, da sich Vertebratenembryonen von kranial nach kaudal entwickeln, auch in strikter räumlicher Abfolge vollzogen werden:
1. Spezifizierung und Rekrutierung von Zellen ins paraxiale Mesoderm („Rekrutierung“)
2. Organisation des präsomitischen Mesoderms in Somitomeren und ihre Kompartmentalisierung („Organisation“)
3. Ausbildung morphologisch unterscheidbarer Segmente (epitheliale Somiten) („Segmentierung“)
4. Generierung unterschiedlich differenzierter Zelltypen („Differenzierung“)
Kap. 1 Einleitung
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Somitogenese (Gossler, 2002, Fig. 1). Die bereits geformten Somiten sind entsprechend ihrer kranio-kaudalen Abfolge mit Arabischen Ziffern gekennzeichnet. Das Entwicklungsstadium der Somiten bzw.
Somitomeren ist mit Römischen Zahlen belegt (I bis IV bzw. -III bis 0) (Christ and Ordahl, 1995). In blau: Dermamyotom, rot: Myotom, gelb: Sklerotom, grün: Notochord, orange:
kondensierendes prävertebrales Mesenchym.
Ad 1: „Rekrutierung“
Während der Gastrulation, welche bei der Maus etwa am Tag 6.5 nach der Befruchtung (post coitum, p.c., Embryonalstadium E6.5) mit der Bildung des Primitivstreifens eingeleitet wird (Poelmann, 1981; Snell and Stevens, 1991), werden verschiedene Regionen des Mesoderms, die sich in verschiedene Gewebe des Embryos aufteilen, aufgebaut. Das axiale Mesoderm bildet den Kopffortsatz und das Notochord, welches das darüber liegende Ektoderm zur Bildung des Neuralrohres induziert. Das paraxiale Mesoderm entsteht aus Zellen, die sich durch den Primitivstreifen einstülpen und flankiert das Notochord und das Neuralrohr beiderseits als dickes Band. Etwa am Tag 9.5 der Mausentwicklung besiedeln die Reste des Primitivstreifens eine schmale Zone dorso-kaudal im Embryo, die daraufhin zur Schwanzknospe wird. Von dieser wird die Bildung des paraxialen Mesoderms übernommen, bis die Verlängerung der Körperachse etwa am Tag 12.5 p. c. beendet ist.
Kap. 1 Einleitung
Ad 2 und 3: „Organisation“ und „Spezifizierung“
Ungefähr am Tag 7.75 der Mausentwicklung werden die ersten Somiten in der posterioren Kopffaltenregion des Embryos gebildet. Anschließend werden neue Somiten in relativ konstanten Abständen (in Abhängigkeit von der Spezies) in strikter anterior-posteriorer Abfolge hinzugefügt, während gleichzeitig neues Mesoderm gebildet und am posterioren Ende angefügt wird. Diese kondensierten metamerischen Somiten können als segmentale Unterteilungen entlang der anterior-posterioren Achse aufgefasst werden. Das paraxiale Mesoderm kaudal des letzten Somiten wird in der Maus präsomitisches oder unsegmentiertes Mesoderm genannt. In der voranschreitenden Somitenbildung werden diskrete Aggregate von Mesodermzellen, die Somitomeren, im präsomitischen Mesoderm sichtbar (Meier, 1982; Tam and Meier, 1982).
Während der Bildung der Somiten wird das lose Mesenchym des präsomitischen Mesoderms umgeformt (Hamilton, 1969). In der Maus stellt der reife Somit eine sphärische Kugel von Zellen dar, die ein einfaches dreischichtiges Säulenepithel um einen zentralen Hohlraum, das Somitozöl, aufbauen. Die Zellen der äußeren Epithelschicht sind miteinander durch Verbindungskomplexe nahe der apikalen Zelloberfläche, die zum Somitozöl hin gerichtet ist, verbunden. Die Außenseite der Somiten (an der basalen Fläche der Zellen) wird von einer Basalmembran bedeckt, die jeden Somiten mit dem daneben liegenden Gewebe und benachbarten Somiten verbindet und gleichzeitig davon trennt.
Ad 4: „Differenzierung“
Kurz nach ihrer Entstehung differenzieren die Somiten weiter aus (Abbildung 2).
Während der Differenzierung lösen sich die Zellen an der ventralen Seite der Somiten und wandern auf das Notochord zu, welches von den eingewanderten Zellen umschlossen wird. Diese Zellen stellen als Sklerotom den Ursprung der axialen Skelettes (Rippen, Wirbelkörper) dar. Die Sklerotome der anterioren fünf Somiten bilden die okzipitalen Knochen, während die Sklerotome der restlichen Somiten die Vorläufer der Wirbelkörper, der Wirbelbögen und der Rippen darstellen (Christ and Ordahl, 1995; Couly et al., 1992; Theiler, 1988). Dorso- lateral zum Sklerotom bleibt bilateral eine epitheliale Zellkappe, das Dermamyotom, bestehen. Die Zellen des dorsalen Dermamyotoms entwickeln
Kap. 1 Einleitung
sich später zum Bindegewebe der Haut, die ventralen Myotomzellen bilden die Muskulatur der Körperwand und der Gliedmassen, und Zellen aus allen Regionen des Somiten werden zu Zellen des vaskulären Epithels.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Differenzierung der Somiten. Aus dem paraxialen Mesoderm gehen Somiten hervor, die sich über die Zwischenstufen Sklerotom sowie Dermatom und Myotom zum axialen Skelett und Teilen der Muskulatur sowie der Dermis entwickeln.
Die Embryonen im Stadium der frühen Organogenese enthalten gleichzeitig Somiten verschiedener Entwicklungsstadien. Obwohl das basale zelluläre Differenzierungsschema der verschiedenen Somiten sehr ähnlich aufgebaut ist, entwickeln sich aus den Somiten einheitliche anatomische Strukturen entlang der anterior-posterioren Körperachse, weil sie in der frühen Entwicklung spezifische Identitäten in Bezug auf ihre axiale Position benötigen.
Am Tag 13.5 p. c. der Mausentwicklung sind etwa 65 Somitenpaare gebildet. Zu diesem Zeitpunkt gilt die Somitogenese als beendet. Die Gesamtanzahl der Somiten ist spezifisch für jede Spezies, kann aber, selbst zwischen eng verwandten Spezies, sehr stark variieren (Richardson et al., 1998).
Kap. 1 Einleitung
1.2 Molekulare Grundlagen der Somitogenese
Es ist eine große Zahl von Genen bekannt, die im präsomitischen Mesoderm und in den Somiten exprimiert werden (Rawls et al., 2000) und eine Rolle bei der Somitogenese spielen könnten. In Abbildung 3 sind einige dieser Gene mit ihren spezifischen Genexpressionsmustern im präsomitischen Mesoderm und den ersten Somiten schematisch dargestellt. Die spezifischen Genexpressionsdomänen zeigen, dass das präsomitische Mesoderm auf molekularer Ebene kein homogenes Gewebe darstellt.
Abbildung 3: Darstellung der spezifischen Expressionsmuster verschiedener Gene im paraxialen Mesoderm von Mausembryonen. Das Expressionslevel ist farbkodiert: schwarz, starke Expression; grau, mittleres Expressionslevel; hellgrau bis weiß, sehr schwache bis keine Expression (Gossler, 2002).
Bereits im scheinbar unsegmentierten Mesoderm existiert ein sogenanntes
„Prepattern“. Das bedeutet, dass das präsomitische Mesoderm bereits in Regionen unterteilt ist und einem bestimmten Muster unterliegt. Man geht davon
Kap. 1 Einleitung
aus, dass die Somitenbildung einem sogenannten „clock and wavefront“- Mechanismus erfolgt: Die erste Komponente ist ein biochemischer Oszillator (die
„Segmentierungsuhr“), der in den Zellen des präsomitischen Mesoderms, dem unreifen Gewebe, läuft und von dem die sequentielle Bildung der Somiten ausgeht (Palmeirim et al., 1997). Die zweite Komponente ist ein Gradient, der die Entwicklungsrate der Zellen des präsomitischen Mesoderms entlang der anterior- posterioren Körperachse festlegt. Im Hinblick auf die Segmentierung bestimmt dieser Gradient, dass anteriore Zellen ein höheres Potential besitzen, Somiten zu bilden. Diese Wellenfront der Reifung schwingt zurück durch dieses Gewebe, wodurch die Oszillation angehalten wird und die Differenzierung der Somiten initiiert wird (Pourquie, 1999). Die Zellen werden in verschiedenen Phasen ihres Zyklus arretiert, so dass sie unterschiedliche Gene exprimieren, welche das räumliche periodische Schnittmuster der Somiten definieren und den physiologischen Prozess der Segmentierung kontrollieren. Die Expression verschiedener Gene in bestimmten Regionen des präsomitischen Mesoderms oder auch in periodischen Mustern korreliert mit den somitischen Vorläufern, und die Funktion von zumindest einem Teil dieser Gene scheint notwendig für die Segmentierung und/oder die normale Bildung der Somiten. Das "clock and wavefront" Modell wurde ursprünglich dazu aufgestellt, um experimentelle Ergebnisse aus den Versuchen mit größenmanipulierten Xenopus-Embryonen zu erklären (Cooke, 1981; Cooke and Zeeman, 1976): Xenopus-Embryonen im Blastula-Stadium, die in ihrer Zellmasse reduziert werden, entwickeln normale Anzahl von Somiten, die jeweils weniger Zellen enthalten. Das Model der
"Molekularen Uhr" setzt voraus, dass im präsomitischen Mesoderm ein autonomer zellulärer Oszillator vorhanden ist, der sich beispielsweise durch eine rhythmische Produktion von mRNA äußert. Tatsächlich gibt es Gene, die periodisch wechselnde Expressionsmuster zeigen, wobei eine "Oszillationsperiode" der Bildung eines Somiten entspricht. In der Maus weisen die Glykosyltransferase Lunatic fringe (Lfng) und vier Transkriptionsfaktoren der bHLH-Familie (Hes1, Hes7 und Hey2) eine oszillierende Expression im präsomitischen Mesoderm auf (Aulehla and Johnson, 1999; Bessho et al., 2001a; Forsberg et al., 1998; Jouve et al., 2000).
Kap. 1 Einleitung
Eine Unterteilung der Somiten in eine anteriore und eine posteriore Hälfte wurde zuerst von von Ebner (von Ebner, 1888) postuliert, welcher in den Sklerotomen von Schlangenembryonen feine Spalten (von Ebner’s Spalten) beschrieben hat, welche die kranialen und kaudalen Hälften der Sklerotome voneinander trennen.
Die Existenz dieser Spalten wurde von Keynes und Stern (Keynes and Stern, 1984; Keynes and Stern, 1986; Keynes et al., 1987) bestätigt. Die anterioren und posterioren Somitenhälften unterscheiden sich in der Genexpression und in den zellulären Eigenschaften. So wandern beispielsweise die Neuralleistenzellen ausschließlich durch den anterioren Teil des angrenzenden Sklerotoms ein (Keynes and Stern, 1984). Ebenso sind die Migration der Zellen der Neuralleiste zwischen den Zellen des Neuralrohres und des Sklerotoms sowie die Entwicklung der Spinalganglien, die den Zellen der Neuralleiste entstammen, und deren Auswachsen der sensorischen Axone auf die anteriore Hälfte eines jeden Segmentes beschränkt (Teillet et al., 1987). Weiterhin stellen die Unterschiede zwischen den anterioren und den posterioren Somitenhälften vermutlich auch einen Mechanismus bereit, der die Grenzen zwischen den Segmenten nach der Bildung des mesenchymalen Sklerotoms aufrecht erhält (Stern and Keynes, 1987). Diese Hypothese wird auf genetischer Ebene durch Studien am Delta-like 1 (Dll1) Gen der Maus unterstützt (Bettenhausen et al., 1995; del Amo et al., 1992; Hrabé de Angelis et al., 1997). Zusammen mit den Studien der Funktion des X-Delta-2 Gens (Jen et al., 1997) lassen diese Daten vermuten, dass die vom Notch-Signalübertragungsweg bestimmte Zell-Zell-Kommunikation sowohl in die Bildung als auch in die Aufrechterhaltung der Segmentgrenzen eingebunden ist.
1.2.1 Der Notch-Signalübertragungsweg
Die Transmembranproteine Delta und Notch vermitteln direkte Zell-Zell- Kommunikation und regulieren auf diesem Weg Entscheidungen über das Zellschicksal in verschiedenen Organismen (Vässin et al., 1987; Wharton et al., 1985). Die Interaktion zwischen Notch und Delta wird als Notch- Signalübertragungsweg bezeichnet und kontrolliert ein breites Spektrum von Zellschicksalen und Entwicklungsvorgängen (in Organismen vom Seeigel bis zum Menschen). In der Somitogenese spielt der Notch-Signalübertragungsweg eine zentrale Rolle.
Kap. 1 Einleitung
Der Notch-Signalübertragungsweg wurde durch experimentelle Studien der Entwicklung von Vorläuferzellen des zentralen Nervensystem und der sensorischen Organe im Neuroektoderm von Drosophila entdeckt (Campos- Ortega, 1993). Notch, Delta und Serrate kodieren für die Rezeptoren und Liganden des Notch-Signalübertragungswegs. Es wird angenommen, dass die Liganden Delta und Serrate als Transmembranproteine fungieren, die über die extrazelluläre Domäne mit dem Rezeptor Notch, der auf einer benachbarten Zelle exprimiert wird, interagieren (Abbildung 4) (Fleming et al., 1997). Notch wird im trans-Golgi-Netzwerk durch die Konvertase Furin gespalten, im endoplasmatischen Retikulum durch die Glykosyltransferase Fringe moduliert und bildet anschließend ein heterodimeres Transmembran-Molekül (Aulehla and Johnson, 1999; Blaumueller et al., 1997; Fleming et al., 1997; Hicks et al., 2000;
Irvine and Wieschaus, 1994; Wu and Rao, 1999). Im Anschluss an die Interaktion zwischen Delta und Notch wird die intrazelluläre Domäne von Notch abgespalten (möglicherweise durch Preseniline), wird zum Zellkern transportiert und bindet dort an einen Transkriptionsfaktor der Suppressor of Hairless [Su(H)])-Familie, welcher an regulaturische Sequenzen des Enhancer of split [e(spl)]-Genkomplex bindet, der für bHLH-Proteine kodiert (Fortini and Artavanis-Tsakonas, 1994; Jarriault et al., 1998; Kidd et al., 1998; Kopan et al., 1996; Schroeter et al., 1998).
Bislang sind in der Maus vier Homologe für Notch (Notch1 bis Notch 4), drei Homologe für Delta (Dll1, Dll3 und Dll4), zwei Homologe zu Serrate (Jagged1 und Jagged2) und drei Fringe-Gene (Lunatic-, Radical- und Maniac fringe) bekannt (Williams et al., 1995). Der Transkriptionsfaktor der [Su(H)])-Familie in der Maus ist RBPjκ, die Homologen der Enhancer of split [e(spl)]-Familie sind Mitglieder der Hes-Familie (Hes1, -2, -3, -5, -6 und -7) (Bessho et al., 2001a; Bessho et al., 2001b). Notch1, Dll1 und Dll3 sowie einige Gene, die für bHLH-Proteine kodieren (paraxis, scleraxis, Mesp1 und Mesp2) werden zu bestimmten Zeiten in bestimmten Regionen des präsomitischen Mesoderms exprimiert, wobei sich die Expression von Notch1 und Dll1 zeitlich überschneidet.
Kap. 1 Einleitung
Abbildung 4: Schematische Darstellung des Notch-Signalübertragungswegs. Durch die Interaktion von Notch und Delta an zwei benachbarten Zellen, moduliert durch die Glykosyltransferase Fringe, wird der intrazelluläre Teil von Notch abgespalten. Dieser wandert in den Kern der empfangenden Zelle, um dort die Expression eines Transkriptionsregulators zu veranlassen (Schroeder, persönliche Mitteilung).
1.2.2 Die Rolle von Delta während der Somitogenese
1.2.2.1 Das Maus Gen Delta1
Das Delta 1 Gen der Maus ist ein wichtiger Faktor für den geordneten Ablauf der Somitogenese. Durch gezielte Inaktivierung von Dll1 konnte gezeigt werden, daß die Expression im paraxialen Mesoderm notwendig für die Umwandlung des mesenchymalen präsomitischen Mesoderms in epitheliale Somiten, für das anterior-posteriore Schnittmuster der Somiten und die Aufrechterhaltung der Somitengrenzen ist (Hrabé de Angelis et al., 1997, vgl. Abbildung 5).
Kap. 1 Einleitung
Dll1 wird in der Embryonalentwicklung nach einem komplexen und dynamischen Muster exprimiert. Der früheste Zeitpunkt der Expression konnte am Tag 7 p. c. im Primitivstreifen und im embryonalen Mesoderm ermittelt werden. Am Tag 7.5 p. c.
ist die Expression auf das posteriore Mesoderm begrenzt. Während der präsomitischen Entwicklungsstufen zeigt sich eine scharfe Grenze der Expression unmittelbar anterior des Primitivknotens. Die starke Expression im präsomitischen Mesoderm bleibt bis zum Ende der Somitogenese zwischen E14 und E15 erhalten.
In den Somiten ist die Expression von Dll1 auf die posterioren Somitenhälften und auf die Myotome der differenzierenden Somiten beschränkt (Bettenhausen et al., 1995) (vgl. Abbildung 5). Im zentralen Nervensystem wurde die Expression von Dll1 ab Tag 8 der Entwicklung in den anterioren Neuralfalten des späteren Mittel- und Vorderhirns nachgewiesen. Ab Tag 9.5 p. c. dehnt sich die Expression auf das Neuralrohr aus und wird später auch in den kraniofazialen Ganglien, in den Neuralleistenzellen, in den Spinalnerven und den Spinalganglien gefunden (Bettenhausen et al., 1995). Durch das feinkörnige Verteilungsmuster von Zellen des Neuroektoderms, die Delta1 exprimieren und nicht exprimieren scheint Delta1 für die Aufrechterhaltung neuroepithelialer Vorläuferzellen und deren geordnete Differenzierung in neuronale Vorläufer zu sein (Hrabé de Angelis, nicht publizierte Ergebnisse). Diese Funktion von Dll1 in der Differenzierung der Nervenzellvorläufer wird in Drosophila als „laterale Inhibierung“ bezeichnet und ist auch in der Neurogenese von Xenopus und Teleostfisch beschrieben worden (Appel and Eisen, 1998; Campos-Ortega, 1995; Chitnis et al., 1995). Ebenfalls in der frühen Entwicklungsphase konnte eine Expression von Dll1 im Mesoderm und den Tubuli des Mesonephrons nachgewiesen werden (Bettenhausen et al., 1995).
Weiterhin wird Dll1 während der Organogenese und der weiteren fetalen Entwicklung (ab E13.5) in verschiedenen Organanlagen wie Thymus, in den Nieren, der Lunge, dem Pankreas und in den serösen Drüsen exprimiert. Die Expression persistiert in den Skelettmuskelzellen und im Nervengewebe und ist außerdem in einigen Bereichen des sensorischen Epithels, wie beispielsweise in der Retina, nachweisbar (Beckers et al., 1999; Morrison et al., 1999). In mRNA- Extrakten adulter Mäuse konnten Dll1-Transkripte in der Lunge und im Herzen nachgewiesen werden (Bettenhausen et al., 1995).
Kap. 1 Einleitung
1.2.2.2 Der Promotorbereich von Delta1
Das dynamische Expressionsmuster des Maus Delta1 Gens in bestimmten Geweben und Zellarten deutet darauf hin, dass spezifische Transkriptionsfaktoren einzeln oder in Kombination die zeitliche und räumliche Expression dieses Gens steuern.
In vorangegangenen transgenen Analysen wurde gezeigt, dass die histochemische Detektion der Reportergenexpression im Dll1 Allel die endogene Expression in heterozygoten Mutanten reproduziert (Beckers et al., 1999).
Beckers et al. haben den Promotorbereich des Delta1 Gens der Maus in transgenen Analysen untersucht (Beckers et al., 2000). Das dabei verwendete Transgen (Dll1tg4.3/lacZ) enthielt 4,3 kb der nicht translatierten Sequenz von Dll1 stromaufwärts der codierenden Region in Verbindung mit dem ersten Codon des Delta1 Gens (unter Einhaltung des Rahmens, ‚in frame’), dem Escherichia coli (E.
coli) LacZ Gen, dem SV40 und dem PGK Polyadenylierungssignal. Um die Expression des Transgens mit der endogenen Expression zu vergleichen, wurde auf das Dll1-LacZ knock-out Allel (Dll1lacZ) zurückgegriffen, welches das Reportergen LacZ im Bereich des endogenen Delta1 Locus exprimiert (Hrabé de Angelis et al., 1997).
Die Expression des Dll1tg4.3/lacZ-Transgens und des Dll1lacZ-Transgens begann mit dem Anfang der Gastrulation im Primitivstreifen (E6.5-7). Zu diesem Zeitpunkt konnte die Expression in Zellen des Primitivstreifens und des Mesoderms gefunden werden. Während der Segmentierung des Mesoderms (E8) verstärkte sich die Expression im präsomitischen Mesoderm und in den Somiten. Sowohl das Transgen als auch das endogene Gen wurden zusätzlich in den anterioren Neuralfalten exprimiert. In den frühen Stadien der Organogenese (E10.5-11) wurde die Expression im PSM, in den Somiten und im zentralen Nervensystem (in den Spinalnerven und Ganglien) gefunden, welches dem endogenen Expressionsmuster entsprach. Das gleiche Expressionsmuster zeigte sich in den Mäusen, die heterozygot für das Dll1lacZ-Allel waren. Das Transgen und das Dll1lacZ-Allel wurden nicht im Neuralrohr, im Notochord, in der Schwanzspitze oder im embryonalen Ektoderm in dieser posterioren Region gefunden. Weiter anterior gelegen wurde Delta1 im Neuralrohr exprimiert. Dieses spezifische
Kap. 1 Einleitung
Expressionsmuster wurde vom Dll1tg4.3/lacZ-Transgen reproduziert. Im Gegensatz zur endogenen Expression in den Somiten, die auf die posterioren Kompartimente eines jeden Segments begrenzt ist, erfolgte die Expression in den ganzen Somiten. In späteren Stadien reflektierte die Expression des LacZ-Transgens nur einen Teil der endogenen Expressionsdomänen. Beispielsweise beginnt eine Expression von Delta1 in der Retina und in den Skelettmuskeln etwa am Tag 14 p.c., jedoch fehlte dieses Expressionsmuster den Dll1tg4.3/lacZ-Embryonen.
Aus diesen Analysen wurde geschlossen, dass die 4,3 kb große Region stromaufwärts der kodierenden Region von Delta1 regulatorische Sequenzen enthält, die das endogene Expressionsmuster in transgenen Mäusen von Beginn der Expression (E6.5) im Stadium des Primitivstreifens bis zur frühen Organogenese reproduzieren.
Durch Deletionen im 5’-Bereich des 4,3 kb umfassenden Reportergenkonstrukts (Dll1tg4.3/lacZ) wurde der Promotorbereich von Dll1 weiter analysiert. Zunächst wurde der Promotorbereich auf 3,6 kb verkleinert (Dll1tg3.6/lacZ). Dieses Transgen wurde im präsomitischen und im somitischen Mesoderm, in der gesamten Länge des Neuralrohrs, in den Spinalnerven und in den Ganglien exprimiert. Das Expressionsmuster dieses Transgens war hoch reproduzierbar und war bis auf die Expression im ventralen Neuralrohr, vergleichbar mit dem Expressionsmuster der Dll1tg4.3/lacZ-Transgens.
Es erfolgte eine weitere Deletion auf 2,5 kb, Dll1tg2.5/lacZ, welche im 5’-Bereich eine Homologie zum Promotorbereich vom Zebrafisch DeltaD, als Homologieregion HII bezeichnet, aufwies. Die Analyse erfolgte in Embryonen der Stadien E11.5 und E12.5, in denen das Transgen weder im PSM noch im somitischen Mesoderm exprimiert wurde. Stattdessen zeigten die untersuchten Embryonen eine Expression des Reportergens im Neuralrohr.
Da das Transgen Dll1tg3.6/lacZ stark und gut reproduzierbar im paraxialen Mesoderm exprimiert wurde, das kleinere Transgen Dll1tg2.5/lacZ jedoch nicht, wurde daraus geschlossen, dass sich ein Enhancer, der die Expression spezifisch in diesem Gewebe reguliert, im 5’-Bereich des Dll1tg3.6/lacZ-Transgens befinden muss. Dieses wurde anhand eines weiteren Transgens mit einer Größe von 1,5 kb (Dll1tg’msd’/lacZ
) untersucht. Dieses Transgen wurde im Stadium E10.5
Kap. 1 Einleitung
ausschließlich im präsomitischen und im somitischen Mesoderm exprimiert. In diesem Stadium lag zumindest in den ersten acht bis neun zuletzt gebildeten Somiten eine starke Expression vor. Die Expression war nicht auf die posterioren Somitenhälften beschränkt, sondern erfolgte in den ganzen Somiten (siehe Abbildung 5). Es lag keine signifikante Expression im Neuralrohr oder in anderem Gewebe außerhalb des paraxialen Mesoderms vor.
Abbildung 5: Expressionsmuster von Delta1 bzw. dem Reportergen LacZ in Mausembryonen und daraus resultierende Phänotypen. Die endogene Dll1-Expression ist auf das PSM und die posteroiren Somitenhälften beschränkt. Nach gezielter Inaktivierung von Dll1 („Dll1-knockout“, Dll1LacZ) ist eine Umwandlung des mesenchymalen Mesoderms in epitheliale Somiten, die anterior-posteriore Musterbildung der Somiten und die Aufrechterhaltung der Somitengrenzen nicht möglich (Hrabé de Angelis et al., 1997).
Durch das Element msd kann die Expression des Reportergens LacZ in Mausembryonen, die das Transgen Dll1tg’msd’/lacZ
tragen, spezifisch im PSM und in allen Bereichen der 6-8 neu gebildeten Somiten gesteuert werden (Beckers et al., 2000). Gelb: Dll1-Expression, blau: Reportergenexpression (LacZ); grau: keine Expression von Dll1.
Durch die Untersuchung zweier Mauslinien mit dem Transgen Dll1tg’msd’/lacZ
konnte gezeigt werden, dass die Expression des Transgens zeitlich mit dem Erscheinen des paraxialen Mesoderms im Primitivstreifen-Stadium übereinstimmte und auf das paraxiale Mesoderm und daraus hervorgehendes Gewebe zumindest bis zur frühen Organogenese beschränkt war. Daraus wurde geschlossen, dass die von
Kap. 1 Einleitung
regulatorischen Elementen der msd-Region gesteuerte Reportergenexpression in den mesodermalen Domänen spezifisch war.
Durch eine weitere 5’-Deletion entstand das Dll1tg1.6/lacZ-Transgen. Im Gegensatz zum größeren Transgen Dll1tg2.5/lacZ konnte mit diesem Konstrukt eine starke Reportergenexpression im paraxialen Mesoderm sowie eine schwächere in der ventralen Region des Neuralrohrs nachgewiesen werden. Daraus wurde gefolgert, dass sich in dem 1,6 kb umfassenden proximalen Promoterelement regulatorische Sequenzen für zwei Expressionsdomänen befinden müssen: ein als msdII bezeichnetes regulatorisches Element, das die Expression im präsomitischen und im somitischen Mesoderm steuert, sowie ein Enhancer für die neurale Expression.
Da das Transgen Dll1tg2,5/lacZ im Gegensatz zum Transgen Dll1tg1,6/lacZ nicht signifikant im paraxialen Mesoderm exprimiert worden ist, wurde daraus geschlossen, dass die Region von 1,6 bis 2,5 kb stromaufwärts der kodierenden Sequenz von Delta1 mindestens ein regulatorisches Element trägt, welches die Funktion des mesodermalen Enhancers msdII hinsichtlich der mesodermalen Expression zumindest im Kontext des Transgens Dll1tg2,5/lacZ unterdrückt.
Weiterhin wurden zwei Bereiche, die Homologiebereiche HI und HII zum Zebrafisch DeltaD, in transgenen Embryonen der Stadien E11.5 und E12.5 analysiert. In diesen Embryonen wurde das Transgen ausschließlich im Neuralrohr exprimiert. Die bislang analysierten regulatorischen Bereiche im Promotorbereich von Dll1 sind in Abbildung 6 dargestellt.
Abbildung 6: Schematische Darstellung bisher analysierter regulatorischer Elemente der Promotorregion von Delta1 und deren Gewebespezifität. Die Promotorregion von Dll1 enthält die beiden mesodermalen Enhancer msd und msdII, die eine Reportergenexpression im präsomitischen Mesoderm steuern. Unter der Kontrolle von msdII erfolgt außerdem eine schwache Expression im ventralen Neuralrohr. Zwei weitere Bereiche HI und HII regulieren die Expression von Dll1 im neuralen Gewebe (Beckers et al., 2000). HI = HomologieregionI, HII = HomologieregionII, Pfeil = Transkriptionsstart.
5’ 3’
HI msd HII msdII exprimierter Bereich von Dll1
Kap. 1 Einleitung
Zusammengefasst bedeutet dies, dass ein Bereich von 4,3 kb stromaufwärts der kodierenden Sequenz des Delta1 Gens ausreichend ist, um in transgenen Mäusen die meisten Aspekte der endogenen Expression von der Gastrulationsphase bis zur Organogenese zu reproduzieren. Dieser Bereich enthält cis-regulatorische Elemente (siehe Abbildung 6), die eine Genexpression räumlich und zeitlich individuell steuern. Die Expression im paraxialen Mesoderm scheint von mehreren positiven und negativen regulatorischen Elementen abhängig zu sein. Mindestens zwei Regionen fungieren als neuronale Enhancer, zwei weitere, msd und msdII, als mesodermale Enhancer. Letztere steuern die Expression des Dll1-Gens spezifisch im präsomitischen und somitischen paraxialen Mesoderm. Die Größe dieser Regionen liegt für msd bei 1,5 kb und für msdII bei 850 bp. Des weiteren gibt es in der Region von msd ein Element, das die Funktion von msdII reprimieren kann.
Aus der Tatsache, dass die Expression von Delta1 in den Somiten ausschließlich auf die posterioren Kompartimente und die Myotome der sich differenzierenden Somiten begrenzt ist (Bettenhausen et al., 1995), die Expression des Dll1tg4.3/lacZ Allels jedoch in den ganzen Somiten erfolgt, lässt sich schließen, dass es außerhalb dieses Bereiches der Promotorregion ein Element geben muss, welches die Expression von Dll1 in den anterioren Somitenhälften reprimiert (Beckers et al., 2000).
Anhand der beiden mesodermalen Enhancer msd und msdII können weitere Erkenntnisse auf dem Gebiet der Somitogenese gewonnen werden. So könnten nach einer genauere Lokalisierung der regulatorischen Sequenzen diejenigen Transkriptionsfaktoren, durch die diese Enhancer aktiviert werden, ermittelt werden. Weiterhin wäre es möglich, diese regulatorischen Elemente zur gezielten Steuerung der Expression verschiedener anderer Gene im paraxialen Mesoderm einzusetzen, beispielsweise um diese Gene näher zu analysieren.
Kap. 1 Einleitung
1.3 Aufgabenstellung
In der vorliegenden Arbeit sollten die beiden als msd und msdII bezeichneten Bereiche der Promotorregion des Delta1-Gens, welche die Expression des Delta1- Gens der Maus spezifisch im paraxialem Mesoderm steuern, näher untersucht werden. Anhand transgener Analysen sollte das als mesodermaler Enhancer msd bezeichnete Element weitergehend auf seine Enhancerfunktion überprüft und die regulatorische Sequenz möglichst weit eingegrenzt werden. Anschließend sollte die Interaktion zwischen zellulären Proteinen aus Mausembryonen und Untereinheiten der beiden mesodermalen Enhancer msd und msdII untersucht werden, um die Bindungsregionen für die entsprechenden Transkriptionsfaktoren zu lokalisieren. Nur nach einer sehr engen Eingrenzung der regulatorischen Bereiche (auf etwa 100-200 bp) ist es möglich, die entsprechenden Transkriptionsfaktoren und deren Bindungsstellen zu ermitteln.
Kap. 2 Material und Methoden
2 Material und Methoden
2.1 Chemikalien, Standardlösungen und Nährmedien
Die im Verlauf dieser Arbeit verwendeten Chemikalien wurden, sofern nicht anders erwähnt, von den Firmen Applichem GmbH, J.T. Baker, Boehringer Mannheim, Difco Laboratories, Gibco BRL, Merck, Riedel de Haèn, Roth GmbH und Sigma bezogen. Zum Ansetzen der Lösungen wurde Reinstwasser (ddH2O Leitwert >15 MegOhm) aus einer Reinstwasseranlage (Fa. Millipore) verwendet.
Spezielle, im folgenden nicht aufgeführte, Lösungen und Chemikalien werden bei den einzelnen Methoden entsprechend ihrer Verwendung beschrieben.
Die verwendeten Standardlösungen und Puffersysteme setzen sich wie folgt zusammen:
2.1.1 Lösungen und Puffer
DNA-Auftragspuffer 50% (v/v) Glyzerin
0,2% (w/v) Orange G
in TAE-Puffer
DNA-Ladepuffer (10x) 50 mM Tris-HCl pH 8,0 50 mM EDTA pH 8,0
50% (v/v) Glyzerin
0,25% (w/v) Bromphenolblau
0,25% (w/v) Xylencyanol
dNTP-Mix 10 mM dATP
10 mM dCTP 10 mM dgTP 10 mM dTTP
LB-Agar LB-Medium
1,5% (w/v) Agar
autoklaviert bei 121°C, 2 bar, 30 min.
Kap. 2 Material und Methoden
LB-Medium 1% (w/v) NaCl
1% (w/v) Trypton
0,5% (w/v) Hefe-Extrakt
autoklaviert bei 121°C, 2 bar, 30 min.
PBS 140 mM NaCl
2,6 mM KCl 2 mM Na2HPO4
1,45 mM KH2PO4
pH 7,2
TAE 40 mM Tris-Acetat
2 mM EDTA, pH 8,2
10xTBE 860 mM Tris-HCl
860 mM Borsäure
20,2 mM EDTA
pH 8,0
TE 10mM Tris-HCl, pH 7,5
1 mM EDTA
2.2 Allgemeine Klonierungstechniken
2.2.1 Herstellung elektrokompetenter Bakterien
Zur Herstellung kompetenter Bakterienzellen dienten die Stämme Escherichia coli RR1M15 (LacZM15) und E. coli JM109 (recA1, LacZM15). Eine 5 ml umfassende Vorkultur wurde über Nacht unter Schütteln bei 37°C inkubiert und dann als Inocculum für 500 ml LB-Medium verwendet. Die Bakterien dieser Kultur wurden unter Schütteln bei 37°C bis zu einer OD600nm von 0,7-0,9 kultiviert und anschließend nach 30 min. Inkubation auf Eis sedimentiert (10 min., 5000xg, 4°C). Das entstandene Bakterien-Pellet wurde zweimal in 400 ml eiskaltem Reinstwasser resuspendiert und erneut wie oben beschrieben zentrifugiert. Die Bakterien wurden nach der Zentrifugation in 400 ml bzw. in 200 ml der 10%
Glyzerinlösung aufgenommen. Im Anschluss an die letzte Zentrifugation (wie
Kap. 2 Material und Methoden
bereits oben beschrieben) wurden die Bakterien-Pellets in 50 µl Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.
2.2.2 Transformation von Plasmiden in Escherichia coli
Zur Transformation wurden die bei -80°C gelagerten kompetenten Bakterien zügig aufgetaut und zusammen mit der Plasmid-DNA (20-100 ng) in einer Gene Pulser Küvette (Fa. Bio-Rad) im Bio-Rad Micro Pulser elektroporiert. Nach der Zugabe von 0,5 ml LB-Medium wurden die Zellen für 15 min. bei 37°C inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Bakterienzellen auf ampizillinhaltigen Selektivnährböden [1,5% (w/v) Bacto-Agar (Fa. Applichem) in LB-Medium, 50 µg/ml Ampizillin, 80 µg/ml X-Gal (Fa. Applichem), 0,2 mM IPTG (Fa. Applichem)]
ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Zugabe von X-Gal und IPTG zu den Selektivnährböden ermöglichte bei Plasmiden, die einen Teil des LacZ-Gens tragen, eine erste Differenzierung zwischen den gewachsenen Bakterienkolonien. Die herangewachsenen Bakterienkolonien transformierter Zellklone wurde für das Animpfen von Flüssigkulturen verwendet.
2.2.3 Präparation von Plasmid-DNA
Die Isolation von Plasmiden im kleinen Maßstab diente vor allem zur Kontrolle der erfolgreichen Insertion der DNA-Fragmente in den verwendeten Vektor (analytische Plasmidisolation), gleichzeitig diente diese analytische Präparation als Inocculum zur Isolierung von größeren Plasmid-Mengen (präparative Plasmidisolation). Die verwendeten Methoden stellen Modifikationen der alkalischen Lyse-Methode von Birnboim, H. C. und Doly, J. (Birnboim HC, 1979) dar.
2.2.3.1 Plasmidisolation ("Miniprep")
Resuspensionspuffer 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 10mM EDTA
100 µg RnaseA/ml
Lysierungspuffer 0,2 M NaOH 1% (w/v) SDS
Neutralisierungspuffer 3 M Kaliumacetat, pH 5,5
Kap. 2 Material und Methoden
Jeweils 2 ml Selektionsmedium (LB-Medium mit 50 µg/ml Ampizillin) wurden mit Teilen einer Bakterienkolonie angeimpft und für minimal fünf Stunden maximal über Nacht unter Schütteln bei 37°C inkubiert. 1,5 ml dieser Kulturen wurden abgenommen, sedimentiert (1 min., 13000xg). Das Bakterienpellet wurde in 200 µl kaltem Resuspensionspuffer vollständig resuspendiert. Durch Zugabe von 200 µl Lysierungspuffer wurden die Zellwände aufgebrochen und die zuvor trübe Lösung erschien nach 2-5 min. bei Raumtemperatur klar. Zur Abtrennung der Plasmide von der chromosomalen DNA und den Proteinen wurde die Lösung durch Zugabe von 200 µl kaltem Neutralisierungspuffer neutralisiert. Nach 5-minütiger Inkubation auf Eis wurden die voluminösen Niederschläge pelletiert (10 min., 13000xg) und die klaren plasmidhaltigen Überstände in neue Gefäße überführt. Zur Präzipitation der Nukleinsäuren wurden 450 µl Isopropanol zugegeben und erneut wie zuvor zentrifugiert. Das Nukleinsäure-Pellet wurde mit 500 µl 70% Äthanol gewaschen, erneut zentrifugiert (2 min., 13000xg), der Überstand vollständig abgesaugt und das kurz an der Luft getrocknete Pellet in 50 µl TE aufgenommen. Die Ausbeute an Plasmid-DNA betrug je nach Kulturdauer etwa 1-10 µg.
Alternativ zu diesem Protokoll wurde für die Präparation von Plasmiden zur Sequenzierung sowie zur DNA-Mikroinjektion das System NucleoSpin Plasmid (Fa. Macherey-Nagel) nach Angaben des Herstellers verwendet. Auch bei diesem Verfahren wurden 1-10 µg DNA gewonnen.
2.2.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Die Messungen wurden in einem Spektralphotometer (Eppendorff) mit verdünnten Nukleinsäurelösungen [1:100 (v/v)] in Quarzglasküvetten durchgeführt.
2.2.5 Enzymatische Modifizierung von DNA
Die Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen, Dephosphorylierung mit alkalischer Phosphatase und Ligationen wurden mit Enzymen der Firmen Boehringer Mannheim und New England Biolabs nach Herstellerangaben durchgeführt.
Kap. 2 Material und Methoden
2.2.6 Klonierungstechniken
2.2.6.1 Sequenzspezifische Spaltung von DNA
Die sequenzspezifische Spaltung doppelsträngiger DNA erfolgte mit Hilfe verschiedener Restriktionsendonukleasen. Für die Spaltung von DNA-Mengen von 1 bis 5 µg wurde eine Enzymaktivität von 5-10 U im 20-µl-Reaktionsansatz eingesetzt und eine Stunde bei entsprechender Temperatur inkubiert.
Handelte es sich um eine analytische Spaltung, wurde ein Aliquot des Reaktionsansatzes gelelektrophoretisch aufgetrennt. Bei einer präparativen Spaltung der DNA wurden die Restriktionsenzyme zunächst inaktiviert (10 min., 65°C) und die Spaltungsprodukte anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt.
2.2.6.2 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten
Die Auftrennung von DNA-Fragmenten für analytische oder präparative Zwecke erfolgte durch Agarosegelelektrophorese (Sambrook et al., 1989). Als Gel- sowie als Laufpuffer diente das TAE-Puffersystem. In Abhängigkeit von der Länge der aufzutrennenden DNA-Fragmente wurden Agarosegele mit einem Anteil von 0,8 - 2 % (w/v) Agarose verwendet. Der aufgekochten Agaroselösung (Fa. Gibco) wurden 0,4 µg/ml Ethidiumbromid zugegeben. Zur Beladung des Agarosegels wurden die Proben mit Auftragspuffer (50% Glyzerin, 1x TAE, 0.2% Orange G) im Verhältnis 1:5 vermischt.
Als DNA-Längenstandards wurden verwendet :
1kb-DNA-Leiter : 12216; 11198; 10180; 9162; 8144; 7126; 6108; 5090; 4072;
3054; 2036; 1636; 1018; 506,517; 396; 344; 298; 220; 201;
154; 134; 75 bp (Fa. Invitrogen)
λ-Hind III-EcoRI: 21226; 5148; 4973; 3530; 2027; 1904; 1584; 1375; 947; 831;
564 bp (eigene Herstellung)
Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei Raumtemperatur und einer konstant gehaltenen Spannung von 5 Volt/cm bei Raumtemperatur. Im Anschluss an die Auftrennung der DNA-Fragmente wurden diese auf einem UV-Tisch (254 nm) im Durchlicht fotografiert.
Kap. 2 Material und Methoden
2.2.6.3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Die Bereiche des Agarosegels, die zu isolierende Fragmente enthielten, wurden mit einer Skalpellklinge über dem Blaulicht-Tisch mit Hilfe einer roten Brille möglichst exakt ausgeschnitten. Zur Isolierung von DNA-Fragmenten bis 6 kb wurde der Qiaquick-Kit (Fa. Qiagen) oder das System NucleoSpin Extract (Fa.
Macherey-Nagel) nach Angaben des Herstellers verwendet. Die Fragmente wurden in TE oder H2O aufgenommen, ein Aliquot des Eluats wurde durch Agarose-Gelelektrophorese überprüft.
2.2.6.4 Umwandlung von überhängenden Enden in glatte Enden
Für einige Klonierungsansätze war es notwendig, die durch einen Restriktionsansatz erzeugten überhängenden kohäsiven Enden der DNA- Fragmente oder Vektoren in glatte Enden umzuwandeln.
Nach der Inkubation eines Restriktionsansatzes (20 µl Gesamtvolumen) wurden 1µl dNTP-Mix (0,5 mM) und 1 µl Klenow-Fragment (5 U, Boehringer Mannheim) zugegeben und für 20 min. bei 37°C inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurde das Enzym inaktiviert (10 min., 75°C) und die DNA durch Äthanol-Fällung aufgereinigt.
2.2.6.5 Aufreinigung von DNA durch Äthanol-Fällung
Zu der Plasmidlösung wurden 1 Volumen ddH2O, 0,1 Volumen 3M Natriumacetat (pH 5,2) und 3 Volumen Äthanol zugegeben, gut durchmischt und 30 min. bei - 80°C inkubiert. Anschließend wurde die DNA durch Zentrifugation (10 min., 13000xg) pelletiert. Abschließend wurde mit 250 µl kaltem Äthanol (70%) gewaschen, kurz zentrifugiert, der Überstand vollständig abgesaugt und das an der Luft getrocknete Zentrifugat in TE oder Wasser aufgenommen.
2.2.6.6 Dephosphorylierung von DNA
Die Klonierungsvektoren wurden nach vorangegangener sequenzspezifischer Spaltung und eventuell auch nach der Umwandlung der kohäsiven Enden in glatte Enden, dephosphoryliert. Den Herstellerangaben entsprechend wurde der Vektorlösung der Reaktionspuffer und eine Enzymaktivität von 1 U "Shrimp
Kap. 2 Material und Methoden
alkaline Phosphatase" (Fa. Roche) zugesetzt und für 30 min. auf 37°C erwärmt.
Anschließend wurde das Enzym Hitze (10 min., 75°C) inaktiviert und die DNA durch Äthanolfällung aufgereinigt.
2.2.6.7 Ligation von DNA-Fragmenten
Die Klonierungen erfolgten in Vektoren basierend auf den Plasmiden Litmus28 und pBluescript. Üblicherweise wurden die Vektor- und Insert-DNA in einem molaren Verhältnis von 1:3 eingesetzt und mit 5 U T4-Ligase (Boehringer Mannheim) und dem entsprechenden Reaktionspuffer inkubiert (12-16 Stunden, 16°C). Die neu verbundene DNA wurde nach Hitzeinaktivierung des Enzyms (10 min., 75°C) durch Äthanolfällung gefällt und anschließend durch Elektroporation in Escherichia coli transformiert.
2.2.6.8 DNA-Sequenzierung
Die klonierten Plasmide wurden zur Kontrolle sequenziert (Firma MWG Biotech).
Die so erhaltene DNA-Sequenz wurde mit Hilfe des Computerprogramms
"MacVectorTM6.5.3" auf Korrektheit überprüft.
2.3 Polymerasekettenreaktion (PCR)
2.3.1 Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide ("Primer")
2.3.1.1 Primer für msd
Amsd1f AAGTCCCAACAGAGAGCAGC Bmsd1f GCAAGCTTAGGGACTGTTTTTGCCAC
Dmsd1f GCAAGCTTCGGGATTCTAATGAAGCTGC Dmsd1r GCGTCGACGGTTTTTACACATCCATCAG Emsd1f GCAAGCTTCAGCAACACCTACAGTGAGG Emsd1r-u GGAGTGACATCCACAACGAC
Fmsd1r GCGTCGACCAGGACACACGTATCACAA hsp-r TTCGCTTGTCTCTGGATGG
Imsd1r GCGTCGACGCACCTAGCTTTGTGTTGAGC Lmsd1r GCAAGCTTGTGATACGTGTGTCCTGG Nmsd1r GCGTCGACGCAGCTTCATTAGAATCCCG O4msd1r GCGTCGACCTCACTGTAGGTGTTGCTG
Kap. 2 Material und Methoden
O5msd1r GCGTCGACGCACAGAAAGAGAGGAAAAC O6msd1r GCGTCGACGCTCCTTTTCTGATGACC O7msd1r GCGTCGACAAGGCTGAGGTGAGAAA O8msd1r CCAAAAAGCCATGTGTATA
P7msd1f GCAAGCTTTCTCACCTCAGCCTTG Qmsd1f GCAAGCTTGGTCATCAGAAAAGGAGC Rmsd1f GCAAGCTTGTTTTCCTCTCTTTCTGTGC
2.3.1.2 Primer für msdII
Amsd2f AAGCTTAGCTTTTGGCTC Amsd2r AACACTAGCCGCCTAGGCT
Bmsd2f GCAAGCTTGAGAGCCTAGGCGGCTAGTG Bmsd2r GGCCGCTCGCATAACTAATG
Cmsd2f CTTGCCACCCTTTGCCCACCTCT Cmsd2r TTTCGCCTCCCTCCCCCAGC
Dmsd2r CCAGACACCGCAGTGTCC Emsd2f GGACACTGCGGTGTCTGG Emsd2r AGAGGTGGGCAAAGGGTGG
Fmsd2r CCCTCCTCCCTGGCAGCCTC Gmsd2f GAGGCTGCCAGGGAGGAG Hmsd2r ACCGCCACAGGCCCGAA Imsd2f CTTCGGGCCTGTGGCGGT Kmsd2f GAGCGGGTTTTGCGCTG Kmsd2r GGATCGCCAAATGGTCAG Lmsd2f CTGACCATTTGGCGATCC
2.3.1.3 Primer für Oct1
Oct1BIG-F TGAAACACTCTGTCCAGC Oct1BIG-R GGAAACTAGAACTACTCAAGC
2.3.2 Pufferlösungen
dNTP-Mix 10 mM dATP
10 mM dCTP
10 mM dgTP
10 mM dTTP
Kap. 2 Material und Methoden
1xLysispuffer 50 mM KCl
10 mM Tris-HCl, pH 8,3
2 mM MgCl2
0,45% Tween 20
0,45% NP 40
10xPCR-Puffer 166 mM (NH4)2SO4 670 mM Tris-HCl, pH 8,8
1 mg/ml BSA fraction V
2.3.3 Standard-PCR
PCR-Reaktionen wurden in Thermocyclern Typ Primus und Primus 96 plus (Fa.
MWG-Biotech) durchgeführt. Für die Standard-PCR wurde das Enzym Taq- Polymerase aus einer eigenen Präparation des Instituts verwendet. Für die Amplifizierung von Fragmenten zur Erstellung von Reportergenkonstrukten wurde das Enzym Pwo DNA Polymerase (Fa. Roche) eingesetzt. Der 40-µl- Standardansatz enthielt 1 µl Polymerase, 4 µl 10x-PCR-Puffer, 1 µl dNTP-Mix, 10- 50 pMol der DNA-Vorlage (Template) und je 10-50 pMol der spezifischen Starter- Oligonukleotide (Primer). Die Reaktionsbedingungen der Primer für die in der Arbeit erwähnten PCR-Reaktionen sind im folgenden aufgeführt.
PCR-Bedingungen für die Analyse der Dottersack-DNA der transgenen Embryonen:
Plasmid Primer 1 Primer 2 Fragmentlänge Reaktionsbedingungen pmsdA/hsp/lacZpA Amsd1f hsp-r 350 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 52°C, 30 sec.
72°C), 7 min. 72°C
pmsdB/hsp/lacZpA Dmsd1f hsp-r 440 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 52°C, 30 sec.
72°C), 7 min. 72°C
Kap. 2 Material und Methoden
pmsdC/hsp/lacZpA Emsd1f hsp-r 400 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 52°C, 30 sec.
72°C), 7 min. 72°C
PCR-Bedingungen zur Klonierung der Reportergenkonstrukte pmsdE/hsp/lacZpA und pmsdF/hsp/lacZ/pA sowie für die Analyse der Dottersack-DNA der transgenen Embryonen:
Plasmid Primer 1 Primer 2 Fragmentlänge Reaktionsbedingungen pmsdE/hsp/lacZpA Emsd1f Dmsd1r 350 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 52°C, 30 sec.
72°C), 7 min. 72°C
pmsdF/hsp/lacZpA Emsd1f Fmsd1r 280 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 52°C, 30 sec.
72°C), 7 min. 72°C
PCR-Bedingungen zur Erstellung der Oct1-Fragmente zur Untersuchung der Protein-DNA-Interaktionen:
Fragment Primer 1 Primer 2 Fragmentlänge Reaktionsbedingungen Oct1BIG Oct1BIG-F Oct1BIG-R 350 bp 5 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 48°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
PCR-Bedingungen zur Erstellung der msd-Subfragmente für die Untersuchung der Protein-DNA-Interaktionen:
Fragment Primer 1 Primer 2 Fragmentlänge Reaktionsbedingungen msd1-1 Bmsd1f O6msd1r 287 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 49°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
msd1-2 Qmsd1f Nmsd1r 316 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 41°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
Kap. 2 Material und Methoden
msd1-3 Dmsd1f Dmsd1r 281 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 49°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
msd1-O7 Bmsd1f O7msd1r 133 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 46°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
msd1-P7 Pmsd1f 06msd1r 171 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 49°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
msd1-Q6 Qmsd1f 05msd1r 128 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 46°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
msd1-R5 Rmsd1f 04msd1r 120 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 49°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
msd1-N Emsd1f Nmsd1r 108 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 49°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
msd1-I Dmsd1f Imsd1r 104 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 49°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
msd1-K Hmsd1f Fmsd1r 112 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 49°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
msd1-L Lmsd1f Dmsd1r 109 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 46°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
PCR-Bedingungen zur Erstellung der msdII-Subfragmente für die Untersuchung der Protein-DNA-Interaktionen:
Fragment Primer 1 Primer 2 Fragmentlänge Reaktionsbedingungen
Kap. 2 Material und Methoden
msd2-D Amsd2f Dmsd2r 118 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 51°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
msd2-E Emsd2f Emsd2r 156 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 56°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
msd2-F Cmsd2f Fmsd2r 107 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 57°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
msd2-G Gmsd2f Amsd2r 109 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 54°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
msd2-H Bmsd2f Hmsd2r 130 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 57°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
msd2-I Imsd2f Cmsd2r 133 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 57°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
msd2-K Kmsd2f Lmsd2r 130 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 55°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
msd2-L Lmsd2f Bmsd2r 113 bp 3 min. 94°C, 30 x (30 sec.
94°C, 30 sec. 51°C, 45 sec.
72°C), 7 min. 72°C
2.4 Tierexperimentelle Methoden
2.4.1 Tierhaltung
Die Tierhaltung erfolgte unter standardisierten Bedingungen im Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover.
Kap. 2 Material und Methoden
2.4.2 Herstellung von transgenen Mäusen
Die transgenen Embryonen wurden durch die DNA-Mikroinjektion in den Pronukleus einer befruchteten Eizelle hergestellt (Gordon and Ruddle, 1980;
Hogan et al., 1986).
Die entsprechenden DNA-Fragmente wurden aus den zuvor klonierten Plasmiden isoliert, aufgereinigt und per Mikroinjektion in den männlichen oder weiblichen Vorkern der vorbereiteten befruchteten Eizelle injiziert. Anschließend wurden diese Zygoten in den Ovidukt scheinschwangerer Ammentiere transferiert. Pro Rezipient konnten ca. 30 Eier transferiert werden, von denen ca. 1 bis 20 als Embryonen am Tag 9.5 p. c. (8.5 Tage nach dem Transfer) geerntet werden konnten. Die Mikroinjektion und der Ovidukttransfer wurden von Karin Schuster- Gossler durchgeführt.
2.4.3 Präparation der transgenen Mausembryonen
Am Tag 9.5 nach der Befruchtung der Eizellen wurden die Empfängertiere per Genickbruch getötet und die Embryonen den Uteri in einer Vorlage aus PBS entnommen. Die Embryonen wurden weitestgehend von den Eihäuten befreit.
2.4.4 Nachweis der LacZ-Expression
2.4.4.1 Pufferlösungen:
SSP 77,4 ml 1M Na2HPO4
22,6 ml 1M NaH2PO4
auf 1000 ml H2O
pH 7,4
Fixierlösung 20 µM MgCl2
0,4% Glutardialdehyd 50 µM EGTA pH 7,5
in SSP
Waschlösung 0,2 mM MgCl2
0,01% Natriumdesoxycholat
0,02% NP-40
Kap. 2 Material und Methoden
in SSP
Färbelösung 1mg/ml X-gal 5 mM K3[Fe(CN)6] 5 mM K4[Fe2(CN)6]
in Waschlösung
2.4.4.2 ββββ-Galaktosidase-Färbung von Embryonen
Zur Detektion der durch das jeweilige Promotorelement-hsp70-LacZ-Allel hervorgerufenen β-Galaktosidaseaktivität wurden Embryonen zunächst 5 min. in Fixierungslösung inkubiert. Nach zweimaligem jeweils 10-minütigem Waschen in der Waschlösung erfolgte die Färbung für 12-20 Stunden bei 37°C in Färbelösung. Nach der Färbung wurden die Embryonen erneut zweimal jeweils 30 min. lang in der Waschlösung geschwenkt und anschließend in der Waschlösung bei 4°C gelagert. Die Phänotypen der transgenen Mausembryonen wurden mit einer Leica-Kamera dokumentiert.
2.4.4.3 Genotypisierung der transgenen Embryonen
Die bei der Ernte der Embryonen präparierten Dottersäcke wurden in 750 µl Lysepuffer aufgenommen, 35 µl Proteinase K (10 mg/ml) zugegeben und über Nacht bei 55°C inkubiert. Nach Zugabe von 250 µl gesättigter NaCl-Lösung wurde 5' geschüttelt und anschließend abzentrifugiert (10 min., 13000xg). 750 µl des Überstands wurden abgenommen, die DNA mit 500 µl Isopropanol gefällt und wie oben beschrieben sedimentiert. Das Sediment wurde mit 500 µl 70% Äthanol gewaschen und in 500 µl TE resuspendiert. Für PCR-Analysen wurde 1 µl der präparierten DNA verwendet.
2.5 Untersuchungen von Protein-DNA-Wechselwirkungen
2.5.1 Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Analyse
Zum Nachweis von Protein-DNA-Interaktionen zwischen murinen embryonalen Proteinen wurden „Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Analysen“ (EMSA) durchgeführt. Dazu wurden die Proteine mit radioaktiv markierter,
Kap. 2 Material und Methoden
doppelsträngiger DNA bekannter Sequenz inkubiert, in einem nativen Polyakrylamidgel aufgetrennt und per Autoradiografie visualisiert.
Folgende Oligodesoxyribonukleotide (Oligonukleotide) wurden als Sonde verwendet:
B01-f AGG GAC TGT TTT TGC CAC GGC CAT GGG GGT GTG CCT TAG GGG TGT CAG TA (50 bp) B01-r TAC TGA CAC CCC TAA GGC ACA CCC CCA TGG CCG TGG CAA AAA CAG TCC CT (50 bp) B02-f TCT TTT GAA GCC TCC ATT TGT TCT ATA ATA AAC AGG TTT TTT AAA AAG TG (50 bp) B02-r CAC TTT TTA AAA AAC CTG TTT ATT ATA GAA CAA ATG GAG GCT TCA AAA GA (50 bp) B03-f GGA TCT AAC CCT GCC TTT CTC ACC TCA GCC TTG AGT ATT ATA CAC ATG GC (50 bp) B03-r GCC ATG TGT ATA ATA CTC AAG GCT GAG GTG AGA AAG GCA GGG TTA GAT CC (50 bp) B04-f TTT TTG GTT AAC TCT TTG ATT GTC TGT GAG TTG GCG ATG ACG ACG TGA AG (50 bp) B04-r CTT CAC GTC GTC ATC GCC AAC TCA CAG ACA ATC AAA GAG TTA ACC AAA AA (50 bp) B05-f TGC AGA AAT TCC TGT TGA TTC TGA AAC TTT GAA AGT GTT TGG GAG ACA GG (50 bp) B05-r CCT GTC TCC CAA ACA CTT TCA AAG TTT CAG AAT CAA CAG GAA TTT CTG CA (50 bp) B06-f GTA GCA GTA GGC AGG CTG GGT CAT CAG AAA AGG AGC TGT AAT TTC AGT TG (50 bp) B06-r CAA CTG AAA TTA CAG CTC CTT TTC TGA TGA CCC AGC CTG CCT ACT GCT AC (50 bp) B07-f CCA GAT GGC CCA ACA CAG ATG ATT CTG CCC AGT AAC TGC TAG ATT CTT GT (50 bp) B07-r ACA AGA ATC TAG CAG TTA CTG GGC AGA ATC ATC TGT GTT GGG CCA TCT GG (50 bp) B08-f TAG CAG TGT TTC TCT GGG CAT GCG AAG TTT TCC TCT CTT TCT GTG CAT TA (50 bp) B08-r TAA TGC ACA GAA AGA GAG GAA AAC TTC GCA TGC CCA GAG AAA CAC TGC TA (50 bp) B09-f TAT ACA TCT TGC TCC AGA TAC TGG CCT AAA TGA TCA AGC TAC TCT GCC AG (50 bp) B09-r CTG GCA GAG TAG CTT GAT CAT TTA GGC CAG TAT CTG GAG CAA GAT GTA TA (50 bp) B10-f GAC AGG GCT CAT TCT CAC CAA CAG GAC AGC AAC ACC TAC AGT GAG GAC AC (50 bp) B10-r GTG TCC TCA CTG TAG GTG TTG CTG TCC TGT TGG TGA GAA TGA GCC CTG TC (50 bp) B11-f CTG TCA GGT ACA CCC TAG GGG CTG TGC TAC AAT CAA AGG AAC ACT AGC TC (50 bp) B11-r GAG CTA GTG TTC CTT TGA TTG TAG CAC AGC CCC TAG GGT GTA CCT GAC AG (50 bp) B12-f CAA GAA TCA CAC CTC GGG ATT CTA ATG AAG CTG CCT AGG TGG TGG GGG TG (50 bp) B12-r CAC CCC CAC CAC CTA GGC AGC TTC ATT AGA ATC CCG AGG TGT GAT TCT TG (50 bp) B13-f GAG TAA AGA GGC CCC TCT AAA GAT GGG AAT ATA CAG CTC ATG GCA TGC TC (50 bp) B13-r GAG CAT GCC ATG AGC TGT ATA TTC CCA TCT TTA GAG GGG CCT CTT TAC TC (50 bp) B14-f AAC ACA AAG CTA GGT GCT AAG TCA GAG ACT ATA TCT CCA TTT ACT TTT CT (50 bp) B14-r AGA AAA GTA AAT GGA GAT ATA GTC TCT GAC TTA GCA CCT AGC TTT GTG TT (50 bp) B15-f CTG GAG CTT GTA ACC AGG GGA GCC GTT TAG GTA ATT CAT TGT GAT ACG TG (50 bp) B15-r CAC GTA TCA CAA TGA ATT ACC TAA ACG GCT CCC CTG GTT ACA AGC TCC AG (50 bp) B16-f TGT CCT GGG CCC TCC CAA TAA ACT CAT TTC CCT TAA AAA AAA AAA AAA GA (50 bp)
Kap. 2 Material und Methoden
B16-r TCT TTT TTT TTT TTT TAA GGG AAA TGA GTT TAT TGG GAG GGC CCA GGA CA (50 bp) B17-f AAA AAA AGA AAA CAA AGT TCT AGT GTC TGA TGG ATG TGT AAA AAC CTA A (49 bp) B17-r TTA GGT TTT TAC ACA TCC ATC AGA CAC TAG AAC TTT GTT TTC TTT TTT T (49 bp) B18-f GGG GTG TGC CTT AGG GGT GTC AGT ATC TTT TGA AGC CTC CAT TTG TTC TA (50 bp) B18-r TAG AAC AAA TGG AGG CTT CAA AAG ATA CTG ACA CCC CTA AGG CAC ACC CC (50 bp) B19-f TAA TAA ACA GGT TTT TTA AAA AGT GGG ATC TAA CCC TGC CTT TCT CAC CT (50 bp) B19-r AGG TGA GAA AGG CAG GGT TAG ATC CCA CTT TTT AAA AAA CCT GTT TAT TA (50 bp) B20-f CAG CCT TGA GTA TTA TAC ACA TGG CTT TTT GGT TAA CTC TTT GAT TGT CT (50 bp) B20-r AGA CAA TCA AAG AGT TAA CCA AAA AGC CAT GTG TAT AAT ACT CAA GGC TG (50 bp) B21-f GTG AGT TGG CGA TGA CGA CGT GAA GTG CAG AAA TTC CTG TTG ATT CTG AA (50 bp) B21-r TTC AGA ATC AAC AGG AAT TTC TGC ACT TCA CGT CGT CAT CGC CAA CTC AC (50 bp) B22-f ACT TTG AAA GTG TTT GGG AGA CAG GGT AGC AGT AGG CAG GCT GGG TCA TC (50 bp) B22-r GAT GAC CCA GCC TGC CTA CTG CTA CCC TGT CTC CCA AAC ACT TTC AAA GT (50 bp) B23-f AGA AAA GGA GCT GTA ATT TCA GTT GCC AGA TGG CCC AAC ACA GAT GAT TC (50 bp) B23-r GAA TCA TCT GTG TTG GGC CAT CTG GCA ACT GAA ATT ACA GCT CCT TTT CT (50 bp) B24-f TGC CCA GTA ACT GCT AGA TTC TTG TTA GCA GTG TTT CTC TGG GCA TGC GA (50 bp) B24-r TCG CAT GCC CAG AGA AAC ACT GCT AAC AAG AAT CTA GCA GTT ACT GGG CA (50 bp) B25-f AGT TTT CCT CTC TTT CTG TGC ATT ATA TAC ATC TTG CTC CAG ATA CTG GC (50 bp) B25-r GCC AGT ATC TGG AGC AAG ATG TAT ATA ATG CAC AGA AAG AGA GGA AAA CT (50 bp) B26-f CTA AAT GAT CAA GCT ACT CTG CCA GGA CAG GGC TCA TTC TCA CCA ACA GG (50 bp) B26-r CCT GTT GGT GAG AAT GAG CCC TGT CCT GGC AGA GTA GCT TGA TCA TTT AG (50 bp) B27-f ACA GCA ACA CCT ACA GTG AGG ACA CCT GTC AGG TAC ACC CTA GGG GCT GT (50 bp) B27-r ACA GCC CCT AGG GTG TAC CTG ACA GGT GTC CTC ACT GTA GGT GTT GCT GT (50 bp) B28-f GCT ACA ATC AAA GGA ACA CTA GCT CCA AGA ATC ACA CCT CGG GAT TCT AA (50 bp) B28-r TTA GAA TCC CGA GGT GTG ATT CTT GGA GCT AGT GTT CCT TTG ATT GTA GC (50 bp) B29-f TGA AGC TGC CTA GGT GGT GGG GGT GGA GTA AAG AGG CCC CTC TAA AGA TG (50 bp) B29-r CAT CTT TAG AGG GGC CTC TTT ACT CCA CCC CCA CCA CCT AGG CAG CTT CA (50 bp) B30-f GGA ATA TAC AGC TCA TGG CAT GCT CAA CAC AAA GCT AGG TGC TAA GTC AG (50 bp) B30-r CTG ACT TAG CAC CTA GCT TTG TGT TGA GCA TGC CAT GAG CTG TAT ATT CC (50 bp) B31-f AGA CTA TAT CTC CAT TTA CTT TTC TCT GGA GCT TGT AAC CAG GGG AGC CG (50 bp) B31-r CGG CTC CCC TGG TTA CAA GCT CCA GAG AAA AGT AAA TGG AGA TAT AGT CT (50 bp) B32-f TTT AGG TAA TTC ATT GTG ATA CGT GTG TCC TGG GCC CTC CCA ATA AAC TC (50 bp) B32-r GAG TTT ATT GGG AGG GCC CAG GAC ACA CGT ATC ACA ATG AAT TAC CTA AA (50 bp) B33-f ATT TCC CTT AAA AAA AAA AAA AAG AAA AAA AAG AAA ACA AAG TTC TAG T (49 bp) B33-r ACT AGA ACT TTG TTT TCT TTT TTT TCT TTT TTT TTT TTT TAA GGG AAA T (49 bp)
