Hier soll zunächst nur auf die Grundlagen eingegangen werden, die für alle späteren Ansätze zur Zuordnung der chemischen Verschiebungen von Bedeutung sind. Einerseits sind dies die chemischen Verschiebungen und Methoden zu deren Voraussage, ande-rerseits HSQC-Spektren, welche einen zentralen Bestandteil der später beschriebenen mehrdimensionalen Spektren bilden.
2.1. NMR-chemische Verschiebungen
Viele Atomkerne besitzen einen Kernspin, der im klassichen Bild einer Eigenrotation der Atomkerne entspricht. Aus der Quantenmechanik folgt, dass ein Atomkern für den Spin nicht beliebig viele Orientierungsmöglichkeiten einnehmen kann, sondern es nur genau definierte Zustände gibt. Die Anzahl der Orientierungsmöglichkeiten für den Kernspin wird über die KernspinquantenzahlIbeschrieben [10]. Es gibt dann2I+1 Orientierungs-möglichkeiten für einen Kernspin. Zunächst einmal spielt die Orientierung des Kernspins keine Rolle, da alle Zustände energetisch entartet sind. Bringt man den Atomkern al-lerdings in ein externes Magnetfeld, so wechselwirkt der Kernspin mit dem Magnet-feld, so dass sich die Zustände energetisch unterscheiden. Dabei gilt zunächst einmal, dass für jedes isolierte Atom einer Atomsorte der Energieunterschied der Spinzustän-de bei gleichem Magnetfeld stets Spinzustän-der gleiche ist. Neben Spinzustän-dem einfachsten Fall, bei Spinzustän-dem ein Atomkern nur eine Möglichkeit zur Orientierung besitzt, ist für die Spektroskopi-ker besonders der Fall interessant, bei dem ein AtomSpektroskopi-kern für den Kernspin genau zwei Orientierungsmöglichkeiten besitzt, da diese keine Kernquadrupolmomente besitzen. So kommt es hier nicht zu zusätzlichen Linienverbreiterungen im Spektrum und auf Grund der nur zwei möglichen Orientierungsmöglichkeiten auch nur zu einer überschaubaren Kopplung mit anderen Kernspins und in der Folge zu einfacheren Spektren. Unter den für Biochemiker interessanten Atomen sind dies die Isotope1H, 13Cund 15N. Allerdings wechselwirken auch die die Atomkerne umgebenden Elektronen mit dem Magnetfeld und können dieses abschirmen. Je stärker die Abschirmung, desto kleiner ist die Ener-giedifferenz zwischen den Zuständen. Für die Chemie interessant sind nun genau diese Abschirmungen, da sie charakteristisch für die chemische Umgebung um einen Kern und damit die chemische Struktur sind. Im einfachsten Fall eines 1D-NMR-Experiments wird die Probe in ein externes Magnetfeld gebracht und einer elektromagnetischen Strahlung ausgesetzt. Dabei wird die Frequenz der Strahlung kontinuierlich verändert. Diejenigen Frequenzen, bei denen Absorption eintritt, werden als Resonanzfrequenzen bezeichnet.
Die Resonanzfrequenzen haben dann genau die Energie, die nötig ist um einen Kernspin von einer Orientierung in eine andere zu versetzen. Im Allgemeinen werden aber nicht
die absoluten Resonanzfrequenzen angegeben, da diese magnetfeldabhängig sind, son-dern die Abweichungen der Energieunterschiede eines Atomkerns von einer Referenz. Als Referenzsubstanz wird meist Tetramethylsilan eingesetzt. Die Abweichung gegen diese Referenz wird dann als chemische Verschiebung δ bezeichnet und errechnet sich wie folgt: δ = νProbeνReferenz−νReferenz. Hierbei bezeichnet ν die Resonanzfrequenzen der Probe bezie-hungsweise der Referenz. Die chemische Verschiebung ist somit dimensionslos. Um aber handlichere Werte zu erhalten wird die chemische Verschiebung in der Praxis mit einem Wert von106 multipliziert und erhält dann die Einheit ppm. Auf weitere Details und ei-ne tiefergehende Theorie sei an dieser Stelle verzichtet und auf die gängigen Lehrbücher, wie zum Beispiel [10], verwiesen.
Da, wie gerade beschrieben, die chemischen Verschiebungen von der molekularen Um-gebung abhängen, können deren Messungen umgekehrt dazu verwendet werden, die mo-lekulare Struktur aufzuklären. Für kleine Moleküle reichen dabei 1D-Spektren aus, aus denen die Konstitution und im Idealfall auch die relative Konfiguration abgeleitet werden können. Für größere Moleküle kommt der Konformation eine immer entscheidendere Be-deutung zu. Bei sehr großen Systemen wie Proteinen, ist nicht nur die Sequenz der Ami-nosäuren, die sogenannte Primärstruktur, von Bedeutung. Insbesondere für die Funkti-onsweise spielt die räumliche Orientierung der Aminosäuren, die sogenannte Sekundär-und Tertiärstruktur, eine entscheidende Rolle. Um die Funktionsweise eines Proteins zu verstehen und die Dynamik eines Proteins untersuchen zu können, ist daher die vorherige Bestimmung der Struktur erforderlich. Die räumliche Struktur kann mittels NMR-Spektren gelöst werden. So gibt es zahlreiche sogenannte sequentielle Spektren aus denen bestimmt werden kann, welche Atome miteinander verknüpft sind. Mit Hilfe dieser Spektren kann die Primärstruktur des Proteins bestimmt werden und es kön-nen die chemischen Verschiebungen den einzelkön-nen Atomen zugeordnet werden. Mit Hilfe von räumlichen Spektren können sogenannte Restraints aufgestellt werden, die Aussa-gen darüber treffen wie nahe sich zwei Atome räumlich kommen. Hierbei sind besonders zwei Spektren interessant. Zum einen sind das NOESY-Spektren. Diese beruhen auf dem Kern-Overhauser-Effekt [10, 47], dessen Signale umso intensiver sind, je näher sich zwei Atome kommen. Hierbei skaliert die Signalintensität in sechster Potenz zum reziproken Abstand der beiden Atome, das heißt das Volumen steigt in sechster Potenz, je näher sich die beiden Atome kommen. Die andere Klasse sind sogenannte RDC-Spektren. RDC steht fürresidual dipolar couplings. Bei RDC-Spektren wird eine anisotrope Umgebung erzeugt, zum Beispiel durch Einbringen in eine Flüssigkristallphase. Wird ein Spektrum in dieser nicht mehr homogen orientierten Umgebung aufgenommen, können Aussagen darüber getroffen werden, in welchem Winkel sich eine Bindung zwischen zwei Atomen zur durch die Flüssigkristalle vorgegebenen Struktur orientiert. Daraus können dann Restraints für die Diederwinkel des Proteins abgeleitet werden.
2.2. Berechnung chemischer Verschiebungen in Proteinen
Aus der bekannten 3D-Struktur können die chemischen Verschiebungen des Proteins vorausgesagt werden. Hierbei gibt es prinzipiell zwei verschiedene Ansätze. Der erste Ansatz sind die empirischen Methoden. Diese basieren auf der statistischen Analyse von Datenbanken, in denen chemische Verschiebungen von Proteinen mit bekannter 3D-Struktur gespeichert sind. Hierbei gibt es zum einen die strukturbasierten Methoden zu denen zum Beispiel die Programme SHIFTX [48], SHIFTX+ aus SHIFTX2 [49], SPAR-TA+ [50] und SHIFTS [51, 52] gehören. Dabei wird das gegebene Strukturelement, das heißt die das vorauszusagende Atom umgebenden Atome und die von dem Atom aus-gehenden Bindungen, mit denen der in der Datenbank gespeicherten Strukturelementen verglichen um daraus die chemische Verschiebung vorauszusagen. Der andere empirsche Ansatz sind die sequenzbasierten Methoden, wie zum Beispiel in SHIFTY [53] oder SHIFTY+ aus SHIFTX2 [49] umgesetzt. Dabei wird ausgenutzt, dass Proteine aus nur wenigen Aminosäuren bestehen, die als Bausteine begriffen werden können. Dabei wird die Sequenz, also die Abfolge der Aminosären, mit Datenbankeinträgen verglichen und so eine chemische Verschiebung ermittelt. Falls die chemischen Verschiebungen eines Proteins vorausgesagt werden sollen, welches dazu verwendet wurde, diese Datenbank zu erstellen, werden hierbei natürlich genau diese chemischen Verschiebungen erhalten.
Daher sollten solche Ergebnisse nicht zur Bewertung der Qualität von sequenzbasierten Ansätzen berücksichtigt werden. Der entscheidende Vorteil der empirischen Methoden ist, dass diese die chemischen Verschiebungen sehr schnell voraussagen können, da hier-für nur Datenbanken abgerufen werden müssen. Ein Nachteil ist jedoch, dass Ausreißer, die so in der Datenbank nicht vorhanden sind, nur unzureichend beschrieben werden können. Um auch solche Ausreißer voraussagen zu können, eignen sich die ab-initio Me-thoden. Diese können einzig aus den Koordinaten und dem Atomtyp die chemischen Verschiebungen berechnen. Gravierender Nachteil der quantenmechanischen Methoden ist die lange Rechenzeit. Einerseits steigt die Rechenzeit umso stärker an, je genauer die Ergebnisse erhalten werden sollen und andererseits skalieren diese Methoden mit der Größe des Systems in 3. bis 6. Potenz. Das bedeutet, dass bei einer Verdoppelung der Systemgröße die Rechenzeit auf das 8 bis 64-fache ansteigt. Dies ist natürlich insbeson-dere für Proteine, die sehr große Systeme darstellen, nicht praktikabel. NMR chemische Verschiebungen hängen aber im Wesentlichen nur von der lokalen Umgebung ab. Wei-ter entfernte Bereiche haben nur einen geringen Einfluss auf die chemische Verschiebung eines Atoms. Es genügt daher meistens die lokale Umgebung des zu untersuchenden Sys-tems in die Berechnung mit einfließen zu lassen. Dies führte zur Verwendung fragment-basierter Ansätze, wie zum Beispiel dem im folgenden Unterkapitel 2.3 beschriebenen ADMA-Ansatz [54–57]. Ein weiterer Ansatz ist derjenige von Jacob und Visscher [58], die die Berechnung von Cα chemischen Verschiebungen untersuchten und davon aus-gehen, dass die chemischen Verschiebungen im wesentlichen von der Sekundärstruktur des Proteins abhängen, so dass die Hinzunahme weiter entfernter Aminosäuren als der benachbarten nur noch einen geringen Einfluss haben. Umgesetzt haben sie dies mit
einemfrozen embedding potential, wie es ursprünglich von Wesolowski und Warshal [59]
vorgestellt wurde. Außerdem sind in diesem Zusammenhang auch die beiden fragment-basierten Ansätze von Lee und Bettens [60] sowie von He, Wang und Merz [61] zu erwähnen.
2.3. Der ADMA-Ansatz
Das ADMA-Verfahren (Adjustable Density Matrix Assembler) [54–57] ist ein fragment-basiertes Verfahren mit der Elektronendichtematrix als zentraler Größe. Mit dieser las-sen sich molekulare Eigenschaften wie die Gesamtenergie berechnen. Der Fragmentie-rungsansatz kann dabei auch für die quantenmechanische Berechnung NMR-chemischer Verschiebungen genutzt werden. [62–64] Zunächst wird ein zu untersuchendes Makromo-lekül in eine Vielzahl von kleinen sich nicht überschneidenden Fragmenten zerteilt. Klein bedeutet hier nicht mehr als etwa 20 Atome. Aus den Fragmenten werden sogenannte parent molecules konstruiert, indem den Fragmenten noch eine Umgebung hinzugefügt wird. Dazu wird ein Umgebungsradius definiert und alle sich in diesem Umgebungsra-dius befindlichen Atome werden dem Fragment als Umgebung hinzugefügt. Da hierbei kovalente Bindungen gebrochen wurden, werden an diese Stellen am Rand der parent molecules Wasserstoffatome gesetzt, um die formale Enstehung von Radikalen zu ver-meiden. In Abbildung 2.1 ist dies exemplarisch für zwei benachbarte Fragmente an dem Tryptophan Cage, einem kleinen künstlich konstruierten Miniprotein [65], gezeigt. In grün sind die beiden Fragmente und in rot die das Fragment umgebenden Atome im pa-rent molecule zu sehen. Als Umgebungsradius wurde hierbei ein Wert von 3 Å verwendet.
Je größer der Umgebungsradius gewählt wird, desto besser werden die Ergebnisse, die
Abbildung 2.1.: Zwei benachbarte Fragmente, grün, mit ihrer Umgebung, rot aus den quantenmechanischen Berechnungen der Fragmente resultieren. Die Berechnung dauert aber auch umso länger, je größer das Fragment gewählt wird. Im Grenzfall eines unendlichen großen Radius entspricht jedesparent molecule gerade dem Makromolekül.
Dann wird zwar die maximale Genauigkeit erreicht, der Zeitvorteil gegenüber dem Stan-dardverfahren geht aber verloren. Wird der Umgebungsradius zu klein gewählt, werden
die Ergebnisse zu ungenau, da dann zu viele Wechselwirkungen vernachlässigt werden.
Daher ist erforderlich, den Umgebungsradius so einzustellen, dass sowohl die Geschwin-digkeit als auch die Genauigkeit der Rechnung akzeptabel sind. Die NMR-chemischen Verschiebungen hängen von der lokalen Abschirmung des Magnetfeldes durch die Elek-tronenstruktur ab. Da diese Abschirmung im Wesentlichen aus den die das Atom direkt umgebenden Elektronen resultiert, genügt hierfür ein Umgebungsradius von 5 Å [62–64].
Für Proteine als Makromoleküle erfolgt die Fragmentierung anhand der Aminosäuren-sequenz. Die beiden kleinsten Aminosäuren Glycin und Alanin werden als ein Fragment behandelt. Bei allen anderen Aminosäuren wird sowohl die Seitenkette als auch das Rückgrat als ein separates Fragment behandelt. Die NMR-chemischen Verschiebungen werden dann aus den Berechnungen der parent molecules entnommen. Bei geeigneter Wahl der verwendeten Theorie und des verwendeten Basissatzes können Genauigkeiten vergleichbar mit empirischen Modellen erhalten werden. [49, 50, 62, 63]
2.4. Mehrdimensionale NMR-Spektren
Bei eindimensionalen NMR-Spektren wird entlang der x-Achse die chemische Verschie-bung und entlang der y-Achse die Intensität eines Signals gemessen. Je mehr Atome ein Molekül enthält, desto mehr Signale erscheinen auch im Spektrum. Auf Grund der begrenzten Auflösung sind die einzelnen Linien nicht unendlich schmal, so dass es bei vielen Signalen zu Überlagerungen mehrerer Signale kommt, die dann nicht mehr aufzu-lösen sind. Insbesondere bei NMR-Spektren von Proteinen wird dies zum Problem, da sich hier nicht nur einzelne Signale überlagern, sondern sogar die meisten Signale über-lagert erscheinen. Der Nutzen eines solchen Spektrums ist daher sehr begrenzt. Um dem Abhilfe zu schaffen, muss ein solches Spektrum in eine weitere Dimension aufgespalten werden.
Ein eindimensionales NMR-Experiment besteht standardmäßig aus zwei Phasen: Einer Anregungsphase folgt eine Detektionsphase. Vereinfacht gesagt gilt, dass in der Anre-gungsphase durch einen Impuls eine Vielzahl an Kernspins in ihrer Orientierung geändert werden und in der Detektionsphase dann die Frequenzen gemessen werden, die die Probe aussendet, wenn sich die Kernspins wieder in ihre Ausgangsorientierung zurück orien-tieren. Bei zweidimensionalen NMR-Experimenten wird zwischen die Anregungsphase und die Detektionsphase noch die Evolutions- und Mischphase eingebaut. Die Evoluti-onsphase ist dabei eine variable Wartezeit und die Mischphase eine konstante Wartezeit.
Für die Aufnahme eines zweidimensionalen Spektrums wird nun eine Vielzahl eindi-mensionaler Spektren aufgenommen, wobei hierfür die Wartezeit der Evolutionsphase iterativ von Null bis auf einen Endwert erhöht wird. Meist werden dabei die von den
13C- oder 15N-Kernen ausgesendeten Frequenzen detektiert. Wichtig ist, dass während der Entwicklungszeit keine Entkopplung zu den1H Kernen stattfindet. Auf diese Weise koppeln die Protonen unterschiedlich, je nachdem wie lange die Evolutionszeit gewählt.
Die Intensität des Kohlenstoffs oder Stickstoffs hängt dann von der Kopplung zu den Protonen ab. Am Ende werden nun alle diese einzelnen Spektren nebeneinander gelegt.
Auf diese Weise kann dann entlang dieser zusätzlichen Dimension, in der diese einzelnen
Spektren gelegt wurden, eine zusätzliche Frequenzdimension erhalten werden. Üblicher-weise geht man dann so vor, dass entlang der x-Achse die gemessene Frequenz gelegt wird und die einzelnen Spektren entlang dery-Achse ausgebreitet werden. Die Intensität wird dann auf diez-Achse gelegt. Bei diesen zweidimensionalen Spektren kommt es dann nur noch in Einzelfällen zur Überlagerung von Signalen. Für weiterführende Details sei auf die entsprechenden Lehrbücher, wie zum Beispiel [10], verwiesen.
2.5. HSQC-Spektren
Das HSQC-Spektrum ist das einfachste und am meisten verwendete zweidimensionale Spektrum für die NMR-Spektroskopie an Proteinen. HSQC steht hierbei für heteronucle-ar single quantum coherence. Hierbei werden zwei verschiedene Kerne, üblicherweise 1H und13Coder1H und15Nmiteinander korreliert. Üblicherweise wird entlang derx-Achse die Wasserstoffdimension und entlang dery-Achse die Kohlenstoff- oder Stickstoffdimen-sion aufgetragen. Bei der Aufnahme eines HSQC-Spektrums wird die Magnetisierung von einem Wasserstoffkern auf einen benachbarten Kohlenstoff- oder Stickstoffkern übertra-gen, von wo aus diese in einem zweiten Schritt zurück auf die Protonen übertragen wird. [10] Auf diese Weise sind die chemischen Verschiebungen von Wasserstoffen und Kohlenstoffen beziehungsweise Stickstoffen miteinander verknüpft. Im Spektrum erschei-nen dann nur die CH- beziehungsweise NH-Gruppen, also solche Gruppen, wo an eierschei-nen Kohlenstoff beziehungsweise einen Stickstoff direkt ein Wasserstoff gebunden ist. Die Si-gnale erscheinen dann auf derx-Achse bei der entsprechenden chemischen Verschiebung des Wasserstoffs und auf der y-Achse bei der entsprechenden chemischen Verschiebung des Kohlenstoffs oder des Stickstoffs.