Einfluss des Aufbereitungsverfahrens

Die Kryokonservierung ist ein Prozess, der die Zelle einem erheblichen thermischen, mechanischen und osmotischen Stress aussetzt. Zellen, die initial eine Vorschädigung aufweisen, werden diesen Prozess kaum ohne deutliche, ihre Funktionsfähigkeit beeinträchtigende Veränderungen überstehen. In der Andrologie bedeutet das, dass nur Spermatozoen mit initial guten Vitalitäts-, Motilitäts- und Membranintegritätsparametern sowie unbeschädigter Spermienchromatinstruktur

eine Chance haben, ohne deutliche Qualitätseinbußen aus dem Prozess der Kryokonservierung hervorzugehen (HAMMADEH et al. 2001) und ihre Befruchtungskompetenz zu bewahren. Eine effektive Vorbereitung eines Ejakulates auf den Prozess der Tiefgefrierung würde also im günstigsten Fall die morphologisch normalen, motilen, unbeschädigten Spermatozoen in einem verhältnismäßig kleinen Volumen konzentrieren. Zu diesem Zweck ist eine Vielzahl von Spermienpräparationstechniken zum Einsatz gekommen. Dabei sind vier Grundsätze der Methodik zu unterscheiden: (1) Verdünnung und Waschen durch Zentrifugation und Resuspension, (2) Spermienmigration durch Swim-up-Verfahren, (3) selektives Auswaschen von Subpopulationen durch Dichtegradientenzentrifugation, (4) Elimination toter Spermatozoen und Zellreste durch Verwendung adhäsiver Substanzen (SIEME et al. 2003).

Mit Hilfe des Swim-up-Verfahrens oder einer Dichtegradientenzentrifugation können Spermatozoen selektiert werden, die sich durch Vorwärtsbeweglichkeit, normale Morphologie oder unbeschädigte DNA auszeichnen. Diese Art der Vorselektion verbessert einigen Untersuchungen zu Folge die Spermienqualität nach dem Auftauen (PEREZ-SANCHEZ et al. 1994, ESTEVES et al. 2000, SAKKAS et al.

2000).

Laut BUNGUM et al. (2008) wird mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation ein signifikanter Anteil von Spermien mit DNA-Brüchen aus einem Ejakulat entfernt. Der per SCSA ermittelte Anteil DNA-fragmentierter Spermatozoen bei unverdünnten Proben korreliert mit der Fertilisationskapazität der Spermatozoen bei intrauteriner Insemination (IUI), in vitro-Fertilitsation (IVF) und intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI) (BUNGUM et al. 2004, 2007). Dies scheint jedoch nicht notwendigerweise für Spermatozoen zu gelten, die einer Dichtegradientenzentrifugation unterzogen wurden. BUNGUM et al. (2008) stellten fest, dass anhand des DFI-Wertes von Spermatozoen nach Dichtegradientenzentrifugation mit PureSperm^® keine Vorhersage bezüglich der Befruchtungskapazität bei IUI, IVF und ICSI getroffen werden konnte. Die

detektiert, ist bislang unklar. Möglicherweise können also bisher unbekannte DNA-Schädigungen vorliegen, ohne dass die DNA während der SCSA-Untersuchung denaturiert, so dass auch Spermatozoen, die einer Dichtegradientenzentrifugation unterzogen wurden Veränderungen in der Chromatinstruktur aufweisen können, die vom DFI nicht reflektiert werden (BUNGUM et al. 2008).

In Vorversuch 2 wurden die Ejakulate geteilt und drei unterschiedlichen Aufbereitungsverfahren unterzogen, während ein Teil keine weitere Aufbereitung erfuhr. Eingesetzt wurden die Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll^TM und EquiPure^TM, sowie ein Swim-up-Verfahren.

Die SUP-präparierten Proben wiesen in allen untersuchten Parametern die schlechtesten Ergebnisse auf und unterschieden sich signifikant von den übrigen Proben. Hingegen besteht zwischen den mit Percoll^TM sowie EquiPure^TM aufbereiteten und den unfiltrierten Proben kein signifikanter Unterschied.

Diese Ergebnisse entsprechen mehreren Veröffentlichungen, die die Überlegenheit von Percoll^TM und PureSperm^® gegenüber dem Swim-up-Verfahren darstellen.

SAKKAS et al. (2000) zufolge ist die Isolierung einer Spermatozoenpopulation mit geringem Anteil an DNA-Schäden mittels Percoll^TM und PureSperm^® effektiver als die Anwendung eines Swim-up-Verfahrens. Die Überlegenheit von Percoll^TM gegenüber Swim-up-Verfahren in Bezug auf die Selektionsfähigkeit motiler und morphologisch normaler Spermatozoen wird von weiteren Studien bestätigt (BERGER et al. 1985, MCCLURE et al. 1989, MOOHAN und LINDSAY 1995).

Die Ergebnisse hinsichtlich der größeren Effektivität des einen oder anderen Verfahrens sind jedoch unterschiedlich. So selektierte anderen Veröffentlichungen zufolge eine Swim-up-Prozedur erfolgreich eine Spermienpopulation mit einem DFI-Wert, der unter dem der Kontrollgruppe lag, welche keinem Selektionsverfahren unterzogen worden war (ANGELOPOULOS et al. 1998, SPANO et al. 1999).

Auch wenn es gelingt, mit dem Swim-up-Verfahren eine aufgereinigte Population motiler Spermatozoen zu selektieren, so muss doch berücksichtigt werden, dass es nur zu einer Selektion einer sehr geringen Spermienzahl kommt. Dieses Verfahren eignet sich also eher für den humanen Bereich bei Einsatz von Techniken wie IVF oder ICSI (LOOMIS 2006).

Im Hauptversuch kamen nur noch die Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll^TM und EquiPure^TM zum Einsatz. Die Ergebnisse dieser Verfahren wurden mit Proben verglichen, die keiner Dichtegradientenzentrifugation unterzogen wurden.

Der Einfluss des Aufbereitungsverfahrens ist nur für den Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien innerhalb der konventionell kryokonservierten Proben signifikant. In dieser Gruppe war der Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien sowohl mit als auch ohne Glycerol bei den unfiltrierten Proben höher.

Bei den ohne Glycerol vitrifizierten Proben ist lediglich der Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien in der unfiltrierten Gruppe im Vergleich zu der mit EquiPure^TM aufbereiteten Gruppe größer.

Bei den vitrifizierten Proben ohne Glycerol war der Anteil akrosomgefärbter Spermien bei den mit EquiPure^TM aufbereiteten Proben größer als bei den unfiltrierten Proben.

Andere, bereits angesprochene Studien beschreiben die durch Swim-up-Verfahren, vor allem aber durch Dichtegradientenzentrifugation erreichte Selektion von Spermienpopulationen mit Motilitäts- und DFI-Werten, die mit denen parallel untersuchter Kontrollgruppen ohne Spermienselektionsverfahren vergleichbar oder sogar überlegen waren (LARSON et al. 1999, SAKKAS et al. 2000, DONNELLY et al. 2001, TOMLINSON et al. 2001, HAMMADEH et al. 2001, YOUNGLAI et al. 2001, MORRELL et al. 2004). Obwohl die in der vorliegenden Arbeit erzielten Resultate nicht immer einheitlich sind, so ist doch festzustellen, dass in den meisten Fällen im Gegensatz zu den genannten Studien mit den unfiltrierten Proben die besseren Ergebnisse erzielt wurden. Andere Studien wiederum bestätigen die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse (ZINI et al. 1999, 2000a, 2000b, TOMSU et al. 2002). Die Gründe hierfür können in der Übertragung von Methoden aus der Humanmedizin liegen, die an die equine Reproduktionsmedizin noch angepasst werden müssen.

Aus Gründen der Vergleichbarkeit und mit Hinblick auf die Anwendbarkeit auf die Praxis lag das Volumen der verwendeten Proben teilweise über dem Empfohlenen, was einen nachteiligen Einfluss auf den Selektionserfolg gehabt haben kann. Zum anderen können suboptimale Rezepturen beispielsweise bei der Herstellung von

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zur Spermienmigration muss ebenfalls mit einbezogen werden. Um größere statistische Aussagekraft zu erlangen, wäre eine auch im Hauptversuch größere Probandenzahl wünschenswert.

Der Prozess der Zentrifugation kann sich negativ auf die Spermienqualität unselektierter Spermatozoen auswirken (MORTIMER 1991). Als Mechanismus dieser Schädigung wird die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies angenommen (AITKEN und CLARKSON 1988). In der vorliegenden Arbeit wurden die Proben zwei Zentrifugationsgängen unterzogen. Die Schädigung durch diese Zentrifugationsprozesse kann mit verantwortlich für die im Vergleich zu anderen Studien schlechteren Ergebnisse sein, bei denen niedrigere g-Zahlen gewählt wurden. Zwar kamen YOUNGLAI et al. (2001) zu dem Ergebnis, dass ein von ihnen angewendetes Swim-up-Verfahren mit Zentrifugationsschritt nicht mehr Schaden an der DNA von Spermatozoen verursacht als ein direktes Swim-up-Verfahren ohne Zentrifugation. Jedoch wurden die Proben dabei nur für 10 min bei 220 g zentrifugiert.