Ubiquitin

Aufbauend auf diesen Performance Tests wurde das Programm nun an einem echten 4D-Spektrum von Ubiquitin getestet. Dazu wurde vonRemco Sprangers an einem800 MHz

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Abbildung 4.7.: Übersicht über die UASR-Raten abhängig von der Anzahl verbleibender Restraints bei symmetrischen Entfernung der Restraints. In schwarz die beste und in blau die schlechteste der 100 Rechnungen.

Bruker Spektrometer ein 4D-¹H¹⁵N-HSQC-NOESY-¹H¹⁵N-HSQC Spektrum von Ubi-quitin mit einer NOESY-mixing time von 120 Millisekunden aufgenommen. Die Probe bestand aus einer 2,5 millimolaren Proteinlösung in einem 40 millimolaren Phosphat-puffer bei einem pH-Wert von 5,8 und wurde bei Raumtemperatur vermessen.

Das erhaltene Spektrum wurde dann mit NMRDraw aus NMRPipe [71] prozessiert und anschließend mit CARA [72,73] geladen. Zunächst wurden dabei alle HSQC-Signale identifiziert und anschließend in den zugehörigen NOESY-Ebenen alle NOESY-Signale ausgewählt. Die gewählten Signale wurden dann mit der Integrationsroutine von CARA integriert, um so die Volumina der Signale zu erhalten.

Um daraufhin die Volumina in Restraints umrechnen zu können, musste zunächst die UmrechnungskonstanteA bestimmt werden. Hierfür wurde das Signal mit dem größten Volumen, dasjenige zwischen den Amidgruppen der Aminosäure Glu34 und Gly35 mit einem Volumen von 30530000, genommen. Unter Verwendung der 3D-Struktur, welche der PDB-Datenbank [67] unter der Nummer 1D3Z [69] entnommen wurde, konnte aus diesem der Referenzwert für das Volumen für ein Signal mit einem Abstand von 4,0Å bestimmt werden.

Da zu diesem Zeitpunkt natürlich noch nicht bekannt war, dass dieses Signal zu den genannten beiden Amidgruppen gehört, wurde hierfür zunächst der Minimalabstand von 1,0Å angenommen und in Schritten von jeweils 0,1Å erhöht. Die Ergebnisse dieser Be-rechnung sind in der Tabelle 4.3 dargestellt. Wird der Abstand für dieses größte Signal kleiner als 3,0Å gewählt, so bricht das Programm auch mit dem standardmäßgen Si-cherheitszuschlag von0,2Å ab und meldet, dass für mindestens ein Signal keine einzige Zuordnungsmöglichkeit alle Restraints erfüllt. Sobald der Abstand für dieses größte Vo-lumen größer oder gleich 3,0Å gewählt wird, wird eine Zuordnung erhalten in der auch die richtige Möglichkeit enthalten ist.

Bei einer weitern Steigerung des Referenzvolumens kommt es zunächst zu keinen si-gnifikanten Änderungen, die UASR bleibt zunächst gleich und auch die Rechenzeit steigt nur mäßig an. Erst bei einer deutlichen Überhöhung des Referenzsignals entsprechend einem Abstand von3,5Å für das größte Volumen, kommt es zu einem Abfall der UASR, da dann einzelne Gruppen auf Grund der dann deutlich zu langen Restraints nicht mehr zugeordnet werden können. Bei einer noch weiteren Erhöhung des Referenzwerts kommt es zum Zusammenbruch in dem Sinne, dass die UASR auf Null fällt. Die Ursache für den plötzlichen Zusammenbruch liegt darin, dass in der Optimierung kein Signal mehr ein-deutig zugeordnet werden kann. Sobald nur eine einzige einein-deutige Zuordnung gelingt, kann dieReduce Assignment-Routine sofort zahlreiche weitere Signale zuordnen.

Wird der Wert für A von 13701721 auf 16224891 erhöht, was einer Verlängerung des zugehörigen Restraints von 3,5Å auf 3,6Å für das größte Signal entspricht, fällt die UASR auf 0 % ab. Die UASR von 0 % bedeutet hier aber nicht den kompletten Ver-lust aller Informationen. Es sollte möglich sein, sofern auch nur ein Signal bestimmt werden kann, mit dieser sehr mehrdeutigen Zuordnung weitere eindeutige Zuordnungen zu erhalten. Um dies zu prüfen, wurde die Berechnung bei einem Abstand von 3,6Å wiederholt und je ein Signal bereits vor Aufruf der Optimierung richtig und eindeutig zugeordnet. Je nach Wahl des Signals konnten dann weitere 54 bis 60 Signale eindeu-tig zugeordnet werden (UASR von 72 % bis 80 %). Einzig die Vorgabe des Signals der

Amidgruppe Glu24 erlaubte es auf Grund der Tatsache, dass dieses keine Restraints zu anderen Amidgruppen zeigt, nicht weitere Signale zuzuordnen. Hiermit konnte bestä-tigt werden, dass auch in dieser sehr mehrdeutigen Zuordnung (UASR 0 %) noch viele Informationen enthalten sind.

Tabelle 4.3.: Ergebnisse für die Optimierung der Referenz. Bei einem Abbruch wird für die UASR nur „ - “ angegeben. Die verletzten Restraints beziehen sich auf die korrekte Zuordnung.

Abstand für Volumen für UASR Anzahl verletzter Rechenzeit größtes Signal Referenz [%] Restraints [s]

1,0 7453 - 228 1

1,5 84901 - 225 1

2,0 477031 - 209 1

2,5 1819729 - 105 1

2,6 2302538 - 69 1

2,7 2887682 - 43 10

2,8 3591823 - 24 16

2,9 4433584 - 8 24

3,0 5433684 - 3 30

3,1 6615108 82 0 38

3,2 8003257 82 0 49

3,3 9626102 82 0 63

3,4 11514377 82 0 76

3,5 13701721 71 0 127

3,6 16224891 0 0 333

3,7 19123934 0 0 263

3,8 22442354 0 0 309

3,9 26227360 0 0 354

4,0 30530000 0 0 513

Mit dieser Testreihe konnte gezeigt werden, dass der Ansatz für die Bestimmung des Volumens des Referenzsignals gut funktioniert und die Idee, den kleinsten möglichen Wert für das Referenzsignal zu nehmen sinvoll ist. So kann mit diesem Wert, entspre-chend3,1Å für den Abstand, für das größte Volumen bei kurzer Rechenzeit das bestmög-lichste Ergebnis erzielt werden. Zudem ist die Rechenzeit, die für die vielen Durchgänge nötig ist, bei denen der Referenzwert zu kurz ist, überschaubar. So sind die meisten die-ser Durchgänge nach etwa einer Sekunde und die übrigen nach weniger als einer Minute beendet. Insgesamt ist damit nur die etwa 3- bis 4-fache Rechenzeit für die Routine zur Bestimmung der Referenz nötig, als wenn dieser Wert direkt bekannt wäre.

Das Starten mit einem größeren Mindestabstand hätte nur einen geringen Einfluss auf die Rechenzeit, da alle Rechnungen mit sehr kurzen Abständen sofort abbrechen.

Zudem zeigte sich, dass auch einige Unsicherheiten in den Restraints verkraftet werden

können. So können einzelne Restraints zu kurz sein und damit ein größerer Referenzwert nötig werden, ohne dass die Ergebnisse beeinflusst werden. Dies kann zum Beispiel bei der Verwendung einer Kristallstruktur der Fall sein, die die Beweglichkeit des Proteins in Lösung nicht beschreiben kann. Deshalb werden an einigen beweglichen Regionen kürzere Restraints gemessen werden, als es aus der Kristallstruktur zu erwarten wäre.

In solch einem Fall würde zunächst ein größerer Referenzwert bestimmt. Sofern diese Abweichung nicht extrem (größer als etwa 0,5Å) ist, würde nach einer lediglich etwa doppelt so langen Rechenzeit die gleiche UASR erhalten werden.

Um dies zu prüfen, wurde nun die gesamte Rechnung an der Kristallstruktur des Ubi-quitins wiederholt, die der PDB-Datenbank [67] unter der Nummer 1UBQ [74] entnom-men wurde. Dieses ist die älteste in der PDB veröffentlichte Kristallstruktur des Ubiqui-tin. Mit einem RMSD zwischen der Kristallstruktur und der mittels NMR-Spektroskopie gefunden Struktur von lediglich0,51Å für dieCα-Atome verwundert es nicht, dass damit exakt die gleichen Ergebnisse erhalten wurden. Lediglich die Rechenzeit unterschied sich im Bereich weniger Sekunden. Wird die Referenz so gewählt, dass sich für das größte Volumen ein Abstand von 3,1Å ergibt, was einem Referenzvolumen von 6615108 ent-spricht, so ergibt sich nach einer Rechenzeit von 38 Sekunden als Ergebnis, dass 63 Amidgruppen der insgesamt 76 Aminosäuren eindeutig zugeordnet sind.

Die N-terminale Aminosäure Met1 und die drei Proline Pro19, Pro37 und Pro38 kön-nen keine HSQC-Signale zeigen und wurden deswegen aus den Zuordnungsmöglichkei-ten entfernt. Dabei wird angenommen, dass Met1 einen schnellen Protonenaustausch mit Wasser zeigt und Amidwasserstoffe deswegen nicht zu sehen sind. Diese vier Ami-nosäuren können daher auch für die Zuordnung ignoriert werden. Die verbleibenden 72 Aminosäuren kommen als Zuordnungsmöglichkeiten in Frage.

Da für die Aminosäure Gly53 kein HSQC-Signal sichtbar ist, verbleiben insgesamt 71 Signale, welche zuzuordnen sind. Nach Abschluss der Optimierung konnten 8 Signale nicht eindeutig zugeordnet werden. Die erreichte Zuordnung ist in Abbildung 4.8 dar-gestellt und die verbleibenden Zuordnungsmöglichkeiten dieser 8 Signale sind in Tabelle 4.4 dargestellt.

M1 Q2 I3 F4 V5 K6 T7 L8 T9 G10 K11 T12 I13 T14 L15 E16 V17 E18 P19 S20 D21 T22 I23 E24 N25 V26 K27 A28 K29 I30 Q31 D32 K33 E34 G35 I36 P37 P38 D39 Q40 Q41 R42 L43 I44 F45 A46 G47K48 Q49 L50 E51 D52G53 R54 T55 L56 S57 D59 Y59 N60 I61 Q62 K63 E64 S65 T66 L67 H68 L69 V70 L71 R72L73 R74 G75 G76

Abbildung 4.8.: Ergebnisse für das Ubiquitin: In grün eindeutig zugeordnete Amidgrup-pen, in schwarz AmidgrupAmidgrup-pen, die im Spektrum keine Signale zeigten und in rot mehrdeutig zugeordnete Amidgruppen.

Da die Amidgruppe der Aminosäure Gly53 kein Amidsignal zeigt und die Restraints zur Amidgruppe der Aminosäure Asp52 etwas zu lang sind, kann nicht entschieden wer-den, ob Asp52 oder Gly53 die richtige Zuordnung zu diesem Signal ist. Zum Signal der Amidgruppe zur Aminosäure Glu24 gibt es keine Restraints. Folglich kann dieses Si-gnal allen noch nicht eindeutig zugeordneten Amidgruppen zugeordnet werden. Die ver-bleibenden 6 Signale gehören jeweils zu Paaren von benachbarten Amidgruppen. Diese

Tabelle 4.4.: Übersicht über die verbleibenden Zuordnungsmöglichkeiten der nicht ein-deutig zugeordneten Signale: In rot falsche noch verbleibende Zuordnungs-möglichkeiten.

15N [ppm] ¹H [ppm] Anzahl Restraints Verbleibende Zuordnungsmöglichkeiten

126,97 7,63 3 T9 G10

109,40 7,82 4 T9 G10

121,26 9,42 0 E24 D52 G53

111,91 8,96 3 A46G47

123,54 8,11 2 A46G47

120,45 8,15 2 D52G53

124,53 8,32 2 L73R74

121,99 8,41 1 L73R74

Abbildung 4.9.: Hairpin der von den Aminosäuren Leu8 bis Lys11 gebildet wird. In grün eingezeichnet sind die Abstände der Amidgruppen Thr9 und Gly10 zu ihren Nachbarn.

gehören zum dem Lösemittel zugewandten Hairpins im Protein. In Abbildung 4.9 ist der Hairpin der Aminosäuren Leu8 bis Lys11 als Beispiel gezeigt. Die Abstände beider Amidgruppen zu ihren Nachbaren sind sehr kurz. Auf Grund der Abstandsabhängigkeit in sechster Potenz, V = A·r⁻⁶, heißt das, dass zu kleine Volumen schnell zu zulangen Restraints führen und so unabhängig von der Zuordnung keine Restraints verletzt sind.

Einige Flexibilität in den Hairpins kann darüber hinaus dazu führen, dass im Spektrum zu kleine Volumina gemessen werden.