4. Zuordnung basierend auf 1 H 15 N-4D-NOESY-Spektren 34
4.3.4. Bewertung der mehrdeutigen Zuordnungsmöglichkeiten
Wie im vorigen Kapitel beschrieben kann es dazu kommen, dass es einige mehrdeuti-ge Zuordnungsmöglichkeiten gibt, die nicht nur aus der Möglichkeit der Vertauschung zweier benachbarter Amidgruppen in einem Hairpin resultieren. Für diese Möglichkeiten wurden bei der Optimierung durchaus einige Informationen gefunden. In diesem Kapitel sollen nun zwei Ansätze untersucht werden, wie die vorhandene Informationen genutzt werden können, um die aus der finalen Zuordnungsmöglichkeit vorhandenen Mehrdeu-tigkeiten weiter aufzulösen, mehrere eindeutige Zuordnungsmöglichkeiten zu erhalten und diese zu bewerten. Zunächst sollen die Restraints nicht nur als maximale Beschrän-kung aufgefasst werden, sondern deren Längen mit den Abständen der Amidgruppen in der verwendeten 3D-Struktur verglichen werden. Der zweite Ansatz basiert auf dem Vergleich mit berechneten chemischen Verschiebungen. Hierzu sollen aber nicht wie im Kapitel 3 die chemischen Verschiebungen genutzt werden, um die Signale den
Amidgrup-pen einzeln zuzuordnen, sondern es sollen mehrere eindeutige Zuordnungen als ganzes miteinander verglichen werden.
Als erster Schritt wird aus den aus der Optimierung erhaltenen mehrdeutigen Zuord-nungsmöglichkeiten eine Liste aller möglichen eindeutigen Zuordnungen erstellt. Dieser Schritt ist notwendig, da die verbleibenden Zuordnungsmöglichkeiten nicht voneinan-der unabhängig sind. Man betrachte als Beispiel das Helixproblem beim Enzym I im vorherigen Kapitel. Dort gibt es für die C-terminale Helix 27 Amidgruppen die jeweils zwei oder teilweise auch drei verbleibende Zuordnungsmöglichkeiten haben. Dies führt aber nicht zu 227 verschiedenen Möglichkeiten, sondern zunächst nur zu zwei, nämlich beginnend mit Thr232 und dann aufsteigend oder beginnend mit Arg259 und dann ab-steigend. Desweiteren kommen dann noch einzelne Möglichkeiten dazu, bei denen es möglich ist, zwei Amidgruppen zu vertauschen und immer noch alle Restraints zu erfül-len. In der Gesamtzahl ergibt dies aber weit weniger als die kombinatorische Zahl von 227 Möglichkeiten. Für jede einzelne dieser eindeutigen Zuordnungsmöglichkeiten wird dann ein Kriterium berechnet, welches die Wahrscheinlichkeit repräsentieren soll, dass diese Zuordnung die richtige ist.
Bisher wurden die Restraints nur als Maximalwerte angesehen und es wurde nicht unterschieden, ob ein Restraint gerade so erfüllt ist oder ob der Restraint doppelt oder dreimal so lang ist wie der Abstand in der 3D-Struktur. Sei nun der Fall betrachtet in dem zwei Amidgruppen zwei Signalen so zugeordnet werden, dass ein langer und ein kurzer Restraint ausgehend von einer dritten Amidgruppe jeweils einmal auf die eine und einmal auf die andere Amidgruppe zeigt: Bisher wird nicht unterschieden, welche der beiden Zuordnungsmöglichkeiten wahrscheinlicher ist, solange in beiden Fällen die Abstände kürzer als die Restraints sind. Im Allgemeinen kann aber die Annahme getroffen werden, dass derjenige Fall, in dem der längere Restraint den längeren Abstand und der kürzere Restraint den kürzeren Abstand beschreibt, wahrscheinlicher ist als der umgekehrte Fall.
Ausgeschlossen wird der zweite Fall nur dann, wenn der kürzere Restraint verletzt wird.
Um erhaltene Möglichkeiten an Hand ihrer Restraints zu bewerten wird jeweils vom Restraint zuzüglich Sicherheitszuschlag (standardmäßig0,2Å ) der aus der 3D-Struktur berechnete Abstand abgezogen. Die erhaltenen Abweichungen werden quadriert und auf-summiert. Die Quadratur soll besonders große Abweichungen von Restraint und Abstand in der 3D-Struktur besonders nachteilig behandeln. Zunächst wurde dies an dem erhalte-nen, noch mehrdeutigen Ergebnis der Optimierung des Ubiquitin aus dem Unterkapitel 4.3.2 getestet. Die am besten bewerteten Möglichkeiten sind in Tabelle 4.6 gezeigt. Da es vom Signal, welches zur Amidgruppe des Glu24 gehört, keine Restraints gibt, ergibt sich auch keine schlechtere Bewertung, wenn diesem Signal die Amidgruppe des Gly53 zugeordnet wird, da diese kein HSQC- und NOESY-Signal zeigt. Neben dieser fehlen-den experimentellen Unterscheidbarkeit sind alle Signale, bis auf die beifehlen-den Signale der Amidgruppen des Leu73 und des Arg74 am C-Terminus, jeweils den richtigen Amid-gruppen zugeordnet. Da der C-Terminus ins Lösemittel zeigt und an dieser Stelle einen Hairpin bildet, kann hier auch von einer größeren Flexibilität ausgegangen werden, so dass es nicht überrascht, dass diese beiden Amidgruppen nur anhand ihrer Restraints nicht korrekt zuzuordnen sind. Trotzdem konnte mit dieser zusätzlichen Bewertung eine
Steigerung von 63 eindeutig zugeordneten Signalen auf jetzt 69 bis 70 korrekt zugeord-nete Signale erreicht werden.
Tabelle 4.6.: Übersicht über die am besten bewerteten eindeutigen Zuordnungen des Ubiquitins bei einer Bewertung mittels Aufsummierung der quadratischen Abweichungen der Restraints. In grün sind die richtigen Zuordnungen und in rot die falschen Zuordnungen dargestellt.
527.0 Q2 I3 F4 V5 K6 T7 L8 T9 G10 K11 T12 I13 T14 L15 E16 V17 E18 S20 D21 T22 I23 G53 N25 V26 K27 A28 K29 I30 Q31 D32 K33 E34 G35 I36 D39 Q40 Q41 R42 L43 I44 F45 A46 G47 K48 Q49 L50 E51 D52 R54 T55 L56 S57 D58 Y59 N60 I61 Q62 K63 E64 S65 T66 L67 H68 L69 V70 L71 R72R74 L73G75 G76
527.0 Q2 I3 F4 V5 K6 T7 L8 T9 G10 K11 T12 I13 T14 L15 E16 V17 E18 S20 D21 T22 I23 E24 N25 V26 K27 A28 K29 I30 Q31 D32 K33 E34 G35 I36 D39 Q40 Q41 R42 L43 I44 F45 A46 G47 K48 Q49 L50 E51 D52 R54 T55 L56 S57 D58 Y59 N60 I61 Q62 K63 E64 S65 T66 L67 H68 L69 V70 L71 R72R74 L73G75 G76
531.6 Q2 I3 F4 V5 K6 T7 L8G10 T9K11 T12 I13 T14 L15 E16 V17 E18 S20 D21 T22 I23 G53 N25 V26 K27 A28 K29 I30 Q31 D32 K33 E34 G35 I36 D39 Q40 Q41 R42 L43 I44 F45 A46 G47 K48 Q49 L50 E51 D52 R54 T55 L56 S57 D58 Y59 N60 I61 Q62 K63 E64 S65 T66 L67 H68 L69 V70 L71 R72R74 L73G75 G76
531.6 Q2 I3 F4 V5 K6 T7 L8G10 T9K11 T12 I13 T14 L15 E16 V17 E18 S20 D21 T22 I23 E24 N25 V26 K27 A28 K29 I30 Q31 D32 K33 E34 G35 I36 D39 Q40 Q41 R42 L43 I44 F45 A46 G47 K48 Q49 L50 E51 D52 R54 T55 L56 S57 D58 Y59 N60 I61 Q62 K63 E64 S65 T66 L67 H68 L69 V70 L71 R72R74 L73G75 G76
539.4 Q2 I3 F4 V5 K6 T7 L8 T9 G10 K11 T12 I13 T14 L15 E16 V17 E18 S20 D21 T22 I23 E24 N25 V26 K27 A28 K29 I30 Q31 D32 K33 E34 G35 I36 D39 Q40 Q41 R42 L43 I44 F45 A46 G47 K48 Q49 L50 E51 G53 R54 T55 L56 S57 D58 Y59 N60 I61 Q62 K63 E64 S65 T66 L67 H68 L69 V70 L71 R72 R74 L73 G75 G76
539.4 Q2 I3 F4 V5 K6 T7 L8 T9 G10 K11 T12 I13 T14 L15 E16 V17 E18 S20 D21 T22 I23 D52N25 V26 K27 A28 K29 I30 Q31 D32 K33 E34 G35 I36 D39 Q40 Q41 R42 L43 I44 F45 A46 G47 K48 Q49 L50 E51 G53 R54 T55 L56 S57 D58 Y59 N60 I61 Q62 K63 E64 S65 T66 L67 H68 L69 V70 L71 R72R74 L73G75 G76
Des weiteren wurde noch das mehrdeutige Ergebnis des Enzyme I aus dem vorheri-ge Unterkapitel 4.3.3 untersucht und entsprechend bewertet. Hierbei fielen insbesondere Probleme mit den beiden Helices im Bereich von Gly184 bis Leu199 und am C-Terminus von Thr232 bis Arg259 auf. Durch die beschriebenen vielen Mehrdeutigkeiten an den beiden Helices und einige Hairpins ergibt sich eine kombinatorische Zahl von 8,7·1022 verbleibenden eindeutigen Zuordnungsmöglichkeiten nach Abschluss der Optimierung.
Wird für jede dieser Möglichkeiten überprüft, ob diese alle Restraints erfüllen bleiben noch4,6·106 Möglichkeiten übrig. Diese verbleibenden Möglichkeiten wurden jetzt mit-tels der Aufsummierung der quadratischen Abweichungen der Restraints von den zuge-hörigen Abständen in der 3D-Struktur verglichen. Die am besten bewerteten Ergebnisse sind in Tabelle 4.7 dargestellt. Weitere Ergebnisse sind im Anhang aufgeführt. Da das
Tabelle 4.7.: Übersicht über die am besten bewerteten eindeutigen Zuordnungen des Enyzme I bei einer Bewertung mittels Aufsummierung der quadratischen Abweichungen der Restraints. In grün sind die richtigen Zuordnungen und in rot die falschen Zuordnungen dargestellt.
1989.3 T187S3 G4L6 I5A7 S8 G10 I11 A12 F13 G14 K15 A16 L17 L18 L19 K20 E21 D22 E23 I24 V25 I26 D27 R28 K29 K30 I31 S32 A33 D34 Q35 V36 D37 Q38 E39 V40 E41 R42 F43 L44 S45 G46 R47 A48 K49 A50 S51 A52 Q53 L54 E55 T56 I57 K58 T59 K60 A61 G62 E63 T64 F65 G66 E67 E68 K69 E70 A71 I72 F73 E74 G75 H76 I77 M78 L79 L80 E81 D82L85 E83 E84E86 Q87 E88 I89 I90 A91 L92 I93 K94 D95 K96 H97 M98 T99 A100 D101 A102 A103 A104 H105 E106 V107 I108 E109 G110 Q111 A112 S113 A114 L115 E116 E117 L118 D119 D120 E121 Y122 L123 K124 E125 R126 A127D129 V130 A128I131 D132 I133 G134 K135 R136 L137 L138 R139 N140 I141 L142 G143 L144 K145 I146 I147 D148 L149 S150 A151 I152 Q153 D154 E155 V156 I157 L158 V159 A160 A161 D162 L163 T164 S166 E167 T168 A169 Q170 L171 N172 L173 K174 K175 V176 L177 G178 F179 I180 T181 D182 A183G185 S191 H189 S188T190 I192 M193 A194 R195 S196 L197 E198 L199 A201 I202 V203 G204 T205 G206 S207 V208 T209 S210 Q211 V212 K213 N214 D215 D216 Y217 L218 I219 L220 D221 A222 V223N225 N224Q226 V227 Y228 V229 N230 T232 N233 E234 V235 I236 D237 K238 M239 R240 A241 V242 Q243 E244 Q245 V246S248 A247E249 K250 A251 E252 L253 A254 K255 L256 K257R259 D258
1989.3 R186S3 G4L6 I5A7 S8 G10 I11 A12 F13 G14 K15 A16 L17 L18 L19 K20 E21 D22 E23 I24 V25 I26 D27 R28 K29 K30 I31 S32 A33 D34 Q35 V36 D37 Q38 E39 V40 E41 R42 F43 L44 S45 G46 R47 A48 K49 A50 S51 A52 Q53 L54 E55 T56 I57 K58 T59 K60 A61 G62 E63 T64 F65 G66 E67 E68 K69 E70 A71 I72 F73 E74 G75 H76 I77 M78 L79 L80 E81 D82L85 E83 E84E86 Q87 E88 I89 I90 A91 L92 I93 K94 D95 K96 H97 M98 T99 A100 D101 A102 A103 A104 H105 E106 V107 I108 E109 G110 Q111 A112 S113 A114 L115 E116 E117 L118 D119 D120 E121 Y122 L123 K124 E125 R126 A127D129 V130 A128I131 D132 I133 G134 K135 R136 L137 L138 R139 N140 I141 L142 G143 L144 K145 I146 I147 D148 L149 S150 A151 I152 Q153 D154 E155 V156 I157 L158 V159 A160 A161 D162 L163 T164 S166 E167 T168 A169 Q170 L171 N172 L173 K174 K175 V176 L177 G178 F179 I180 T181 D182 A183G185 S191 H189 S188T190 I192 M193 A194 R195 S196 L197 E198 L199 A201 I202 V203 G204 T205 G206 S207 V208 T209 S210 Q211 V212 K213 N214 D215 D216 Y217 L218 I219 L220 D221 A222 V223N225 N224Q226 V227 Y228 V229 N230 T232 N233 E234 V235 I236 D237 K238 M239 R240 A241 V242 Q243 E244 Q245 V246S248 A247E249 K250 A251 E252 L253 A254 K255 L256 K257R259 D258
1989.3 G184S3 G4L6 I5A7 S8 G10 I11 A12 F13 G14 K15 A16 L17 L18 L19 K20 E21 D22 E23 I24 V25 I26 D27 R28 K29 K30 I31 S32 A33 D34 Q35 V36 D37 Q38 E39 V40 E41 R42 F43 L44 S45 G46 R47 A48 K49 A50 S51 A52 Q53 L54 E55 T56 I57 K58 T59 K60 A61 G62 E63 T64 F65 G66 E67 E68 K69 E70 A71 I72 F73 E74 G75 H76 I77 M78 L79 L80 E81 D82L85 E83 E84E86 Q87 E88 I89 I90 A91 L92 I93 K94 D95 K96 H97 M98 T99 A100 D101 A102 A103 A104 H105 E106 V107 I108 E109 G110 Q111 A112 S113 A114 L115 E116 E117 L118 D119 D120 E121 Y122 L123 K124 E125 R126 A127D129 V130 A128I131 D132 I133 G134 K135 R136 L137 L138 R139 N140 I141 L142 G143 L144 K145 I146 I147 D148 L149 S150 A151 I152 Q153 D154 E155 V156 I157 L158 V159 A160 A161 D162 L163 T164 S166 E167 T168 A169 Q170 L171 N172 L173 K174 K175 V176 L177 G178 F179 I180 T181 D182 A183G185 S191 H189 S188T190 I192 M193 A194 R195 S196 L197 E198 L199 A201 I202 V203 G204 T205 G206 S207 V208 T209 S210 Q211 V212 K213 N214 D215 D216 Y217 L218 I219 L220 D221 A222 V223N225 N224Q226 V227 Y228 V229 N230 T232 N233 E234 V235 I236 D237 K238 M239 R240 A241 V242 Q243 E244 Q245 V246S248 A247E249 K250 A251 E252 L253 A254 K255 L256 K257R259 D258
1989.3 I2 S3 G4 L6 I5 A7 S8 G10 I11 A12 F13 G14 K15 A16 L17 L18 L19 K20 E21 D22 E23 I24 V25 I26 D27 R28 K29 K30 I31 S32 A33 D34 Q35 V36 D37 Q38 E39 V40 E41 R42 F43 L44 S45 G46 R47 A48 K49 A50 S51 A52 Q53 L54 E55 T56 I57 K58 T59 K60 A61 G62 E63 T64 F65 G66 E67 E68 K69 E70 A71 I72 F73 E74 G75 H76 I77 M78 L79 L80 E81 D82L85 E83 E84E86 Q87 E88 I89 I90 A91 L92 I93 K94 D95 K96 H97 M98 T99 A100 D101 A102 A103 A104 H105 E106 V107 I108 E109 G110 Q111 A112 S113 A114 L115 E116 E117 L118 D119 D120 E121 Y122 L123 K124 E125 R126 A127D129 V130 A128I131 D132 I133 G134 K135 R136 L137 L138 R139 N140 I141 L142 G143 L144 K145 I146 I147 D148 L149 S150 A151 I152 Q153 D154 E155 V156 I157 L158 V159 A160 A161 D162 L163 T164 S166 E167 T168 A169 Q170 L171 N172 L173 K174 K175 V176 L177 G178 F179 I180 T181 D182 A183G185 S191 H189 S188T190 I192 M193 A194 R195 S196 L197 E198 L199 A201 I202 V203 G204 T205 G206 S207 V208 T209 S210 Q211 V212 K213 N214 D215 D216 Y217 L218 I219 L220 D221 A222 V223N225 N224Q226 V227 Y228 V229 N230 T232 N233 E234 V235 I236 D237 K238 M239 R240 A241 V242 Q243 E244 Q245 V246S248 A247E249 K250 A251 E252 L253 A254 K255 L256 K257 R259 D258
Signal, welches zur Amidgruppe des Ile2 gehört, keine Restraints zeigt, kann hier nicht entschieden werden, ob es zu einer der drei Amidgruppen gehört die keine Signale in den HSQC- und NOESY-Spektren zeigen. Daher besitzen die besten vier Ergebnisse exakt die gleiche Bewertung. Bei diesem Ergebnis wird die C-terminale Helix bis auf zweimal jeweils zwei Amidgruppen richtig zugeordnet. Es ist somit gelungen die Richtung der He-lix korrekt zuzuordnen. Bei der zweiten HeHe-lix ist dies für den zweiten Teil der HeHe-lix von Thr190 bis Leu199 ebenfalls gelungen. Lediglich der kleinere vordere Teil wurde nicht richtig aufgelöst, da hier die Amidgruppe des Gly184 als fehlend statt der tatsächlich fehlenden Amidgruppe des Ser191 angenommen wurde. Allerdings führt dies zu nur vier falsch zugeordneten Signalen. Neben den beschriebenen beiden Helices wurden vier Hair-pins falsch aufgelöst und die restlichen Signale korrekt zugeordnet. Insgesamt konnte mit diesem Ansatz aus dem Ergebnis der Optimierung, bei dem 191 Signale eindeutig und 60 mehrdeutig zugeordnet waren, jetzt 235 Signale richtig zugeordnet werden. Zudem konnte die Richtung der Helix mit großer Sicherheit vorausgesagt werden, da die erste Möglichkeit, bei der die Helix in umgekehrter Reihenfolge vorkommt, nur mit Platz 792 bewertet wird.
Der zweite Ansatz beruht auf berechneten chemischen Verschiebungen. Bisher wur-de kein Unterschied gemacht, ob es wahrscheinlicher ist, einem Signal zum Beispiel ein Glycin oder ein Lysin zuzuordnen. Da diese beiden sich aber in der Seitenkette deut-lich unterscheiden, ist zu erwarten, dass sie auch verschiedene chemische Verschiebungen besitzen. Auch wenn die derzeitig verfügbaren Programme zur Berechnung chemischer Verschiebungen, wie in der Einleitung in Kapitel 1 und im Theorieteil in Kapitel 2 be-sprochen, aufgrund der zu erwartenden Fehler alleine nicht in der Lage sind, die Signale den Amidgruppen des Proteins zuzuordnen, können die erhaltenen chemischen Verschie-bungen durchaus genutzt werden. Im Gegensatz zur Zuordnung an Hand der berech-neten chemischen Verschiebungen, wie in Kapitel 3 beschrieben, soll nur eine Aussage getroffen werden, wie wahrscheinlich es ist, dass eine gewählte Zuordnungsmöglichkeit die richtige ist. Dazu werden die Abweichungen der berechneten chemischen Verschie-bungen für die bei der gewählten Zuordnungsmöglichkeit gegebenen Signale berechnet und deren Absolutwerte werden aufsummiert. Da sowohl der Bereich der chemischen Verschiebungen der Stickstoffe, als auch die Fehler der Stickstoffe deutlich größer sind als diejenigen der Wasserstoffe, wurden alle absoluten Differenzen der Wasserstoffe noch mit einem Faktor 10 multipliziert. Da sich die Qualität der verschiedene Methoden zur Berechnung chemischer Verschiebungen nicht sehr stark unterscheidet, die Zeit zur Be-rechnung der chemischen Verschiebungen bei quantenmechanischen Programmen aber um ein Vielfaches länger ist, wurden an dieser Stelle alle chemischen Verschiebungen nur mit dem empirischen, strukturbasierten Programm SHIFTX+ aus SHIFTX2 [49] berech-net. Auf die Verwendung von SHIFTY+ aus SHIFTTX2 wurde verzichtet, da bei der Erstellung dieses Programms Ubiquitin im Trainingsset [53] enthalten war, so dass deren Ergebnisse exakt den chemischen Verschiebungen des Ubiquitins entsprechen. Für das Ubiquitin wurden erneut, die im Unterkapitel 4.3.2 nach der Optimierung erhaltenen, mehrdeutigen Zuordnungsmöglichkeiten verwendet. Bezogen auf die richtige Zuordnung aller Signale ergab sich bei der Berechnung der chemischen Verschiebungen ein mittlerer Fehler von1,428 ppmfür die15N-Kerne und von0,251 ppmfür die1H-Kerne. Dies
unter-streicht die obige Aussage, dass es mit diesen berechneten chemischen Verschiebungen alleine nicht möglich sein wird, zwei Amidgruppen des gleichen Typs, wie zum Beispiel die Amidgruppen zweier Glycine oder zweier Alanine, voneinander zu unterscheiden. Die besten Ergebnisse für das Ubiquitin sind in Tabelle 4.8 zusammengefasst. Die erhaltenen Ergebnisse konnten sämtliche verbleibende mehrdeutigen Zuordnungsmöglichkeiten kor-rekt auflösen, so dass in der am besten bewerteten Zuordnungsmöglichkeit alle Signale korrekt zugeordnet wurden. Zudem kann hier im Falle des Ubiquitin gesagt werden, dass der erste Platz eine nennenswert bessere Bewertung als die folgenden Plätze besitzt. Im Gegensatz zur Aufsummierung der quadratischen Abweichungen der Restraints kann der ersten Platz mit einer gewissen Sicherheit als richtig angenommen werden.
Tabelle 4.8.: Übersicht über die am besten bewerteten eindeutigen Zuordnungen des Ubiquitins bei einer Bewertung mittels der Abweichungen berechneter che-mischer Verschiebungen von denen der Signale im Spektrum. In grün sind die richtigen Zuordnungen und in rot die falschen Zuordnungen dargestellt.
1230.3 Q2 I3 F4 V5 K6 T7 L8 T9 G10 K11 T12 I13 T14 L15 E16 V17 E18 S20 D21 T22 I23 E24 N25 V26 K27 A28 K29 I30 Q31 D32 K33 E34 G35 I36 D39 Q40 Q41 R42 L43 I44 F45 A46 G47 K48 Q49 L50 E51 D52 R54 T55 L56 S57 D58 Y59 N60 I61 Q62 K63 E64 S65 T66 L67 H68 L69 V70 L71 R72 L73 R74 G75 G76
1240.2 Q2 I3 F4 V5 K6 T7 L8 T9 G10 K11 T12 I13 T14 L15 E16 V17 E18 S20 D21 T22 I23 E24 N25 V26 K27 A28 K29 I30 Q31 D32 K33 E34 G35 I36 D39 Q40 Q41 R42 L43 I44 F45 A46 G47 K48 Q49 L50 E51 D52 R54 T55 L56 S57 D58 Y59 N60 I61 Q62 K63 E64 S65 T66 L67 H68 L69 V70 L71 R72R74 L73 G75 G76
1270.4 Q2 I3 F4 V5 K6 T7 L8 T9 G10 K11 T12 I13 T14 L15 E16 V17 E18 S20 D21 T22 I23 D52N25 V26 K27 A28 K29 I30 Q31 D32 K33 E34 G35 I36 D39 Q40 Q41 R42 L43 I44 F45 A46 G47 K48 Q49 L50 E51 G53 R54 T55 L56 S57 D58 Y59 N60 I61 Q62 K63 E64 S65 T66 L67 H68 L69 V70 L71 R72 L73 R74 G75 G76
1271.2 Q2 I3 F4 V5 K6 T7 L8 T9 G10 K11 T12 I13 T14 L15 E16 V17 E18 S20 D21 T22 I23 G53 N25 V26 K27 A28 K29 I30 Q31 D32 K33 E34 G35 I36 D39 Q40 Q41 R42 L43 I44 F45 A46 G47 K48 Q49 L50 E51 D52 R54 T55 L56 S57 D58 Y59 N60 I61 Q62 K63 E64 S65 T66 L67 H68 L69 V70 L71 R72 L73 R74 G75 G76
1280.4 Q2 I3 F4 V5 K6 T7 L8 T9 G10 K11 T12 I13 T14 L15 E16 V17 E18 S20 D21 T22 I23 D52N25 V26 K27 A28 K29 I30 Q31 D32 K33 E34 G35 I36 D39 Q40 Q41 R42 L43 I44 F45 A46 G47 K48 Q49 L50 E51 G53 R54 T55 L56 S57 D58 Y59 N60 I61 Q62 K63 E64 S65 T66 L67 H68 L69 V70 L71 R72R74 L73 G75 G76
Die vier am besten bewerteten Ergebnisse des Enzyme I aus dem Unterkapitel 4.3.3 sind in Tabelle 4.9 zusammengefasst. Weitere Ergebnisse sind im Anhang aufgeführt. In den besten Zuordnungen kommt es zu zwei Fehlern aufgrund von falsch angenommen Zuordnungen. Hierbei wurde die Amidgruppe des Ser191, die im Spektrum kein Signal zeigte, fälschlicherweise dem Signal der Amidgruppe des His189 und die Amidgruppe des His189 ihrerseits dem Signal der Amidgruppe des Ile2 zugeordnet. Die Amidgruppe des Ile2 wurde als fehlend angenommen. Neben diesen beiden Fehlern kam es nur zu zwei
falschen Zuordnungen: Den beiden Signalen der Amidgruppen Ile5 und Leu6 einerseits und den drei Signalen der Amidgruppen Ala128, Asp129 und Val130 andererseits. Im Gegensatz zum Ubiquitin sind die Bewertungen der ersten vier Plätze hier allerdings so ähnlich, dass sich die Bewertungszahl erst in der zweiten Nachkommastelle unterscheidet und daher als nicht signifikant betrachtet werden muss. Dies zeigt, dass Vertauschungen in kleinen Bereichen von Aminosäuren mit ähnlichen chemischen Eigenschaften nicht durch berechnete chemische Verschiebungen behoben werden können. Dies ist aber bei den Fehlern in den Berechnungsmethoden auch nicht zu erwarten. Die C-terminale Helix wurde mit großer Sicherheit richtig zugeordnet. Die Möglichkeit, die Helix anders herum zuzuordnen, gilt hier als ausgeschlossen, da die erste Zuordnungsmöglichkeit, bei der dies vorkommt auf Platz 315454, zu finden ist. Auch die zweite problematische Helix konnte bis auf die beschriebene Vertauschung des Signals der Amidgruppe His189 korrekt zugeordnet werden.
Tabelle 4.9.: Übersicht über die am besten bewerteten eindeutigen Zuordnungen des Enzyme I bei einer Bewertung mittels der Abweichungen berechneter che-mischer Verschiebungen von denen der Signale Spektrum. In grün sind die richtigen Zuordnungen und in rot die falschen Zuordnungen dargestellt
4933.0 H189S3 G4 I5 L6 A7 S8 G10 I11 A12 F13 G14 K15 A16 L17 L18 L19 K20 E21 D22 E23 I24 V25 I26 D27 R28 K29 K30 I31 S32 A33 D34 Q35 V36 D37 Q38 E39 V40 E41 R42 F43 L44 S45 G46 R47 A48 K49 A50 S51 A52 Q53 L54 E55 T56 I57 K58 T59 K60 A61 G62 E63 T64 F65 G66 E67 E68 K69 E70 A71 I72 F73 E74 G75 H76 I77 M78 L79 L80 E81 D82 E83 E84 L85 E86 Q87 E88 I89 I90 A91 L92 I93 K94 D95 K96 H97 M98 T99 A100 D101 A102 A103 A104 H105 E106 V107 I108 E109 G110 Q111 A112 S113 A114 L115 E116 E117 L118 D119 D120 E121 Y122 L123 K124 E125 R126 A127D129 A128V130 R131 D132 I133 G134 K135 R136 L137 L138 R139 N140 I141 L142 G143 L144 K145 I146 I147 D148 L149 S150 A151 I152 Q153 D154 E155 V156 I157 L158 V159 A160 A161 D162 L163 T164 S166 E167 T168 A169 Q170 L171 N172 L173 K174 K175 V176 L177 G178 F179 I180 T181 D182 A183 G184 G185 S188S191T190 I192 M193 A194 R195 S196 L197 E198 L199 A201 I202 V203 G204 T205 G206 S207 V208 T209 S210 Q211 V212 K213 N214 D215 D216 Y217 L218 I219 L220 D221 A222 V223 N224 N225 Q226 V227 Y228 V229 N230 T232 N233 E234 V235 I236 D237 K238 M239 R240 A241 V242 Q243 E244 Q245 V246 A247 S248 E249 K250 A251 E252 L253 A254 K255 L256 K257 D258 R259
4933.0 H189S3 G4 I5 L6 A7 S8 G10 I11 A12 F13 G14 K15 A16 L17 L18 L19 K20 E21 D22 E23 I24 V25 I26 D27 R28 K29 K30 I31 S32 A33 D34 Q35 V36 D37 Q38 E39 V40 E41 R42 F43 L44 S45 G46 R47 A48 K49 A50 S51 A52 Q53 L54 E55 T56 I57 K58 T59 K60 A61 G62 E63 T64 F65 G66 E67 E68 K69 E70 A71 I72 F73 E74 G75 H76 I77 M78 L79 L80 E81 D82 E83 E84 L85 E86 Q87 E88 I89 I90 A91 L92 I93 K94 D95 K96 H97 M98 T99 A100 D101 A102 A103 A104 H105 E106 V107 I108 E109 G110 Q111 A112 S113 A114 L115 E116 E117 L118 D119 D120 E121 Y122 L123 K124 E125 R126 A127D129 V130 A128R131 D132 I133 G134 K135 R136 L137 L138 R139 N140 I141 L142 G143 L144 K145 I146 I147 D148 L149 S150 A151 I152 Q153 D154 E155 V156 I157 L158 V159 A160 A161 D162 L163 T164 S166 E167 T168 A169 Q170 L171 N172 L173 K174 K175 V176 L177 G178 F179 I180 T181 D182 A183 G184 G185 S188S191T190 I192 M193 A194 R195 S196 L197 E198 L199 A201 I202 V203 G204 T205 G206 S207 V208 T209 S210 Q211 V212 K213 N214 D215 D216 Y217 L218 I219 L220 D221 A222 V223 N224 N225 Q226 V227 Y228 V229 N230 T232 N233 E234 V235 I236 D237 K238 M239 R240 A241 V242 Q243 E244 Q245 V246 A247 S248 E249 K250 A251 E252 L253 A254 K255 L256 K257 D258 R259
4933.0 H189S3 G4L6 I5A7 S8 G10 I11 A12 F13 G14 K15 A16 L17 L18 L19 K20 E21 D22 E23 I24 V25 I26 D27 R28 K29 K30 I31 S32 A33 D34 Q35 V36 D37 Q38 E39 V40 E41 R42 F43 L44 S45 G46 R47 A48 K49 A50 S51 A52 Q53 L54 E55 T56 I57 K58 T59 K60 A61 G62 E63 T64 F65 G66 E67 E68 K69 E70 A71 I72 F73 E74 G75 H76 I77 M78 L79 L80 E81 D82 E83 E84 L85 E86 Q87 E88 I89 I90 A91 L92 I93 K94 D95 K96 H97 M98 T99 A100 D101 A102 A103 A104 H105 E106 V107 I108 E109 G110 Q111 A112 S113 A114 L115 E116 E117 L118 D119 D120 E121 Y122 L123 K124 E125 R126 A127D129 A128V130 R131 D132 I133 G134 K135 R136 L137 L138 R139 N140 I141 L142 G143 L144 K145 I146 I147 D148 L149 S150 A151 I152 Q153 D154 E155 V156 I157 L158 V159 A160 A161 D162 L163 T164 S166 E167 T168 A169 Q170 L171 N172 L173 K174 K175 V176 L177 G178 F179 I180 T181 D182 A183 G184 G185 S188S191T190 I192 M193 A194 R195 S196 L197 E198 L199 A201 I202 V203 G204 T205 G206 S207 V208 T209 S210 Q211 V212 K213 N214 D215 D216 Y217 L218 I219 L220 D221 A222 V223 N224 N225 Q226 V227 Y228 V229 N230 T232 N233 E234 V235 I236 D237 K238 M239 R240 A241 V242 Q243 E244 Q245 V246 A247 S248 E249 K250 A251 E252 L253 A254 K255 L256 K257 D258 R259
4933.0 H189S3 G4L6 I5A7 S8 G10 I11 A12 F13 G14 K15 A16 L17 L18 L19 K20 E21 D22 E23 I24 V25 I26 D27 R28 K29 K30 I31 S32 A33 D34 Q35 V36 D37 Q38 E39 V40 E41 R42 F43 L44 S45 G46 R47 A48 K49 A50 S51 A52 Q53 L54 E55 T56 I57 K58 T59 K60 A61 G62 E63 T64 F65 G66 E67 E68 K69 E70 A71 I72 F73 E74 G75 H76 I77 M78 L79 L80 E81 D82 E83 E84 L85 E86 Q87 E88 I89 I90 A91 L92 I93 K94 D95 K96 H97 M98 T99 A100 D101 A102 A103 A104 H105 E106 V107 I108 E109 G110 Q111 A112 S113 A114 L115 E116 E117 L118 D119 D120 E121 Y122 L123 K124 E125 R126 A127D129 V130 A128R131 D132 I133 G134 K135 R136 L137 L138 R139 N140 I141 L142 G143 L144 K145 I146 I147 D148 L149 S150 A151 I152 Q153 D154 E155 V156 I157 L158 V159 A160 A161 D162 L163 T164 S166 E167 T168 A169 Q170 L171 N172 L173 K174 K175 V176 L177 G178 F179 I180 T181 D182 A183 G184 G185 S188S191T190 I192 M193 A194 R195 S196 L197 E198 L199 A201 I202 V203 G204 T205 G206 S207 V208 T209 S210 Q211 V212 K213 N214 D215 D216 Y217 L218 I219 L220 D221 A222 V223 N224 N225 Q226 V227 Y228 V229 N230 T232 N233 E234 V235 I236 D237 K238 M239 R240 A241 V242 Q243 E244 Q245 V246 A247 S248 E249 K250 A251 E252 L253 A254 K255 L256 K257 D258 R259