3 Material und Methoden
3.6 Auftauen der Proben und Untersuchung der Proben nach dem Auftauen . 55
3.6.2.1 Untersuchung des akrosomalen Status und der
Für diese Untersuchung wurden die Proben mit Tyrode-Medium (s. Anhang) auf eine Endkonzentration von 5x106 Spermien pro ml verdünnt. 500 µl der so verdünnten Spermiensuspension wurden dann zur durchflusszytometrischen Analyse mit drei Farbstoffen markiert.
Zur Bestimmung des akrosomalen Status wurde der Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) verwendet, der an das Lektin von Arachis hypogenea (Peanut agglutinin, PNA) gekoppelt ist. FITC-PNA bindet selektiv an die äußere Akrosommembran und emittiert nach Laseranregung grünes Licht. Anhand der Grünfluoreszenz markierter Zellen ist eine Unterscheidung zwischen Spermien mit intakter Akrosommembran und Spermien mit beschädigter Akrosommembran möglich. Zu den Proben wurden je 5 µl FITC-PNA (100 µg/ml aq.dest.) von Sigma Aldrich Chemie GmbH (Katalog-Nr.:L-7381) zugefügt. Spermien mit beschädigter Aksosommembran werden nachfolgend als akrosomgefärbt bezeichnet.
Die Farbstoffe SYTO® 17 (Fa. MoBitec GmbH, Göttingen, S-7579 0,5 mM) und PI (Propidiumiodid, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, P-4170, 2,99 mM) dienen der Unterscheidung von vitalen Spermien mit intakter Plasmamembran und nicht vitalen Spermien mit geschädigter Plasmamembran anhand der Intensität der Rotfluoreszenz der Zellen. SYTO® 17 durchdringt auch intakte Plasmamembranen, bindet an die DNA und fluoresziert nach Laseranregung im orangefarbenen Bereich.
PI hingegen kann nur geschädigte Plasmamembranen durchdringen. Ist dies der Fall, wird SYTO® 17 verdrängt und PI bindet an den Kern der Zelle. Nach Laseranregung fluoresziert PI im roten Bereich.
Den Proben wurden je 3 µl PI und 2 µl SYTO® 17 zugesetzt.
Nach Färbung der Proben wurden diese in einem abgedunkelten Raum für 15 Minuten bei 37°C in einem Wärmebad (Thermostat, Ty p 5320, Fa. Eppendorf) inkubiert, bevor die Messung am Durchflusszytometer erfolgte.
Für die Grünfluoreszenz wurde der Filter FL-1 eingesetzt, für die Fluoreszenz im roten Bereich kam der Filter FL-3 zum Tragen.
Eine hohe Fluoreszenz im roten Bereich spricht für mit PI angefärbte Zellen, eine niedrige Rotfluoreszenz spricht für eine Anfärbung der Zellen mit SYTO® 17.
Anhand der vorgenommenen Färbungen lassen sich vier Spermienpopulationen unterscheiden:
Vitale Spermien, bei denen die intakte Plasmamembran über der äußeren Akrosommembran verläuft, sind weder für PI noch für FITC-PNA permeabel.
Lediglich SYTO® 17 ist in der Lage, die intakte Plasmamembran zu durchdringen, so dass die Population der lebenden, akrosomintakten Spermien durch eine Orangefluoreszenz gekennzeichnet ist.
Bei vitalen Spermien mit erfolgter Akrosomreaktion bindet FITC-PNA an die äußere Akrosommembran, so dass sie sich durch eine Orange- und Grünfluoreszenz auszeichnen.
Spermien mit geschädigter Plasmamembran, an deren Kern bereits PI gebunden ist, die jedoch noch Reste der äußeren Akrosommembran besitzen, emittierten Licht
Die vierte Population besteht aus Spermien mit geschädigter Plasmamembran und einer vollständig degenerierten oder verloren gegangenen Akrosommembran.
Diese Spermien werden lediglich durch PI gefärbt und zeigen daher eine ausschließliche Fluoreszenz im Rotbereich.
3.6.2.2 Untersuchung der DNA-Integrität
Der Sperm Chromatin Structure Assay (SCSATM) ist ein Verfahren zur Analyse der Spermienchromatinstruktur und dient damit der Bestimmung der DNA-Integrität.
Untersucht wurden sowohl die schockgefrorenen Nativ-Proben als auch die in Pailletten kryokonservierten verdünnten Proben. Dabei erfolgte die Probenaufbereitung und Messung nach den Angaben von EVENSON und JOST (2000). Zu Beginn einer jeder Messreihe wurde das Gerät nach festgelegten Angaben eingestellt und die Einstellung nach jeder zehnten Probe anhand der Messung einer Referenzprobe überprüft. Für die Messung der Grünfluoreszenz stand der Filter FL-1 zur Verfügung, für die der Rotfluoreszenz wurde der Filter FL-3 herangezogen.
Für die computergestützte Bestimmung der Messdaten wurde die in die Auswertung eingehende Spermienpopulation eingegrenzt. Der Anteil der Rotfluoreszenz an der Gesamtfluoreszenz (rot + grün) wurde für jedes einzelne Spermium ermittelt und mit Hilfe des erwähnten Softwareprograms DAS Version 4.40 (BEISKER 1994) als DNA-Fragmentations-Index (DFI) bewertet. Die ermittelten DFI-Werte einer Probe wurden gemäß ihrer Höhe in einem Verteilungshistogramm dargestellt und so anhand des Histogramms der Mittelwert der DFI-Werte und die Standardabweichung (SD) errechnet.
3.7 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des SPSS-Systems („Statistical Package for the Social Sciences) sowie dem Programm SAS („Statistical Analysis System“, SAS Institute, Iowa, Cary, NC/USA) des Rechenzentrums der Tierärztlichen
Hochschule Hannover. Die Beratung zur statistischen Auswertung der vorliegenden Arbeit erfolgte im Institut für Biometrie und Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover.
Bei Vorliegen von normalverteilten Daten erfolgte eine mehrfaktorielle Varianzanalyse. Im Falle von verbundenen Stichproben wurde ein T-Test für eben solche Proben durchgeführt.
Bei Vorliegen von nicht normalverteilten Daten wurde ein Wilcoxon-Test durchgeführt.
Mit Hilfe von Boxplots werden der Median, sowie Minimum und Maximum der Werte grafisch dargestellt. Kleine Kreise stellen die Aureißer, Sterne die Extremwerte dar.
Den aufgeführten Tabellen sind der Median, die Abweichung vom Median, sowie Minimum und Maximum der Werte zu entnehmen.
4 Ergebnisse 4.1 Vorversuch 1
Im ersten Vorversuch (n = 1 Hengst, m = 3 Ejakulate/Hengst) wurden die aufbereiteten Spermaproben mit vier unterschiedlichen Gehalten an Ethylenglycol (0 %, 2,5 %, 5 %, 10 %) versetzt und dann drei unterschiedlichen Gefriermethoden unterzogen. Die Proben wurden konventionell kryokonserviert, sowie mit Hilfe von Pailletten und mit Hilfe von VitriPlugs vitrifikationsähnlich tiefgefroren. Bei der Vitrifikation der Proben mit Hilfe von VitriPlugs wurden des Weiteren zwei unterschiedliche Mengen der jeweiligen Probe vitrifiziert (5 µl, 10 µl). Zudem kamen drei unterschiedliche Methoden bei der Vitrifikation mit Hilfe von VitriPlugs zum Tragen (s. 3.3.2.3).
4.1.1 Ethylenglycolgehalt
4.1.1.1 Einfluss des Ethylenglycolgehaltes auf die Motilität, die Vitalität und die Akrosomintegrität der Spermatozoen in Vorversuch 1
Abbildung 4.1 zeigt, dass der Median der mittleren Geschwindigkeit bei einem Ethylenglycolgehalt von 0 % bei 88,0 µm/s liegt, während der Median bei höheren Gehalten bei 0,00 µm/s liegt. Ein signifikanter Unterschied ist jedoch statistisch nicht nachweisbar. Gleiches gilt für den Anteil vorwärtsbeweglicher, membranintakter und akrosomgefärbter Spermien, bei denen ebenfalls kein statistisch signifikanter Unterschied dargestellt werden kann.
Abb. 4.1: Einfluss des Ethylenglycolgehaltes auf die Vorwärtsbeweglichkeit, die mittlere Geschwindigkeit, die Vitalität und die Akrosomintegrität der Spermien (Medianwerte, n = 1 Hengst, m = 3 Ejakulate/Hengst)
SYTO positiv membranintakte Spermien nach FITC-PNA/SYTO 17/PI- Färbung (%)
FITC-PNA positiv akrosomgefärbte Spermien (%)
VAP Velocity Average Path, mittlere Geschwindigkeit (µm/s) PMS progressiv motile Spermien (%)
EG Ethylenglycol
a zwischen den Gruppen mit unterschiedlichem Gehalt an Ethylenglycol besteht kein signifikanter Unterschied (p ≤ 0,05)
4.1.2 Gefriermethode
4.1.2.1 Einfluss der Gefriermethode auf die Motilität, die Vitalität und die Akrosomintegrität der Spermatozoen in Vorversuch 1
Aus Abbildung 4.2 ist zu entnehmen, dass in Hinblick auf die Vorwärtsbeweglichkeit der Spermien ein signifikanter Unterschied zwischen der verdünnten Spermaprobe und den übrigen, in jeglicher Form kryokonservierten Proben besteht.
Die mit Hilfe von VitriPlugs kryokonservierten Proben und der Rest der Proben unterscheiden sich in Bezug auf die mittlere Geschwindigkeit (p ≤ 0.05). Bei den mit VitriPlugs vitrifizierten Proben ist keine Geschwindigkeit mehr messbar (0,00 µm/s).
In der verdünnten Spermaprobe sind anteilig signifikant mehr membranintakte Spermien messbar als in den in jeglicher Form kryokonservierten Proben. Innerhalb der Gruppe der kryokonservierten Proben besteht ein signifikanter Unterschied zwischen den konventionell tiefgefrorenen und den mit Hilfe von Pailletten oder VitriPlugs vitrifizierten Proben. In Letzteren sind weniger membranintakte Spermatozoen nachweisbar. Zwischen den beiden Formen von vitrifizierten Proben besteht zwar kein signifikanter Unterschied, dennoch fällt auf, dass bei den mit Hilfe von VitriPlugs vitrifizierten Proben nur noch 0,22 % (= Median) membranintakte Spermien gemessen werden konnten.
Zwischen den frischen und den konventionell tiefgefrorenen Proben sowie den mit Hilfe von Pailletten und mit Hilfe von VitriPlugs kryokonservierten Proben besteht in Bezug auf die Akrosomintegrität ein signifikanter Unterschied. Bei den vitrifizierten Proben liegt der Anteil akrosomgefärbter Spermatozoen bei allen gemessenen Proben bei über 70 % und teilweise bis zu über 90 %, während der Anteil akrosomgefärbter Spermien bei den frischen und konventionell tiefgefrorenen Proben deutlich niedriger ist ( p≤ 0,05).
verd.
konv.TG vitr.Paill.
vitr.plugs
Abb. 4.2: Einfluss der Gefriermethode auf die Vorwärtsbeweglichkeit, die mittlere Geschwindigkeit, die Vitalität und die Akrosomintegrität der Spermien (Medianwerte, n = 1 Hengst, m = 3 Ejakulate/Hengst)
Versuchsgruppen: verd. = verdünnt, konv. TG = konventionelle Tiefgefrierung, vitr. Paill. = vitrifizierten Pailletten, vitr. plugs = vitrifizierte plugs
SYTO positiv membranintakte Spermien nach FITC-PNA/SYTO 17/PI-Färbung (%)
FITC-PNA positiv akrosomgefärbte Spermien (%)
VAP Velocity Average Path, mittlere Geschwindigkeit (µm/s) PMS progressiv motile Spermien (%)
EG Ethylenglycol
a, b, c unterschiedliche Buchstaben verdeutlichen einen signifikanten Unterschied zwischen den unterschiedlichen Gefriermethoden unter Einbezug der flüssigkonservierten Spermaprobe (p ≤ 0,05)
4.1.2.2 Einfluss der verwendeten Tröpfchengröße sowie des angewendeten Einfrierverfahrens mit Hilfe von VitriPlugs auf die Motilität, die Vitalität und die Integrität der Spermatozoen in Vorversuch 1
Sowohl die Verwendung unterschiedlicher Tröpfchengrößen als auch die Anwendung der unterschiedlichen unter 3.3.2.3 beschriebenen Methoden zur Kryokonservierung der Proben haben die Motilität, die Vitalität und die Akrosomintegrität nicht signifikant beeinflussen können. Auf eine grafische Darstellung wird an dieser Stelle verzichtet.
Unabhängig von Volumen und Einfrierverfahren lag der Anteil progressivmotiler Spermien nach Kryokonservierung mithilfe von VitriPlugs bei 0 % ± 0.
Dementsprechend war keine Geschwindigkeit mehr messbar. Der Anteil membranintakter Spermien lag abhängig vom Volumen zwischen 0,19 und 0,27 % und abhängig vom Einfrierverfahren zwischen 0,2 und 0,7 %. Der Anteil akrosomgefärbter Spermien lag abhängig vom Volumen zwischen 81,8 und 83,2 % und abhängig vom Einfrierverfahren zwischen 70,7 und 88,0 %.
4.1.3 Bedeutung der in Vorversuch 1 erzielten Ergebnisse für den Versuchsaufbau im Hauptversuch
Ausgehend von den im Vorversuch 1 erzielten Ergebnissen erscheint im Weiteren ein Vergleich von Proben, die unter Verwendung von 2,5 % eines Kryoprotektivums tiefgefroren wurden, und Proben, die ohne Verwendung von Kryoprotektiva kryokonserviert wurden, sinnvoll.
Die Verwendung von VitriPlugs als Methode zur Vitrifikation von Hengstspermatozoen hat zu keinem befriedigenden Ergebnis geführt und wird im Hauptversuch vernachlässigt.
4.2 Vorversuch 2
Im zweiten Vorversuch (n = 1 Hengst, m = 3 Ejakulate/Hengst) wurden verschiedene
Dabei kamen drei verschiedene Filtrationsverfahren zum Tragen, während ein Probenanteil keinem Filtrationsverfahren unterzogen wurde.
Die Proben wurden konventionell kryokonserviert und mit Hilfe von sog. Cryoloops sowie mit Hilfe von Pailletten vitrifikationsähnlich tiefgefroren.
Die Hälfte der Proben wurde jeweils mit 2,5 % Glycerol versetzt, die andere Hälfte wurde ohne Glycerol kryokonserviert.
Bevor sie einer weiteren Aufbereitung und der Kryokonservierung unterzogen wurden, wurden die Spermatozoen in den flüssigverdünnten Spermaproben in Bezug auf ihre Motilität, ihre Vitalität und ihre Akrosomintegrität untersucht (s. 3.4).
4.2.1 Aufbereitungsverfahren
Die in den hier folgenden grafischen Darstellungen als verdünnt bezeichneten Proben, sind keiner Kryokonservierung unterzogen worden, während die anderen vier Proben alle einem Kryokonservierungsverfahren ausgesetzt waren.
4.2.1.1 Einfluss des Aufbereitungsverfahrens auf die Vitalität, die Akrosomintegrität und die Motilität der Spermatozoen in Vorversuch 2 Der Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien ist , wie in Abbildung 4.3 deutlich wird, in der verdünnten Spermaprobe am größten und unterscheidet sich signifikant von dem Ergebnis der kryokonservierten Proben. Innerhalb der kryokonservierten Proben besteht zwischen den unfiltrierten und den mit PercollTM bzw. mit EquiPureTM aufbereiteten Proben kein signifikanter Unterschied. Allerdings ist im Vergleich zu den unfiltrierten Proben und den mit EquiPureTM aufbereiteten Proben der Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien in den Proben, die dem Swim-up-Verfahren unterzogen wurden signifikant geringer. Zu den mit Percoll TM aufbereiteten Proben besteht jedoch kein signifikanter Unterschied.
In Bezug auf die mittlere Geschwindigkeit ist ein signifikanter Unterschied zwischen den Proben festzustellen, die einem Swim-up-Verfahren unterzogen wurden und den übrigen Proben.
Der Anteil membranintakter Spermien in der verdünnten Spermaprobe ist signifikant größer als der Anteil membranintakter Spermien in den auf jegliche Art kryokonservierten Proben. Dabei besteht kein signifikanter Unterschied zwischen den unfiltrierten und den mit PercollTM bzw. mit EquiPureTM aufbereiteten Proben. Es besteht jedoch ein signifikanter Unterschied zwischen diesen drei Proben und den Proben, die einem Swim-up-Verfahren unterzogen wurden. Bei den letztgenannten Proben ist der Anteil membranintakter Spermien deutlich geringer und erreicht im Median einen Anteil von 5,7 %.
Der Anteil akrosomgefärbter Spermien in der flüssigkonservierten Spermaprobe ist signifikant größer als der Anteil akrosomgefärbter Spermien in den auf jegliche Art kryokonservierten Proben. Zwischen den unfiltrierten und den mit PercollTM bzw. mit EquiPureTM aufbereiteten Proben besteht dabei kein signifikanter Unterschied, jedoch besteht ein signifikanter Unterschied zwischen diesen drei Proben und den Proben, die einem Swim-up-Verfahren unterzogen wurden; hier ist der Anteil akrosomgefärbter Spermien geringer (p ≤ 0,05).
verd.
o. Filt.
Percoll Eq.Pure SUP
Abb. 4.3: Einfluss des Aufbereitungsverfahrens auf die Motilität, die Vitalität und die Akrosomintegrität der Spermien (Medianwerte, n = 1 Hengst, m = 3 Ejakulate/Hengst)
Versuchsgruppen: verd. = verdünnt, ohne Filt. = ohne Filtration, Perc. = Percoll
TM, EquiPure TM, SUP = swim-up
SYTO positiv membranintakte Spermien nach FITC-PNA/SYTO 17/PI-Färbung (%)
FITC-PNA positiv akrosomgefärbte Spermien (%)
VAP Velocity Average Path, mittlere Geschwindigkeit (µm/s) PMS progressiv motile Spermien (%)
a, b, c unterschiedliche Buchstaben verdeutlichen einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen mit unterschiedlichen Aufbereitungsverfahren (p ≤ 0,05)
4.2.2 Gefriermethode
4.2.2.1 Einfluss der Gefriermethode auf die Vitalität, die Akrosomintegrität und die Motilität der Spermatozoen in Vorversuch 2
Abbildung 4.4 ist zu entnehmen, dass der Anteil vorwärtsbeweglicher Spermatozoen in der verdünnten Spermaprobe am größten ist. Der Median liegt hier bei
69,0 % ± 1,8 %. Im Vergleich dazu liegt der Median bei den konventionell kryokonservierten Proben bei 34,8 % ± 21,3 %, bei den mit Hilfe von Pailletten vitrifizierten Proben bei 12,6 % ± 16,7 % und bei den mit Hilfe von Cryoloops vitrifizierten Proben bei 0,00 % ± 0,6 % und ist bei diesen Proben damit am niedrigsten (p ≤ 0,05).
Bei den mit Hilfe von Cryoloops vitrifizierten Proben ist ein signifikanter Rückgang der mittleren Geschwindigkeit der Spermatozoen im Vergleich zu den anderen Proben zu bemerken. Weitere signifikante Unterschiede sind nicht festzustellen Abbildung 4 zeigt weiterhin, dass der Anteil membranintakter Spermien in den verdünnten Spermaproben signifikant größer ist als in den kryokonservierten Proben.
Zwischen den einzelnen Gefriermethoden bestehen ebenfalls Unterschiede (p ≤ 0,05). Der Anteil membranintakter Spermien ist in den konventionell kryokonservierten Proben mit 23,3 % ± 7,8 % am größten und in den mit Hilfe von Cryoloops vitrifizierten Proben mit 0,8 % ± 1,3 % am geringsten.
Zwischen den verdünnten Spermaproben und den konventionell kryokonservierten Proben besteht kein signifikanter Unterschied in Bezug auf den Anteil akrosomgefärbter Spermien. Es ist aber ist ein Unterschied zwischen diesen beiden Gruppen und der Gruppe der vitrifizierten Proben zu bemerken, bei denen der Anteil akrosomgefärbter Spermien höher liegt (p ≤ 0,05). Dabei wurde außerdem ein signifikant höherer Anteil akrosomgefärbter Spermien in der Gruppe der mit Hilfe von Cryoloops vitrifizierten Proben im Vergleich zu den mit Pailletten vitrifizierten Proben zu festgestellt.
verd.
konv.TG vitr.Paill.
vitr.loops
Abb. 4.4: Einfluss der Gefriermethode auf die Motilität, die Vitalität und die Akrosomintegrität der Spermien (Medianwerte, n = 1 Hengst, m = 3 Ejakulate/Hengst)
Versuchsgruppen: verd. = verdünnt, konv. TG = konventionelle Tiefgefrierung, vitr. Paill. = vitrifizierten Pailletten, vitr. loops = vitrifizierte loops
SYTO positiv membranintakte Spermien nach FITC-PNA/SYTO 17/PI-Färbung (%)
FITC-PNA positiv akrosomgefärbte Spermien (%)
VAP Velocity Average Path, mittlere Geschwindigkeit (µm/s) PMS progressiv motile Spermien (%)
a, b, c, d unterschiedliche Buchstaben verdeutlichen einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen mit unterschiedlichen Gefriermethoden (p ≤ 0,05)
4.2.3 Glycerol
4.2.3.1 Einfluss der Verwendung von Glycerol auf die Vitalität, die Motilität und die Akrosomintegrität der Spermatozoen in Vorversuch 2
In allen Fällen ist zu bemerken, dass kein signifikanter Unterschied zwischen den Proben bestand, die ohne oder mit 2,5 % Glycerol kryokonserviert. Abbildung 4.5 stellt diese Verhältnisse dar.
mit Glyc.
ohne Glyc.
Abb. 4.5: Einfluss der Verwendung von 2,5% Glycerol auf die Motilität, die Vitalität und die Akrosomintegrität der Spermien (Medianwerte, n = 1 Hengst, m = 3 Ejakulate/Hengst)
SYTO positiv membranintakte Spermien nach FITC-PNA/SYTO 17/PI-Färbung (%)
FITC-PNA positiv akrosomgefärbte Spermien (%)
VAP Velocity Average Path, mittlere Geschwindigkeit (µm/s) PMS progressiv motile Spermien (%)
a zwischen den Gruppen der mit und ohne Verwendung von Glycerol kryokonservierten Proben besteht kein signifikanter Unterschied (p ≤ 0,05)
4.2.4 Bedeutung der in Vorversuch 2 erzielten Ergebnisse für den Versuchsaufbau im Hauptversuch
Da das Swim-up-Verfahren ebenso wie die Verwendung von Cryoloops zur Kryokonservierung der aufbereiteten Spermaproben nicht zu zufrieden stellenden Ergebnissen geführt hat, werden diese Verfahren im Hauptversuch vernachlässigt.
4.3 Hauptversuch
(n = 12 Hengste, m = 3 Ejakulate/Hengst)
4.3.1 Relativer Anteil der Varianz an der Gesamtvarianz von Individuum und Ejakulat in allen untersuchten Parametern (Vitalität, Akrosomintegrität, Motilität, Spermienchromatinstruktur) im Hauptversuch
Der relative Anteil der Varianz an der Gesamtvarianz im Parameter der membranintakten (SYTO-positiven) Spermien liegt zu 47,2 % bei Hengst und Ejakulat und zu 52,8 % bei den Aufbereitungsverfahren, der Gefriermethode und der Glycerolverwendung.
Betrachtet man nur den Einfluss von Hengst und Ejakulat, so entfallen 67,5 % des Einflusses auf den Hengst, während das Ejakulat nur zu 31,5 % für die Varianz im Parameter der membranintakten Spermien verantwortlich ist.
Im Parameter der akrosomgefärbten Spermien liegt der relative Anteil der Varianz an der Gesamtvarianz zu 40,4 % bei Hengst und Ejakulat und zu 59,6 % bei den Aufbereitungsverfahren, der Gefriermethode und der Glycerolverwendung. Dabei entfallen 48,2 % des Einflusses auf den Hengst und 51,8 % auf das Ejakulat.
In Bezug auf die Vorwärtsbeweglichkeit der Spermatozoen liegt der relative Anteil der Varianz an der Gesamtvarianz zu 52,0 % bei Hengst und Ejakulat (davon sind 1,6 % dem Hengst und 98,3 % dem Ejakulat zuzuschreiben), während
48,0 % des Einflusses auf das Aufbereitungsverfahren, die Gefriermethode und die
Der relative Anteil der Varianz an der Gesamtvarianz im Parameter der mittleren Geschwindigkeit der Spermatozoen liegt zu 33,5 % bei Hengst und Ejakulat und zu 66,5 % bei den übrigen drei Einflussfaktoren. Dabei entfallen 58,5 % des Einflusses auf den Hengst und 41,5 % auf das Ejakulat.
In Bezug auf die Spermienchromatinstruktur der Spermien liegt der relative Anteil der Varianz an der Gesamtvarianz zu 77,7 % bei Hengst und Ejakulat und zu 22,3 % bei den Aufbereitungsverfahren, der Gefriermethode und der Glycerolverwendung.
Berücksichtigt man nur Hengst und Ejakulat, so liegen 86,2 % des Einflusses beim Hengst und 13,8 % des Einflusses liegen beim Ejakulat.
4.3.2 Aufbereitungsverfahren
Im Hauptversuch wurden die Proben entweder mit PercollTM bzw. mit EquiPureTM aufbereitet oder sie wurden ohne filtriert zu werden weiterverarbeitet.
4.3.2.1 Einfluss des Aufbereitungsverfahrens auf die Motilität der Spermatozoen im Hauptversuch
Die Varianzanalyse ergab einen signifikanten Einfluss des Aufbereitungsverfahrens auf die die Motilität beschreibenden Parameter.
In Abbildung 4.6 ist der Anteil vorwärtsbeweglicher Spermatozoen in Prozent in Abhängigkeit von den Aufbereitungsverfahren dargestellt. Dabei erfolgt die Darstellung getrennt nach den angewandten Gefriermethoden und unter der Berücksichtigung der Verwendung von Glycerol.
Bei den konventionell kryokonservierten Proben ergibt sich bei Verwendung von Glycerol ein signifikanter Unterschied zwischen den Proben, die einem Filtrationsverfahren unterzogen wurden und den nicht filtrierten Proben, bei denen der Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien größer ist. Dieser Unterschied besteht nicht bei den vitrifizierten Proben.
Bei den konventionell kryokonservierten Proben ohne Verwendung von Glycerol wird ein signifikanter Unterschied zwischen den nicht filtrierten Proben und den mit
EquiPureTM mit PercollTM aufbereiteten Proben deutlich (p ≤ 0,05), während zwischen den mit EquiPureTM mit PercollTM aufbereiteten Proben kein Unterschied besteht. Bei den vitrifizierten Proben war lediglich ein signifikanter Unterschied zwischen den EquiPureTM - aufbereiteten Proben und den unfiltrierten Proben festzustellen.
Zwischen den Gruppen der mit und der ohne Glycerol kryokonservierten Proben bestand in allen Fällen, also bei allen drei Aufbereitungsverfahren, sowohl in der Gruppe der konventionell kryokonservierten als auch in der Gruppe der vitrifizierten Proben, ein signifikanter Unterschied (p ≤ 0,05).
Abb. 4.6: Einfluss des Aufbereitungsverfahrens auf die Vorwärtsbeweglichkeit der Spermien unter Berücksichtigung der Gefriermethode und der
Verwendung von Glycerol (Medianwerte, n = 12 Hengste, m = 3 Ejakulate/Hengst)
Versuchsgruppen: ohne Filt. = ohne Filtration, Perc. = Percoll TM, EquiPure TM PMS progressiv motile Spermien (%)
a, b unterschiedliche Buchstaben zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen den Aufbereitungsverfahren innerhalb der Gruppe der mit Verwendung von Glycerol kryokonservierten Probe an (p ≤ 0,05)
A, B unterschiedliche Buchstaben zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen den Aufbereitungsverfahren innerhalb der Gruppe der ohne Verwendung von Glycerol kryokonservierten Proben (p ≤ 0,05)
*,# unterschiedliche Buchstaben zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen den mit und ohne Verwendung von Glycerol kryokonservierten Proben innerhalb der verschieden Aufbereitungsverfahren (p ≤ 0,05)
Abbildung 4.7 zeigt die mittlere Geschwindigkeit der Spermien in µm/s in Abhängigkeit von den Aufbereitungsverfahren.
Weder zwischen den Aufbereitungsverfahren noch innerhalb der Aufbereitungsverfahren zwischen den mit und ohne Glycerol kryokonservierten Gruppen sind in Bezug auf die mittlere Geschwindigkeit der Spermien signifikante Unterschiede darstellbar.
Abb. 4.7: Einfluss des Aufbereitungsverfahrens auf die mittlere Geschwindigkeit der Spermien unter Berücksichtigung der Gefriermethode und der Verwendung von Glycerol (Medianwerte, n = 12 Hengste,
m = 3 Ejakulate/Hengst)
Versuchsgruppen: ohne Filt. = ohne Filtration, Perc. = Percoll TM, EquiPure TM VAP Velocity Average Path, mittlere Geschwindigkeit (µm/s) a, zwischen den Aufbereitungsverfahren innerhalb der Gruppe
mit Verwendung von Glycerol kryokonservierten Proben
mit Verwendung von Glycerol kryokonservierten Proben