Transkriptionsanalysen im Vergleich:

PCR-basierende Genomchips vs. Oligo-basierende Genomchips

Zur Erstellung des PCR-basierenden Genomchips von B. licheniformis DSM13 wurden 300-500 bp große Fragmente jedes ORFs größer 300 bp amplifiziert. Hierbei gilt es anzumerken, dass 14,1% aller 4286 ORFs von DSM13 kleiner als 300 bp sind und aufgrund einer Mindestgröße der probes von 300 bp deshalb nicht für die

Erstellung des Genomchips berücksichtigt wurden. Somit sind letztendlich 81,5% aller in B. licheniformis DSM13 identifizierter ORFs auf dem PCR-basierenden Genomchip vertreten. Eine detailierte Beschreibung der Generierung von Primern und der Ampflifizierung der probes mittels PCR ist der Dissertation von Birgit Veith zu entnehmen (Veith, 2004). Nach dem Prinzip des Kontaktprintens erfolgte anschließend das Aufbringen der probes auf Aminosilan slides (Amersham Biosciences). Dieses so genannte Spotten erfolgte mit einem Lucidea Spotter (Amersham Biosciences) in Blöcken von Spots, wobei jeder Block zweimal auf den Chip aufgebracht wurde. Für die sich anschließende UV-Immobilisierung wurde der UVC500 UV-Crosslinker (Hoefer, San Francisco) verwendet. Die gespotteten Microarrays werden in einem Exsikkator bei Unterdruck über einem Trocknungsmittel gelagert.

Um Oligo-basierende Genomchips zu erstellen, wurden 5´-Amino-C6 modifizierte Oligonukleotide mit einer Länge von 60 bis 70 Basen von einem MicroGrid II Microarray Spotter (Zinsser Analytic, Frankfurt, Deutschland) auf CodeLink Microarray slides (SurModics, Eden Prairie, USA) gespottet. Das Spotten der 4177 Oligonukleotide erfolgte ebenfalls in Blöcken, wobei auch hier die Spots als Duplikat auf dem Genomchip vorlagen. Um eine einheitliche Hybridisierung sicherzustellen, wurden die Oligonukleotide so gewählt, dass ihre erwartete Schmelztemperatur bei etwa 66°C liegt und sie frei von so genannten Haarnadelstrukturen sind. Ihre Spezifität für das jeweilige target-Gen wurde mittels BLAST-Analyse gegen alle weiteren ORFs von DSM13 überprüft. Nachdem die Oligonukleotide kovalent an die slide-Oberfläche gekuppelt wurden, erfolgte die Immobilisierung durch Ethanolamin. Analog den PCR-basierenden Genomchips werden auch die Oligo-basierenden Genomchips in einem Exsikkator bei Unterdruck über einem Trocknungsmittel gelagert.

Die Umstellung von PCR-basierenden Chips auf sogenannte Oligochips für die Transkriptionsanalysen ging einher mit der Änderung bzw. Optimierung der Markierungs- und Hybridisierungsbedingungen. Im Rahmen der Markierung wurde dem Ansatz nun nicht mehr random nonamere, sondern hexamere zugefügt. Verkürzt werden konnte das Annealing der Primer. Dieses erfolgte nun für 10 min bei 70°C anstelle eines PCR-Laufes. Des Weiteren wurde für die reverse Transkription ein 4/10 dNTP Nukleotid Mix und kein dCTP Nukleotid Mix verwendet. Für die Hybridisierung wurde dem Ansatz nicht mehr der Microarray Hybridization Buffer und

Formamid zugegeben, sondern der Tom Freeman Hybridization Buffer. Weitere Änderungen betrafen die Wasch- und Reinigungschritte der Hybridisierungskammern, ebenso wie die Hybrdisierung selbst. Diese erfolgt nun bei 55°C anstatt 42°C und verlängerte sich auf 15 Stunden (vgl. 3.8.).

Zunächst soll nun auf die Reproduzierbarkeit der durch Oligo-basierende DNA-Microarrays ermittelten Expressionsverhältnisse eingegangen werden. Hierzu wurde RNA aus B. licheniformis Zellen gewonnen, dessen Kultivierung zum einen in einem definierten Medium mit equimolarer Zugabe (10mM) der sieben proteinogenen Aminosäuren L-Alanin, L-Arginin, L-Asparagin, L-Aspartat, L-Glutamin, L-Glutamat und L-Prolin erfolgte und zum anderen in einem definierten Medium mit 50 mM Xylose als Kohlenstoffquelle. In einer ersten Markierungsreaktion wurde die RNA der Aminosäure gewachsenen Zellen mit dem Farbstoff Cy5 markiert und die Xylose gewachsenen Zellen mit dem Farbstoff Cy3. Die daraus ermittelten Daten für Gene, welche mit der Verwertung von Aminosäuren im Zusammenhang stehen, sind in der ersten Spalte der log Expressionsverhältnisse der Tabelle 4.31 dargestellt. Für die zwei darauf folgenden Markierungsreaktionen, dessen Werte in Spalte zwei und drei dieser Tabelle dargestellt sind, erfolgte eine Umkehrung der Farbmarkierung, ein sogenannter dye-flip. Der Verständlichkeit halber sind die hieraus gewonnenen Expressionsverhältnisse als reziproke Werte dargestellt. Neben dem Gen der L-Alanin-Dehydrogenase (ald, BLi03382) und dem ORF BLi04275, welcher für ein Homolog der L-Alanin-Dehydrogenase kodiert, konnte in den Experimenten ebenfalls eine signifikant erhöhte Expression für die Gene, die im Zusammenhang mit der Verwertung von L-Arginin und L-Prolin stehen, verzeichnet werden. Namentlich sind dieses ycgMN, rocD und rocF. Anzumerken ist allerdings, dass für letzteres kein Wert im dritten Experiment ermittelt werden konnte. Für das Gen ybgJ (BLi00274), dessen Produkt Ähnlichkeit zur Glutaminase aufweist, konnte in allen drei Experimenten eine mehr als vierfache Änderung des logarithmierten Expressionsverhältnisses beobachtet werden.

Auf der anderen Seite konnte unter den gewählten Versuchsbedingungen keine erhöhte Expression beim Wachstum mit Aminosäuren für die ORFs BLi04139 und BLi04140 ermittelt werden. Beide ORFs, welche die Umsetzung von L-Asparagin zu Fumarat katalysieren, sind unter diesen Kultivierungsbedingungen reprimiert. Analysen des Kulturüberstandes vergleichbarer Wachstumsexperimente von DSM13 ergaben, dass zum Zeitpunkt der Ernte für die Transkriptionsanalysen kein L-Asparagin mehr im

Medium vorhanden war (Daten nicht gezeigt). Im Genom konnten vier ORFs identifiziert werden, dessen Produkt Ähnlichkeit zur Aspartat-Aminotransferase aufweist. Dieses Enzym ist in der Verwertung von L-Glutamat involviert. Nur für den ORF BLi01514 konnte beim Wachstum mit einem Gemisch von Aminosäuren eine erhöhte Expression ermittelt werden.

Tabelle 4.31: Expressionsverhältnisse von Genen, welche mit der Verwertung von Aminosäuren im Zusammenhang stehen. Werte größer 1 bedeuten eine verstärkte Expression beim Wachstum mit einem Gemisch von Aminosäuren, Werte kleiner -1 eine verstärkte Expression unter der Referenzbedingung.

Die Tabelle enthält repräsentative Einzelmessungen. AS-Mix - equimolarer (10 mM) Aminosäuremix;

n.b. - nicht bestimmt.

ID Gen Annotation log Expressionsverhältnisse

AS-Mix / BLi00373 ycgM ähnlich zur Prolin-Oxidase 5,70 6,11 5,92 BLi00374 ycgN ähnlich zur Δ¹

-Pyrrolin-5-Carboxylat-Dehydrogenase

5,31 5,68 5,64

BLi00422 rocD Ornithin-Aminotransferase 4,78 4,72 4,64

BLi00424 rocF Arginase 4,18 3,74 n.b.

BLi01514 ykrV ähnlich zur Aspartat-Aminotransferase

1,79 1,52 1,63

BLi02372 aspB Aspartat-Aminotransferase -0,21 -0,39 -0,41 BLi03382 ald L-Alanin-Dehydrogenase 6,79 6,01 6,06 BLi03434 yurG ähnlich zur

Aspartat-Aminotransferase

0,23 0,08 0,09

BLi04139 homolog zur AnsB Aspartase -1,73 -1,69 -2,11

BLi04140 ansA Asparaginase -2,60 -2,25 -2,41

BLi04237 ywfG ähnlich zur Aspartat-Aminotransferase

-0,82 -0,40 -0,49 BLi04275 homolog zur Ald

Alanin-Dehydrogenase

8,06 7,64 7,97

Tabelle 4.32: Vergleichende Darstellung von Expressionverhältnissen. Übersicht der Gene des Gluconat-Operons, ermittelt durch DNA-Microarray-Technologie unter Verwendung von PCR-basierenden bzw. Oligo-PCR-basierenden Chips. Werte größer 1 bedeuten eine verstärkte Expression beim Wachstum mit Gluconat, Werte kleiner -1 eine verstärkte Expression unter der Referenzbedingung.

n.b. - nicht bestimmt

ID Gen Annotation log Expressionsverhältnisse

Gluconat / BLi04286 gntR transkriptionaler Repressor des

Gluconat-Operons

2,91 2,72

BLi04287 gntK Gluconat-Kinase 3,09 2,35

BLi04288 gntP Gluconat-Permease 3,25 2,27

BLi04289 gntZ

6-Phosphogluconat-Dehydrogenase, decarboxylierend

n.b. 2,65

1) Veith, 2004

2) repräsentative Einzelmessungen

Im Folgenden soll nun auf die Reproduziebarkeit von Transkriptionsanalysen mit PCR-basierenden DNA-Microarrays durch Oligo-basierende DNA-Microarrays eingegangen werden. Hierzu wurden exemplarisch die Expressionsverhältnisse der Gene des Gluconat-Operons vergleichend dargestellt (Tab. 4.32). Sowohl für das Gen des transkriptionalen Repressors des Gluconat-Operons, gntR, als auch für die angrenzenden Gene gntK und gntP konnten die mittels PCR-basierenden DNA-Microarrays ermittelten Werte durch die Transkriptionsanalysen, in denen Oligo-basierende DNA-Microarrays verwendet wurden, verifiziert werden. Für alle genannten Gene konnte eine mehr als zweifache, in zwei Fällen sogar mehr als dreifache, Erhöhung des logarithmierten Expressionsverhältnisses beobachten werden. Im Zusammenhang mit den Untersuchungen zum Gluconat-Operon lagen jedoch keine Daten der PCR-basierenden DNA-Microarrays zum Gen der 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase, gntZ, vor. Aufgrund der ermittelten Werte der bereits beschriebenen Gene, kann für gntZ ein ähnliches Expressionsverhältnis angenommen werden. Diese Vermutung konnte durch die Transkriptionsanalysen der Oligo-basierenden DNA-Microarrays bekräftigt werden. Für letztere wurde RNA aus B. licheniformis Zellen gewonnen, welche in einem definierten Medium mit 50 mM Gluconat als

Kohlenstoffquelle in batch kultiviert wurden bzw. wie unter 3.3.5. beschrieben, als Referenzbedigung in kontinuierlicher Kultur.